CN103383397B - 脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球及其应用，所公开的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体而得到的；所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的制备方法包括：利用高碘酸钠的PBS溶液对脂环酸芽孢杆菌特异性抗体进行氧化处理，之后收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。利用上述公开的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球可对果汁尤其是苹果汁中的脂环酸芽孢杆菌进行有效分离。
Description
技术领域
本发明属于食品微生物检测技术领域，具体涉及脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球及其应用。
背景技术
脂环酸芽孢杆菌，俗称嗜酸耐热菌，属于革兰氏阳性芽孢杆菌，杆状、产芽孢、严格需氧，可以在 pH 2.5～6.0，20～60 ℃广泛温度范围内存活和生长，是苹果及其他果汁中常见的污染菌。由于其具有耐热、耐酸的特性，普通的巴氏杀菌难以将其杀灭。该菌在浓缩果汁中不繁殖，但浓缩果汁稀释成低浓度果汁时，即可代谢产生具有不愉快风味的物质——愈创木酚和2,6-二溴苯酚，使果汁口感、风味变差，形成白色沉淀或雾状浑浊，使苹果汁品质下降。因此，浓缩苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的快速检测及控制技术已成为食品工业研究的热点。
目前，对于苹果汁中脂环酸芽孢杆菌的控制技术，研究较多的有高温杀灭，欧姆加热法，脉冲电场杀菌，紫外线照射，辐照，超声波及超高压杀灭等。在浓缩苹果汁工业化生产过程中对于脂环酸芽孢杆菌的控制，主要是高温瞬时灭菌和膜过滤。高温处理会对果汁的风味产生一定的影响，而膜过滤方法由于成本高，且使用一定时间后过滤效果下降，需要根据过滤效果周期性的更换滤膜，导致了生产成本的增加。
发明内容
本发明的目的之一是提供脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，以实现食品中脂环酸芽孢杆菌的快速分离。
为此，本发明提供的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球是用胺基化磁性微球包被氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体而得到的；所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的制备方法包括：利用含高碘酸钠的PBS缓冲液对脂环酸芽孢杆菌特异性抗体进行氧化处理，之后收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。
采用Sephadex G-25层析柱收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。
所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体制备方法还包括：
所述含高碘酸钠的PBS缓冲液中高碘酸钠浓度为10 mg/mL， PBS缓冲液的浓度为0.1 mol/L、pH值为7.4；
所述脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为（1 -3mg）/mL；所述含高碘酸钠的PBS缓冲液与脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的体积比为（1-3）：1。
所述胺基化磁性微球的制备方法包括：
（1）80-90 ℃条件下，Fe3O4磁核在硅酸钠溶液中进行硅烷化反应制备硅烷化磁性微球；所述硅酸钠溶液的质量浓度为4%-5%、PH大于11；
（2）调节硅烷化磁性微球的PH呈中性；
（3） 80-90 ℃条件下，将PH呈中性的硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去离子水和甘油混合反应制备胺基化磁性微球；所述硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去离子水和甘油的用量为：
硅烷化磁性微球： （1-2g）/毫升
甲醇： 150体积，
3-氨丙基三乙氧基硅烷： 10体积，
去离子水： 1体积，
甘油： 150-161体积。
所述的Fe3O4磁核的粒径为15-25 nm、磁性的饱和磁化强度为在（40-80 emu）/g 。
