JPS59141067A - 汚染された生物学的媒質中の病原性微生物の免疫細菌学的検出方法 - Google Patents

汚染された生物学的媒質中の病原性微生物の免疫細菌学的検出方法

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JPS59141067A
JPS59141067A JP58233453A JP23345383A JPS59141067A JP S59141067 A JPS59141067 A JP S59141067A JP 58233453 A JP58233453 A JP 58233453A JP 23345383 A JP23345383 A JP 23345383A JP S59141067 A JPS59141067 A JP S59141067A
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serum
microorganisms
beads
pathogenic
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ユ−ストラ−ト・アブラメア
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ルネ・ニコラ
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Institut Pasteur de Lille
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、汚染された生物学的媒質 （ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ　　ｂｉｏｌｏｇｉＣａｌ
　　ｍｅｄｉａ　）中に存在し、例えばアジセンス　ナ
ショナル　ド　ヴア。
リザシオン　ド　ラ　ルシエルシュ（以下、ＡＮＶＡＲ
という）の仏国特許Ａ７３１０３７３４に足腺されてい
る分画１　＋　２　（ｆｒｅｔ（ｌｉｏｎ　Ｉ＋２）　
　の様な特異的抗原決定基（ａｎｌｉｑｔｎｉｔ　ｄｅ
ｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ　）を有する病原性微生物（ｐａ
ｔｈａｙｅｎｉｔ　ｙｔｒｐｎｓ　）の新規免疫細菌学
的（ｉｍｍｕｎｏｂａｃｔｅｒｉａｌｏｇｉｃａｌ　）
検出方法に関する。特に、汚染された生物学的媒質、詳
しくは大便、血液、尿、水及びすべての種類の排出物に
存在する分画１＋２を有する病原性微生物、例えばじプ
リオ　コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ　ｃｈｏｌｅｒａす、リル
七ネラ　チフイムリウム（Ｓａｌｍｏｎｔｌｌａｇｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ）　、？　Ｌ／オマイセス？Ｌ／イ（Ｍ
ａｌｌｔｏｍｙｔｔｓ　　ｍａｌｌｔｉ　）又は”ｉｌ
−ド七ナスシュードマレイ（Ｐｌｔｕｄｏｍａｎａｘ　
ｐｔｔｕｄｔｐｍａｌｌｔｉ　）の免疫細菌学的検出方
法に関する。
「抗原決定基」という表現は、病原性微生物に由来し、
且つ該病原性微生物を認識できるポリスペシフィック又
はｔツクＯナール抗体を誘起し得る分画のいずれをも意
眩する。
従来技術 抗原分画１＋２は、１９７３年２月２日に出願されたＡ
ＮＶＡＲの仏国特許屋７３１０３７７４並びにその第１
及び第２の追加特許である１９７４年３月１日出願のＡ
　７４１０６９８３及び１９７７年４月２２日出願のＡ