所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为（1 -2 mg）/毫升 ，且每毫升氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体用20mg 的胺基化磁性微球包被。
进一步地，利用封闭液封闭所述的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，所述封闭液的组分量为：每100ml PBS中含有1-10克 BSA和0.05 ml Tween-20 。
本发明提供脂环酸芽孢杆菌的免疫磁微球优点在于：
（1）本发明中的胺基化磁性微球具有特异性结合位点，可以实现对抗体的高效及特异性固定化，有效保留了抗体-抗原反应结合位点。
（2）本发明的脂环酸芽孢杆菌特异性抗体氧化处理方法中抗体的Fc区域的糖链羟基部分被氧化为醛基，且保留了抗体的识别位点；处理后的抗体可与磁性微球的胺基部分高效结合，并保留了抗体的Fab活性区域，保证对目标菌体的有效识别和分离。
（3）本发明的制备方法中抗体有效结合到磁性微球表面，并保留了对脂环酸芽孢杆菌高度特异性分离和富集特性。尤其是经封闭处理后的免疫磁性微球可实现脂环酸芽孢杆菌的有效分离。
（4）采用本发明的胺基化磁性微球的制备方法制备的胺基化磁性微球的粒径为45-55 nm、磁性的饱和磁化强为（40-60 emu）/g。
本发明的另一目的是将上述脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球用于分离果汁中的脂环酸芽孢杆菌的应用。
所述的果汁中的可溶性固形物含量≤15°Brix。
利用本发明的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球分离果汁中的脂环酸芽孢杆菌时，无需特殊试剂和样品前处理，即可实现检测样品中目标菌体的分离和富集，且速度快、成本低、效果好。
附图说明
图1为磁性微球的APTES 胺基化改性及制备图；
图2为免疫磁性微球的制备流程图；
图3为不同浓度BSA 封闭对免疫磁性微球特异性吸附影响（以Fe3O4 磁核吸附抗体获得的免疫磁珠为对照），该图的横坐标为：封闭液中BSA的质量浓度，纵坐标为菌体分离率；
图4为不同浓度脂环酸芽孢杆菌标准菌株免疫磁分离效果图，该图的横坐标为菌体浓度，纵坐标为菌体分离率。
具体实施方式
利用免疫磁性微球对食品中相应菌体分离与富集的原理是在分离过程中，特异性抗体与目标抗原结合形成抗原-微球复合物，在磁力作用下，该复合物发生力学移动，从而达到抗原分离与富集的目的。
结合图1和图2，本发明对脂环酸芽孢杆菌特异性抗体进行氧化处理，将抗体可结晶段（Fc区域）糖链部分转化成醛基，并以APTES胺基化处理的磁性微球为载体，实现了脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的定向固定化。通过这种方式，可以使抗体与磁性微球的结合位点远离抗原结合区，从而最大程度保留了抗体的活性位点。
本发明使用的脂环酸芽孢杆菌特异性抗体为文献 Zhouli Wang, Tianli Yue, Yahong Yuan, et al. Development of Polyclonal Antibody-Based Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Alicyclobacillus Strains in Apple Juice. Journal of food science, 2012, 77: M643-M649中公开的脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。具体是将脂环酸芽孢杆菌标准菌株活化，摇瓶培养，取培养18~24h的新鲜菌液，充分、离心后倒掉上清液，加入适量生理盐水，使菌体重新悬浮，最后调整菌液浓度为108CFU/mL -109CFU/mL，灭活，得到免疫原。对免疫原乳化后按照多点注射法对兔子进行免疫，以7天为周期，采血，用ELISA 测定获得血清的效价。待抗体效价达到要求后，采血、纯化、分装，最终获得脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。
本发明中所述及的抗体均指的是脂环酸芽孢杆菌特异性抗体。
以下是发明人提供的实施例及相关效果试验，以对本发明的技术方案作进一步解释说明。
以下实施例中所用的菌株及试剂：
Alicyclobacillus acidoterrestris (DSM-3922)、Alicyclobacillus acidoterrestris (DSM-2498)、Alicyclobacillus pomorum (DSM-14955)、 Alicyclobacillus fastidiosus (DSM-17978)和Alicyclobacillusacidiphilus (DSM-14558) 购于德国微生物菌种保藏中心；Saccharomyces cerevisiae(CICC-1027)、Bacillus subtilis (CICC-10034)、Enterobacter cloacae (CICC-10017) 购于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
质量浓度为36.5%的盐酸。
以下实施例中采用投射电镜扫描检测Fe3O4磁核或胺基化磁性微球的粒径；采用振动试样磁力计测定Fe3O4磁核或胺基化磁性微球的磁性的饱和磁化强度。
实施例1：
（1）磁性微球的硅烷化反应
将9.5 g硅酸钠溶解于200 mL 去离子水中并用盐酸调整pH值为12-13，向硅酸钠溶液中加入5 g Fe3O4磁核超声处理30 min，在80-90 ℃水浴条件下用盐酸调整反应体系pH值为6-7，磁性分离获得微球并水洗得pH呈中性的硅烷化磁性微球；
（2）磁性微球的胺基化改性
2克硅烷化磁性微球悬浮液、1 mL 去离子水和10 mL APTES 加入150 mL 甲醇中，超声处理30 min 后加入150 mL 甘油，85-90 ℃充分反应3 h，磁性分离获得微球，并用甲醇和去离子水分别洗涤三次，冷冻干燥，获得胺基化磁性微球，并且经检测得该胺基化磁性微球的粒径为45-55 nm、磁性的饱和磁化强为46.82 emu/g；
（3）脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的氧化处理
将1 mL 浓度为2 mg/mL的脂环酸芽孢杆菌特异性抗体溶液加入2 ml 含有20 mg高碘酸钠的PBS 缓冲液中（PBS的浓度为0.1 mol/L，pH值7.4），37 ℃条件下反应30 min；氧化反应结束后，采用Sephadex G-25层析柱过滤、除盐并分离得到氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体，液体流速为0.5 mL/min；
（4）脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球的制备：
将制备获得的2 mg胺基化磁性微球与100 μL浓度为2 mg/mL的氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体于37 ℃条件下120-180 rpm搅拌反应30 min，磁性分离并洗涤，得到包被抗体的免疫磁性微球。
实施例2：
该实施例与实施例1不同之处在于，该实施例中所用的Fe3O4磁核是采用下述方法制备的：
将3.4 g 的FeCl3·6H2O与1.2g的FeCl2·4H2O加入到800 mL去离子水中，并加入4g PEG-4000，在氮气保护下充分搅拌溶解，逐滴加入氨水溶液使反应体系pH大于10；之后反应体系在75-85 ℃水浴中充分熟化 20-40 min，磁性分离获得微球并水洗获得Fe3O4磁核；经检测得该Fe3O4磁核粒径为15-25 nm、磁性的饱和磁化强度为72.18 emu/g。
实施例3：
该实施例与实施例1不同之处在于：该实施例的免疫磁性微球经封闭液封闭处理：以每100ml PBS中含有5g BSA和0.05 ml Tween-20的混合体系为封闭液，加入吸附抗体的免疫磁性微球于37 ℃条件下作用60min，然后磁性分离并充分洗涤后得到封闭处理后的免疫磁性微球。
一、利用实施例3制备的免疫磁性微球对脂环酸芽孢杆菌进行分离：
具体操作步骤为：配制表1中所示的浓度梯度样品各10 mL，每个样品中加入20 mg免疫磁性微球进行目标菌体的分离去除：120-180 rpm、反应吸附时间60 min；磁性分离吸附菌体的免疫磁性微珠，无菌水洗涤免疫磁性微珠并悬浮于200 μL PBS 缓冲液中，采用涂布法计算分离前后菌体浓度变化，评价菌体分离效果。结果如表1所示：
表 1
| 菌体浓度（CFU/mL） | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 |
| 菌体分离率（%） | 98.98 | 96.81 | 81.37 | 68.79 | 35.38 |
试验结果：结合图4，当细菌的浓度小于104 CFU/mL时，微球对细菌的吸附率大于95％；当脂环酸芽孢杆菌的浓度为104 CFU/mL，微球对细菌的吸附率大于80％；继续增大细菌浓度（超过104 CFU/mL）时，吸附率呈现下降趋势。
二、利用实施例3中制备的免疫磁性微球分离不同来源细菌，研究免疫磁性微球对菌体分离的特异性：