７７／１２１５２により知られている。
更に、パスツール研究所名義の仏国特許Ａ７５／３６８
８９は、免疫酵素学的定量法 （ｉｍｍｓｔｎｏｔｎｓｙｍａｔｉｔ　　ｄｅｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｏｎｓ　）に使用できるマグネティックゲル
を開示している。該ゲルは、磁性粒子を含有する袈アク
リルア三ド／アガ０−スケルと例えばタルタールアルデ
しドの様なカツプリング剤を介して結合した抗原又は抗
体の様なタンパクとから成る。抗原又は抗体が結合した
このタイプのゲルは、生物学的液体 （ハｏｌｔｙｙｉｃａｌ　　１ｉｑｕｉｄ　）中に存在
し−ｒいる相当する抗体又は抗原の免疫酵素学的定量法
として使用されている。即ち、このゲルを生物学的液体
とイン＋ユベートし、数回洗浄し、磁場を利用して分離
し、次いで通常免疫酵素学的定量法で使用される醇素、
例えばタルコースオ士シダーせ又はパーオ＋シダーぜで
標誠された抗体又は抗原とイシ＋ユベートし、光学喝度
（０ｐｌｉｔａｌ　　ｄｅｎｓｉｔｙ　）を読み取るこ
とによシゲルの酵素活性を測定して抗原又は抗体が定量
される。
パスツール研究所及びＡＮＶＡＲ名義の仏画特許Ａ７９
／２＋３４３は、生物学的タシノ＼り分子、例えば抗原
、抗体、酵素、じ−ルス、細胞等を、磁性芳香族ビニル
ポリマー粒子に吸着により固定し、適当な緩衝液中、上
記磁性ポリマーのビーズと生物学的分子を３７°Ｃで１
時間次いで４°Ｃで１晩、単に接触させる方法を提案し
ている。
更に、１９８１年ｌＯ月８日に出願されたパスツール研
究所及びサンドル　ナシオナル　ド　ラルシエルシュ　
シアシテイフイク（Ｃ０Ｎ、　ＲｏＳ、）名義の仏画特
許Ａ　８１　／　Ｉ　８９８５は、液体特に供給水（ｓ
ｔｔ戸戸１ｙ　　ｗｈａｌｅｒ）中の病原性微生物を免
疫吸着剤（ｉｍｍｕｎｔｙａｄｓｔｙｒｂｔｎｔ　）上
へのｐ過によシ検出する方法を提案している。該吸着剤
は、不溶性支持体より詳しくは不溶性ポリマー、例えば
ゲル特にポリアクリルア三ド及び／又はアガロースのゲ
ルに、液体中に存在する検出すべき病原性微生物に対し
て特異的な抗体を、化学結合によシ固定したものである
。該抗体としては、特にじラリオ　コレラの分画Ｃｈｌ
＋２　　を抑制する抗体、リルｔネラ　チフムイリウム
を抑制する抗体、ｌ型及び■型ポリオ三エリテイス　じ
−ルス（Ｔｙｐｅｌ　ａｎｄ　ｌ　Ｐｔｒｌｉｏｍｙｔ
ｔｉｔｉｓ　　ｖｉｒｕｓ　　）を抑制する抗体、ニジ
エリしアコリ（ＥｓｔＡｔｒｉｃｈｉａ　ｔｏｌｉ　　
）を抑制する抗体、脳を酌炎ビールス （ｔｎｃｔｌｒｈａｌｔｒｍｙｏｔａｒｄｉｔｉｓ　　
ｖｉｒｕｓ　）を抑制する抗体がある。上記洲過後、免
疫吸着剤上に保持された抗原因子（ａｎｔｉｑｔｎｉｃ
　　１ａｔｔｅｒｓ　　ンの特徴付け（ｃｈａｒａｃｔ
ｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　）を行なう。この特徴付けは、
常法例えばゲルを希釈し選択液体培地を用いて寒天上で
培養する方法、生化学的及び血清学的に微生物を特徴付
ける方法〔凝集反応 （ａｙｙｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ　）　　）等により行な
う。
発明の要約 本発明の目的は、抗体が固定されたマグネティックゲル
のビーズ上へ病原性微生物を、汚染された生物学的媒質
から直接単離することにある。該微生物は、当初には生
物学的媒質中に低濃度で存在するのに対して、上記ビー
ズにより、量的に非常に高濃度に濃縮される。これによ
シ、病気の診断のみならす＋ＰｖＰ−中に少量存在する
病原性微生物の診断が可能となｐｌまだ、免疫拡散（ｉ
ｍｍｕｎｏｄｉｊｆｕｓｉｏｎ　）において４８時間以
内で病原性微生物の特徴付けが可能となる。また、１つ
の同じ生物学的媒質中の数種の病原性微生物の存在可能
性をも診断できることになる。かくして、本発明の方法
によれば、数種の微生物を同時に検出できるので、試験
に必要な培地の量及び時間を著しく節約できることにな
シ、その上選択培地の使用も必要としない。
本発明は、汚染された生物学的媒質中の特異的抗原決定
基例えば抗原分画１＋２を有する病原性微生物を、該特
異的抗原決定基を抑制する抗体を結合させたマグネティ
ックゲルを用いて、免疫細菌学的に検出する方法に関す
る。本発明方法は、例えば分画１＋２の様な特異的抗原
決定基を有する病原性微生物によ如汚染烙れた可能性の
おる生物学的媒質を、上記マグネティックゲルのビーズ
等に充分な時間接触させて該生物学的媒質中に含まれる
上記微生物を上記ゲルに固定せしめ、該マグネティック
ゲルのじ−ズ等を磁気的手段により上記混合物から取出
し、適当な寒天培地に接種し、該寒天培地中で適当な時
間を要し、適当な温度でイン士ユベートし、次いで、該
寒天中に埋め込まれ、且つ培養コロニーで覆われたマグ
ネテイックじ一ズの近傍で寒天をすくい取ってウェル（
ｔｎｔｌｌｓ）を形成し、該ウェルに検出すべき病原性
微生物を抑制する適当な血清を満たし、上記微生物を適
当な溶菌剤で溶菌し、溶菌液を、該寒天上で免疫拡散法
により血清学的抗体−抗原反応を可能にする適当な時間
、上記血清と共にイン士ユベートし、該寒天上の抗原−
抗体反応によシ生物学的媒質中に含有されている微生物
の量を直接的に読み取るものである。
本発明の免疫細菌学的検出方法の有利な実施態様におい
ては、寒天をすくい取って形成された各ウェルに病原性
微生物を抑制する異なった血清を満たすことによって、
生物学的媒質中のいくつかの病原性微生物を同時に検出
することができる。
本発明方法の他の有利な実施態様においては、マグネテ
ィックゲルのビーズ等に固定された特異的抗原決定基を
抑制する抗体は、分画１＋２を抑制する超免疫血清に由
来する分画１＋２を抑制する抗体である。該抗体は、仏
国特許煮７３１０３７３４又はその追加特許の１つであ
る屋７４１０６９８３又は７７／１２１５２に従って、
上記超免疫血清からＩｆＧをｍ出することによって得ら
れる。
本発明方法の適用のための実施態様の有利な変形におい
ては、生物学的媒質中の数種の病原性微生物を同時に検
出するために１検出すべき各病原性微生物の培養物に由
来する、分画１＋２を抑制する抗体を固定したマグネテ
ィックゲルのヒース等のシリーズを、生物学的媒質と接
触させる。
本発明によれば、寒天をすくい取って形成されたウェル
に入れられる、病原性微生物を抑制する血清は、分画１
＋２を抑制する微生物に特異的な血清、分画１＋２を有
する病原性微生物を抑制する多価血清、病原性微生物の
毒素を抑制する血清及び上記病原性微生物のサブユニッ
トＡ又はＢを抑制する血清からなる群から選ばれる。
本発明方法の有利な実施態様においては、生物学的媒質
は、大便、血液、尿、排出物及び水からなる群から選ば
れる。
本発明方法の他の有利な実施態様においては、生物学的
媒質をイン士ユベーショシした後、該生物学的媒質から
マグネティックゲルのし一ズ等を除去するために用いら
れる磁気的手段は、磁化ロッドからなる。
本発明方法の別の有利な実施態様においては、寒天中に
埋め込まれたビーズ上で培養された微生物の溶菌剤は、
例えばトルエン、脂肪酸エステルとツルじトールとから