具体操作步骤为：将脂环酸芽孢杆菌标准菌株（DSM 3922、DSM 2498、DSM 14955、DSM 17978、DSM14558）与非脂环酸芽孢杆菌标准菌株（CICC 1027、CICC 10034、CICC 10017）培养液分别加入到稀释后的苹果汁样品中（15 °Brix），最终样品中菌体浓度约为104 CFU/mL。将5mg的免疫磁性微球加入到2mL果汁样品中，吸附反应60min，然后进行菌体分离，洗涤。将吸附菌体的微球重新悬浮于200 μL PBS 缓冲液中，采用涂布法计算分离前后菌体浓度变化，评价菌体分离效果。结果如表2所示：
表2
| 菌株编号 | DSM 3922 | DSM 2498 | DSM 14955 | DSM 17978 | DSM 14558 | CICC 1027 | CICC 10034 | CICC 10017 |
| 菌体分离率（%） | 82.39 | 87.63 | 85.42 | 80.79 | 85.58 | 9.76 | 6.08 | 8.35 |
表2所示结果表明，获得的免疫磁性微球对脂环酸芽孢杆菌有非常好的特异性，对脂环酸芽孢杆菌的分离率达到80%以上；而对其余三个菌株培养液（CICC-1027、CICC-10034、CICC-10017）分离效果较差，菌体分离率不足10%，说明该实施例制备的免疫磁性微球对脂环酸芽孢杆菌有好的特异性。
三、利用实施例3中制备的免疫磁性微球对不同可溶性固形物浓度的苹果果汁样品中菌体进行免疫分离：
具体操作步骤为：将浓缩苹果汁（68 °Brix）梯度稀释，可溶性固形物分别为5，10，15，20 °Brix，并加入一定量培养好的脂环酸芽孢杆菌标准菌株培养液，最终样品中菌体浓度约为104 CFU/mL。然后将免疫磁性微球加入到各加标果汁样品中（2.5g/L），按照前述条件进行菌体分离，洗涤。将吸附菌体的微球重新悬浮于200μL PBS 缓冲液中，采用涂布法计算分离前后菌体浓度变化。结果如表3所示：
表3
| 可溶性固形物含量 （°Brix） | 5 | 10 | 15 | 20 |
| 菌体分离率（%） | 85.43 | 87.86 | 83.17 | 不能分离 |
表3所示结果表明，当果汁的可溶性固形物≤15 °Brix时，免疫磁性微球对菌体分离效果好，没有显著影响；当可溶性固形物含量为20°Brix时，由于果汁黏度太多，磁性微球在果汁体系中不能有效分离，因而对菌体分离效果差。
实施例4：
该实施例与实施例3不同之处在于，以每100ml PBS中含有1g BSA和0.05 ml Tween-20的混合体系为封闭液。
实施例5：
该实施例与实施例3不同之处在于，以每100ml PBS中含有10g BSA和0.05 ml Tween-20的混合体系为封闭液。
以下是发明人提供的 关于磁性微球胺基化、脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的氧化处理、封闭处理对脂环酸芽孢杆菌免疫磁性微球吸附性能的影响试验研究。
试验方法：
（1）以氧化处理前后的抗体分别与Fe3O4 磁核、胺基化磁性微球反应，制备获得不同试验样品，分别为：
氧化前抗体与Fe3O4 磁核反应制备的试验样品标记为IMPs 1；
氧化前抗体与胺基化磁性微球反应制备的试验样品标记为IMPs 2；
氧化后抗体与Fe3O4 磁核反应制备的试验样品标记为IMPs 3；
氧化后抗体与胺基化微球反应制备的免疫磁性微球标记为IMPs 4；
利用IMPs 1、 IMPs 2 、IMPs 3、 IMPs 4各试验样品对菌体浓度为104CFU/mL脂环酸芽孢杆菌（DSM 3922）培养液中的脂环酸芽孢杆菌进行吸附分离，之后采用涂布法计算各样品分离前后菌体浓度变化，并计算各试验样品对脂环酸芽孢杆菌的吸附率。试验结果如表1所示。
该实验中所用Fe3O4 磁核为实施例2制备的Fe3O4 磁核；胺基化磁性微球和氧化抗体为实施例1制备。
（2）利用实施例1、3、4、5制备的免疫磁性微球对菌体浓度为104CFU/mL脂环酸芽孢杆菌（DSM 3922）培养液中的脂环酸芽孢杆菌进行吸附分离，之后采用涂布法计算各样品分离前后菌体浓度变化，并计算各试验样品对脂环酸芽孢杆菌的吸附率。试验结果如表1所示。
（3）利用实施例3中所用封闭液，对IMPs 1、 IMPs 2 、IMPs 3、 IMPs 4各试验样品进行封闭处理，得到相应的试验样品，之后进行菌体（DSM 3922）分离处理并计算各试验样品对脂环酸芽孢杆菌的吸附率。试验结果如表4所示。
表4
| 微球类型 | IMPs 1 | IMPs 2 | IMPs 3 | IMPs 4 |
| 封闭前菌体吸附率 | 32.96 % | 51.62% | 47.18% | 86.38% |
| 封闭后菌体吸附率 | 18.92% | 37.29% | 23.61% | 80.07% |
| 非特异性吸附率 | 14.04% | 14.33% | 23.57% | 6.31% |
表4中的非特异性吸附率指的是相应磁性微球封闭处理前对菌体的吸附率与封闭后菌体吸附率的差值。