形成された洗剤“スパン（５ｐａｙｒ　）”とエチレン
オ士サイドとの縮合生成物である“ツイーン（Ｔｗｅｅ
ｎ）　　”又は高濃度のクルコース、或は例えば補体等
の酵素的溶菌剤である。
、　　本発明方法の他の有利な実施態様においては、磁
気的手段に付着されたマグネティックゲルのビーズ等を
、寒天に接種する前に数回洗浄する。
本発明の実施態様によれば、磁気的手段に付着されたマ
グネティックゲルのビーズ等は１寒天に接種すべく、磁
場の作用により該磁気的手段から脱離される。
本発明によれば、特異的抗原決定基を抑制する抗体が固
定されたマグネティックゲルのビーズの接触時間は、室
温（ａｍｂｉｔｎｔ　　ｔｔｍμｒａｔｕｒｔ　）下で
約２時間である。マグネティックゲルのヒースに〜１８
時間である。
本発明は、上述した方法、即ち汚染された生物学的媒質
中に存在し、例えば分画１＋２の様な抗原決定基を有す
る病原性微生物の免疫細菌学的検出方法を行なうための
簡易使用子ットにも関すム該＋ットは、以下のものを備
えている（特に、分画１＋２の場合）。
（−）分画１＋２を抑制する抗体が固定されたマグネテ
ィックゲルのビーズを適当量含有する容器、＜ｂ＞磁化
ロッド又はその類似物、 （Ｃ）底部の中心部の外側に非常に強力な磁石を備えた
例えばペトリ皿の様な培養皿、 （ｄ″）分画１＋２を有する病原性微生物を培養するだ
めの寒天培地を適当量含有する容器、（り検出すべき病
原性微生物を抑制する血清を適当量含有する容器、 （イ）寒天上の病原性微生物の培養物を溶菌するための
溶菌剤を適当量含有する容器、及び（グ）緩衝化された
生理的洗浄水を適当量含有する容器。
簡易使用子ットの有利な実施態様においては、分画１＋
２を抑制する異なる複数の抗体が固定されたマクネテイ
ックゲルのじ−ズを夫々適当量含有する数個の容器と、
上記具なる複数の抗体に対応し、且つ検出すべき病原性
微生物を抑制する血清を夫々含有する容器とを備えてお
り、これによシ生物学的媒質中の数種の病原性微生物を
同時に検出することができる。
本発明簡易使用子ットの好ましい他の実施態様において
は、磁化０ツド又はこの類似物として、テフロン（商標
名）又はこれに類似の絶縁材料によってコートはれた磁
化ロッドが使用きれる。
本発明使易使用子ットの好ましい更に他の実施態様にお
いては、磁化ロッド又はこの類似物は、パスツール研究
所によるフランス特許出願第８３／１７１６６号に開示
された装置の如き磁化装置からなっている。
汚染された生物学的媒質において、分画１＋２を有する
病原菌の免疫細菌学的検出を行なう本発明の好ましい方
法は、以下の様にして行なわれる：１）“ニーシーティ
ー　マクノゲル　ニーシーニー　４４”（Ａｃｔ、　Ｍ
ａｙｎａｑｔｌ　ＡｃＡ　４４　）　マクネテイックゲ
ルを使用する。これは、アイじ一エフ（Ｉ　Ｂ　Ｆ）に
より製造され、ポリアクリルアミド４％、アガロース４
％及びＰ　ｚ　３０４７％を含んでおシ、直径６０〜１
４０μｍＸＩｙＧに対する連結能（ｔｏｕ／ｒｌｉｎｙ
　　ｔａｌｒａｔｉｔｙ　）　２〜４１１９　／　ｇ／
を有する。
２）分画１＋２を阻害する超免疫血清から抽出されたＩ
ｆＧが固定される。該１９Ｇは、ウーダン（ＯＵＤＩＮ
）　　の免疫手法によシ、ＡＮＶＡＲのフランス特許第
７３１０３７３４号又はその追加の特許第７４１０６９
８３号又は第７７／１２１５２号の開示に従って得られ
る抗原分画１＋２をつ＋ｉ甲に注射することによシ得ら
れる。
即ち、適切な培地中で培養されたタラム陰性菌の遠心分
離及び滅菌条件下における菌のリーシス（凍結解凍（ｆ
ｒｅｔｔｉｎｇ　−ｔｋａｗｉｎｆ　）又は超音波振動
）による細胞内内因性分画の抽出、並びにゲルクロマト
シラフィーによる抗原分画ｌ＋　　：２の分離によるか
、又はガル（Ｇａｌｌｕｌ）の方法による菌のり−シス
及びり０ル酢酸による抗原分画！＋２の精製によるか、
又は培養液のオートクレーブ処理及び遠心分離並びに上
清の蒸留水による透析によりｉられる。
マタネテイクゲルのビーズに対するＩｆＧの固定は、パ
スツール研究所によるフランス特許第７５／３６８８９
号に従ってクルクルアルデヒドによる化学的結合又はパ
スツール研究所及びＡＮＶＡＲによるフランス特許第７
９／２１３４３号に開示された吸着によシ行なわれる。
マタネテイックグルのし−ズに固定されたＩｑＧは、単
一の病原菌の存在を検出することを目的とする場合には
、全てのビーズ上で同一であって良く、同一の生物学的
媒質において数種の病原菌を検出することを目的とする
場合には、巣なる２種以上のものであっても良い。
３）分画１＋２を抑制する抗体２〜４％を固定するマク
ネテイックゲルのビーズは、室温で約２時間程度にわた
シ、水、大便、血液、尿又はその他の排出物の如き生物
学的媒質と溶液状態で接触させられる。
４）テフロン（商標）にニジコートされた磁化ロッド又
はパスツール研究所のフランス特許出願第８３／１７１
６６号に開示された磁化装置の如き直径約１２ｇｇの適
当に絶縁された磁化０ツドは、緩やかな攪拌下に溶液中
に浸漬される。
この際、マクネテイツクビーズは、０ツドに吸着される
。該ビーズは、ｐＨ７，４に緩衝調整された生理食塩水
２５０耐中で３回洗浄てれる０５）第３回目の洗浄後、
ｏ’７Ｆの下側に集中するマタネテイツクピーズは、例
えば、１．５％パスツール寒天培地（”　Ａｙａｒ　Ｎ
ｏｂｌｅ　”　、　Ｄｉｆｔｏ　）又は三ニラ−しント
ｙ培地の如き、市販の寒天培地に接種される。この様な
培地は、ペトリ皿に収容されておシ、該皿の下部には、
実質的に皿の軸沿いに位置する強力なマグネットが設け
られている；じ−ズを付着させた磁化ロッドは、寒天に
接する様にペトリ皿の中心に設置される。
ペトリ皿下方に設けられたマグネットによる碇場の影響
下に、じ−ズは、０ツドからはなれ、寒天中に埋め込ま
れ、直径約１Ｇのスポットを形成する。ペトリ皿は、３
７°Ｃ±１°Ｃで約１４〜１８時間保持士ユベートされ
る。
必要ならば、通常の細菌学的研究を行なう為に、細菌を
白金耳によってコロニーからとシ出すことも出来る。
６）イン士ユベーション期間の終了時に、滅菌されたカ
ッターによりコロニーによシ侃われたマクネテイックし
一ズのスポットから約１ｃ１１のところから、３〜４個
の穴を形成する様に寒天をすくい取る。各穴部をづ０ツ
クする様に・微量の寒天を穴の底部に滴下し、次いで、
穴部は、分画１＋２を抑制する病原菌に特異的な血清、
又は検出さるべき病原菌を抑制する多価血清、又は検出
さるべき病原菌の全ト十シン （ｃｏｍ戸１ｅｌｔ　ｔｏｚｉｎ　）を抑制する血清、
又は検出さるべき病原菌のト＋シｙのサブユニットＡ又
はＢを抑制する血清によシ充たされる。
或いは上記の応用例として、単一の生物学的媒質中の複
数の病原菌を検出する為に、マクネテイツクビーズ自体
が分画１＋２を阻害する２種以上の異なる抗体を担持し
ている場合には、穴の夫々を異なる病原菌に対応する複
数の血清で充たしても良い。使用される複数の血清は、
抗原分画！＋２を有するクラム陰性病原菌の培地からウ
ーダンの方法によシ得られる。クラム陰性菌としては、
］レラ菌（Ｖｉｂｒｉａ　ｔｈｏｌｔｒａｔ）、ネズＥ
ｌフス菌（Ｓａｌｍｏｎｔｌｌａ　　ｔｙｐｈｉｍｕｒ
ｉｕｍ　）、鼻痘菌（Ｍｔｌｌｔｏｍｙｃｔｓ　　ｍａ