试验结果：研究结果表明，抗体氧化处理后与胺基化磁性微球反应，制备的免疫磁性微球对菌体的吸附率最高；封闭液中BSA含量对菌体的非特异性吸附有显著影响。
（1）抗体氧化前后与胺基化磁性微球反应，制备的免疫磁性微球对菌体的有效吸附率分别为37.29% 和80.07%，说明抗体氧化对菌体吸附有重要影响。氧化后抗体与胺基化磁性微球反应过程中，保留了抗体的活性位点，因此有利用菌体的吸附。
（2）Fe3O4 磁核与氧化后抗体反应制备的免疫磁性微球对菌体的有效吸附率为23.61%，而胺基化磁性微球与氧化后抗体反应制备的免疫磁性微球对菌体的有效吸附率为80.07%。
（3）当封闭液中BSA 浓度由1%增大到5%时，免疫磁性微球对菌体的非特异性吸附明显减小。封闭液中BSA 质量浓度为5%时，Fe3O4 磁核和胺基化微球制备的免疫微球的非特异性吸附率为6.31% 和23.57%；参考图3，随着BSA浓度继续增大到10%时，封闭效果变化不明显。
实施例6：
该实施例与实施例2不同之处在于：将5 mg胺基化磁性微球与250μL浓度为0.4 mg/mL的氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体于37 ℃条件下搅拌反应60 min （150 rpm），磁性分离并洗涤，得到包被抗体的免疫磁性微球。
实施例7：
该实施例与实施例6不同之处在于：氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为0.8 mg/mL。
实施例8：
该实施例与实施例6不同之处在于：氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为1.2 mg/mL。
实施例9：
该实施例与实施例6不同之处在于：氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为1.6 mg/mL。
实施例10：
该实施例与实施例6不同之处在于：氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为2.0 mg/mL。
分别采用BCA 试剂盒法测定实施例6至10固定化前后抗体浓度。结果如表5所示：
表5
| 实施例 | 实施例6 | 实施例7 | 实施例8 | 实施例9 | 实施例10 |
| 抗体初始浓度（mg/mL） | 0.4 | 0.8 | 1.2 | 1.6 | 2 |
| 抗体固定化量（μg/mg） | 19.48 | 38.76 | 58.65 | 71.86 | 75.6 |
表5所示结果表明：随着抗体初始浓度的增大，胺基化磁性微球对抗体固定化量增加。在初始浓度为2.0 mg/mL 时，吸附率为75.6 μg/mg。
实施例11：
该实施例中利用实施例3制备的免疫磁性微球对苹果汁样品中的脂环酸芽孢杆菌进行分离，菌体浓度为102 CFU/mL、苹果汁的可溶性固定物含量为15 °Brix。
实施例12：
该实施例与实施例11不同之处在于：苹果汁样品中脂环酸芽孢杆菌的菌体浓度为103 CFU/mL。
实施例13：
该实施例与实施例11不同之处在于：苹果汁样品中脂环酸芽孢杆菌的菌体浓度为104 CFU/mL。
实施例14：
该实施例与实施例11不同之处在于：苹果汁样品中脂环酸芽孢杆菌的菌体浓度为105 CFU/mL。
实施例15：
该实施例与实施例11不同之处在于：苹果汁样品中脂环酸芽孢杆菌的菌体浓度为106 CFU/mL。
对实施例11至实施例15中吸附菌体的免疫磁性微球进行磁性分离（每个样品准确移取2mL，并加入5mg免疫磁性微球，吸附反应60min）、洗涤，并将微球重新悬浮于200μL PBS 缓冲液中；采用涂布法计算磁性分离前后菌体浓度变化。结果如表6所示：
表6
| 实施例 | 实施例11 | 实施例12 | 实施例13 | 实施例14 | 实施例15 |
| 菌体浓度（CFU/mL） | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 |
| 菌体分离率（%） | 96.58 | 97.32 | 82.96 | 71.76 | 38.63 |
对比实施例11-实施例 的分离效果：对浓度小于104 CFU/mL的菌体样品，免疫磁性微球对其分离率大于95%；当样品中菌体浓度为104 CFU/mL时，免疫磁性微球对其分离率大于80%；继续增加菌体浓度，免疫磁性微球对目标菌体的分离比例下降，但是分离获得的菌体总量是增加的。
一般来说，苹果汁样品中自然污染的脂环酸芽孢杆菌的浓度远低于104 CFU/mL，因此，本发明的免疫磁性分离方法可以用于苹果汁样品中脂环酸芽孢杆菌的分离。
Claims (2)
1.脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球的制备方法，其特征在于，