ｌｌｔｉ　）　、ウマ鼻療菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ
　　ｍａｌｌｔｉ　）　　（又はホイットＥ７杆菌）、
偽鼻痕菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｌｒｓｚｕｄｔｒ
ｍａｌｌｔす、し４オネ！Ｊア　ニ１−Ｅフイ５　（Ｌ
ｅｇｉｏｎｔｌｌｔａ戸ｎｔｕｍ６ｐｈｉｌａ　）　、
大腸菌、ＬＴト＋シン（ＬＴ　　ｔａｘｉり等が挙けら
れる。血清の取得は、マクネテイツクゲルのビーズに固
定されたＩｆＧが、上記の病原菌の血清から抽出はれる
のと同様の方法で行なわれる。
７）トルエンの如き化学的溶菌剤、又は“Ｔｗｚｔｎ″
（商標）、又は、固定されたＩｇＧが、コレラ曲の分画
１＋２を抑制するＩｆＧである場合には、タル］−ス、
又は補体の如き酵素的溶剤菌の一滴を、コロニーで覆わ
れたマクネテイツクピーズに付与する。
８）ペトリ皿を閉じてその含有成分の蒸発を防止すると
ともに、室温で約１４〜１８時間保持することによ多、
寒天中で免疫拡散による血清学的抗原−抗体反応を惹起
させる。
この培養期間の経過後、病原菌の抗体は、寒天上で対応
する血清に対するｌ又は２以上の沈降バンドとして観察
される：かくして、コレラ菌の抗体は、分画ＣｈＩ＋２
を抑制する特異血清に対する単一の沈降バンドとして、
或いは多価抗コレラ血清に対する４つ又は５つのバンド
として観察される。非毒素産生性の菌株は、ト十シンの
抑制に対応するバンド又はト士シンのサブユニットの抑
制に対応するバンドを示さない。
毒素産生性の菌株は、ト士シンを抑制する血清又はト士
シンのサブユニットＡ及びＢを抑制する血清に対する沈
降バンドとして観察される。
病原菌の同定は可能であるもののその毒素原性特徴を知
ることが出来ない世界保健機構（ＷＨＯ）推奨の方法と
比較して、本発明による病原菌検出方法は、毒素産生株
を検出し得る利点を有している。
例えば、コレラ菌の場合には、本発明は、１０２／１０
０ｇ？（保菌者の場合）から１０６／１００ｇ／（患者
の場合）にいたる菌数の測定を可能とし、又、大腸菌の
場合には、＋０２／１０１００Ｏ（保菌者）までの菌数
測定が可能となる。
上記以外の本発明の特徴とするところは、以下の記載か
ら明らかとなろう。
本発明の理解をよシ容易なものとする為に本発明の実施
例を以下に示す。本発明が、この様な実施例にのみ限定
されるものではないことは、言うまでもないところであ
る。
実施例　１ 保菌者からのコレラ菌の検出 １）試料とされた生物学的媒質は、小川型エルトールコ
レラ菌にょ）汚染されていると考えられる大便である：
水１００ｍに大便１０ｆを加え、シェーカーにより大便
の１０％懸濁液を調製する。ｌ　ｙｉｌ当シに分画ＣＭ
＋２を阻害する抗体２　”９　／　ｍｌを含む“マタノ
ゲル”ビーズ１　ｔｒｒｌを該懸濁液に加える。
ビーズと懸濁液の接触状態を室温で２時間継続する。
２）“デフ０シ”で］−トした磁化０ツド（直径１２ｍ
！Ｉ）又はパスツール研究所によるフランス特許第８３
／１７１６６に開示された磁化０ツド装置を上記懸濁液
に浸漬し、緩やかに攪拌する。ビーズは、０ツドに付着
する。ｐＨ７，５に緩衝調整した生理食塩水２５０−に
よシじ一ズを３回洗浄する。
３）その下面にビーズが集中的に付着しているロッドを
、ペトリ皿に収容された１、５％パスツール寒天液（“
Ａｙａｒ　　Ｎｏｂｌｇ”、Ｄｉｆｃａ）に接触させる
。該ペトリ皿の下方には強力なマグネットが設けられて
いる。ロッドは、マグネットの中心軸沿いに皿の中央に
配置される。ビーズはロッドから離れて、寒天中に入シ