用胺基化磁性微球包被氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体得到脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球；
所述胺基化磁性微球的制备方法包括：
（1）80-90 ℃条件下，Fe3O4磁核在硅酸钠溶液中进行硅烷化反应制备硅烷化磁性微球；所述硅酸钠溶液的质量浓度为4%-5%、PH大于11；所述的Fe3O4磁核的粒径为15-25 nm、磁性的饱和磁化强度为40-80 emu/g ；
（2）调节硅烷化磁性微球的PH呈中性；
（3） 80-90 ℃条件下，将PH呈中性的硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去离子水和甘油混合反应制备胺基化磁性微球；所述硅烷化磁性微球、甲醇、3-氨丙基三乙氧基硅烷、去离子水和甘油的用量为：
硅烷化磁性微球： 1-2g/毫升
甲醇： 150体积，
3-氨丙基三乙氧基硅烷： 10体积，
去离子水： 1体积，
甘油： 150-161体积；
所述的胺基化磁性微球的粒径为45-55 nm、磁性的饱和磁化强为40-60 emu/g；
所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的制备方法包括：利用含高碘酸钠的PBS缓冲液对脂环酸芽孢杆菌特异性抗体进行氧化处理，之后采用Sephadex G-25层析柱收集获得氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体；
所述含高碘酸钠的PBS缓冲液中高碘酸钠浓度为10 mg/mL， PBS缓冲液的浓度为0.1 mol/L、pH值为7.4；
所述脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为1 -3mg/mL；所述含高碘酸钠的PBS缓冲液与脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的体积比为1-3：1；
所述氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体的浓度为1 -2 mg/毫升 ，且每毫升氧化脂环酸芽孢杆菌特异性抗体用20mg 的胺基化磁性微球包被；
利用封闭液封闭所述的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球，所述封闭液的组分量为：每100ml浓度为0.01 mol/L 的 PBS缓冲液中含有1-10克 BSA和0.05 ml Tween-20 。
2.如权利要求1所述的脂环酸芽孢杆菌的免疫磁性微球用于分离果汁中的脂环酸芽孢杆菌的应用，所述果汁的可溶性固形物含量≤15 °Brix。
Priority Applications (1)
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Non-Patent Citations (4)
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| Development and evaluation of an immunomagnetic separation-ELISA for the detection of Alicyclobacillus spp. in apple juice.;Zhouli Wang等;《International Journal of Food Microbiology》;20130620;第166卷;第29页左侧栏倒数第1段-右侧栏第1段，第30页右侧栏倒数第20行，图1 * |
| Improving immunobinding using oriented immobilization of an oxidized antibody.;Jung Hye Kang等;《Journal of Chromatography A》;20070513;第1161卷;摘要，图1 * |
| Preparation and characterization of amino-silane modified superparamagnetic silica nanospheres.;Xianqiao Liu等;《Journal of Magnetism and Magnetic Materials》;20041231;第270卷;第2－3页"实验"部分 * |
| 苹果汁中嗜酸耐热菌免疫分离及振动光谱法鉴定;王军;《中国博士学位论文全文数据库》;20120615(第2012年06期);第30－31页，第2.2.2.5节，第2.2.2.6节，图2－2 * |
Cited By (1)
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