、直径１αのスポットを形成する。
上記ペトリ皿を３７°Ｃで１８時間培養する。
４）該培養期間の終了時に、滅菌カッターにより寒天を
すくい取って４つの十字型の穴を形成させる０その位置
は＼コロニーでｆわれだ磁気ビーズのスポットから１ｍ
のところである。微滴の寒天を穴の底部に注下して底を
ふさぎ、］レラの全ト十シシを阻害する血清によシ穴を
充す。
５）コロニーによシ巽われたマタネテイックじ−ズ上に
トルニジを一滴おとし、菌を溶かす。
６）ペトリ皿を密閉して、室温で１８時間培養する０ かくして、コレラ菌の勘案産生株は、抗毒素血清に対す
る沈降バンドとして観察される。
実施例　２ 患者におけるコレラ菌の検出 実施例１と同様の手順を行なって４個の穴を形成した後
、その２個に分画Ｃｈｌ＋２を阻害する血清を入れ、他
の２個に全］レラト＋シンを阻害する血清を入れた：菌
数１０２／１００の大便溶液を試験した結果、該菌は、
毒素産生株であることが判明した。これに対し、同じ大
便サンプルをＷＩＩＯ法によシ試験したところ、菌を同
定することは出来たが、その毒素原性的特徴を検出する
ことは出来なかった。
実施例　３ 保菌者におけるホイット七ア杆菌の検出ｌ）ホイット七
ア杆菌により汚染されていると思われる馬糞２０ｆを生
理食塩本釣５０ｍ１で希釈する：ホイットｔア　タイプ
１を阻害する抗体を担持するマクネテイックし−２０，
２０πｌを加える。ビーズと試料の接触を室温で１〜２
時間継続させる。
２）上記の接触時間経過後、実施例１と同様にして上記
マクネテイックじ−ズを、磁化０ツドで取出し、ペトリ
皿内の栄養寒天液（例えば三ニラ−しントシ液）の中心
に配置する。ペトリ皿を３７°Ｃで１８時間保温室中に
保持する。
３）じ−ズ上の培養ディスクから８Ｍ１１の位置から寒
天をすくい取ってウェルを形成させ、ホイッｔア　タイ
づＩを阻害する特異血清をウェルに加える。
４）ディスク部の菌をトルエン−滴によシ溶かす。
５ン　馬糞中にホイット七ア杆菌が含まれている場合に
は、１０〜１２時間後、ホイット七ア杆菌抗血清−ホイ
ット七ア　タイづＩ抗体に対応する沈降バシトが観繋さ
れる。
６）抗体を加えるウェルに代えて、特定の血清を含浸さ
せた小さな円型の紙（抗生物質タイ″ｊ）を使用しても
良い。
７）タイプＩ及びタイプ■の双方について、実施例１と
ほぼ同じオーダーの有意的な菌濃度が得られた。
特異免疫血清は、ホイットｔア什菌のタイプＩ及びタイ
プｎの抗原に対してのみ沈降するので、固定の特異性が
完全でなくとも（プロテウス属がビーズに固定されてい
ることが見出された）、検出の障害とはならない。
実施例　４ ネズミチフス菌の検出 ネ：Ｊ、三チフス菌の異なるタイプによって実験的に汚
染された大便につき、実施例１の手法に従ってテストを
行なった。寒天上の各チフス菌の濃度は、実施例１にお
けるコレラ菌の場合と同様のオーダーであった。
寒天の二重拡散ダイアクラム（ａｑａｒ　ｄｏｕｂｌｅ
ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ　　ｄｉａｇｒａｍ　）による位置
特定及び同定の後、寒天上に見出されるリル七ネラ属の
異なるタイプ（ＡＳＢ、Ｃ，Ｄ、Ｅ）に共通する抗原を
、セファデックスＧ２００　（商標）カラムを使用して
抽出し、ウリ千に注射して特異血清を得た。
該特異血清に対する沈降によって診断を行なった。
実施例　５ 本試験は、実験的に汚染された大便につき、実施例１記
載の手法に従い行なった。同様な良い濃縮結果が得られ
た。即ち、水１０００　ｔｎｌ中の１０２個のニジエリ
しアコリがマタネテイツクゲルのビーズに固定された。
同様に、血清による沈殿の特異性に関しても、コレラ菌
と同様に良好な結果が得られた。
以上から明らかな通り、本発明の検出方法によシ、４８
時間未満で病原性微生物の存在を診断できる。これに対
し、同様の検出を細菌学的方法によシ行なうと、少くと
も４日間を要する。しかも、本発明の検出方法は多くの
設備を必要とせず、そのコストも低く、また、必要とす
る生物学的媒質の量は少なく、試薬の使用量も少ない。
更に、検出すべき微生物に応じて異なる抗体を結合させ
たマジネテイツクじ−ズ及び寒天をすくいとって形成し
たウェル中の対応する異なる血清を用いることによシ、
生物学的媒質の１つの試料のみから、該試料中に存在す
る数種の病原性微生物を同長することができる。
まだ、上記した事項から明らかなように、本発明は、そ
の実効化方法やより具体的に記述した如き実施態様や適
用方法に限定されるものではなく、本発明の範囲を逸脱
することなく当業者が着想し得る全ての変更態様をも含
むものである。
（以　上） 代理人　弁理士　三　　枝　　英　　二手続補正書（酸
） 昭和５９年３月７日 特許庁長官　　若杉和夫　　殿 １、事件の表示 昭和５８年　特　許　願第２３３４５３　　号２　　発
明＋７１１称　汚染された生物学的媒質中の病原性微生
物事件との関係　　特許出願人 ７’、）゛ □〜 アシステイテユ　パスツール　　　′・１１、−・２４
、代理人 大阪市東区平野町２の１０沢の鶴ヒル電話０６−２０３
−０９４１　（代）なし　、７．、′ ７°　補正０対象明細書中発明の詳細な説明の項８、補
正の内容 別紙添附の通り 補　　正　　の　　内　　容 Ｊ　明細書第１８頁第４〜９行に、「マグネティックゲ
ルのし−メに・・・室温下で１４〜１８時間である。」
とあるを、次の通９訂正する。
「マグネティックゲルのビーズに固定された微生物の寒
天上での培養時間は、３７°Ｃ±ＶＣで１４〜１８時間
である。分画１＋２を抑制する抗体とウェル中に含有さ
れる血清の抗原との免疫拡散法による反応時間は、室温
下で１４〜１８時間である。」 （以　上）

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 ■　汚染された生物学的媒質中の特異的抗原決定基を有
    する病原性微生物を、該特異的抗原決定基を抑制する抗
    体を結合させたマグネティックゲルを用いて、免疫細菌
    学的に検出する方法であって、特異的抗原決定基を有す
    る病原性微生物により汚染されている可能性のある生物
    学的媒質を、上記マグネティックゲルのビーズ等に充分
    な時間接触させて該生物学的媒質中に含まれる上記微生
    物を上記ゲルに固定せしめ、該マグネティックゲルのビ
    ーズ等を磁気的手段によシ上記混合物から除去し、適当
    な寒天培地に接種し、該寒天培地中で適当な時間を要し
    、適当な温度でイン士ユベートし、次いで、検出すべき
    病原性微生物を抑制する適当な血清を含有する領域を、
    該寒天中に埋め込まれ、且つ培養コロニーで覆われたマ
    ジネテイックじ一ズの近傍に適当な手段で形成させ、上
    記微生物を適当な溶菌剤で溶菌し、溶菌液を、該寒天上
    で免疫拡散法により血清学的抗体−抗原反応が生起する
    まで、上記血清と共にイン士ユベートし、該寒天上の抗
    原−抗体反応によシ生物学的媒質中に含有はれている微
    生物の量を直接的に読むことを特徴とする方法。 ■　特異的抗原決定基が、抗原分画１＋２からなる特許
    請求の範囲第１項記載の方法。 ■　検出すべき病原性微生物を抑制する適当な血清を含
    有する領域が、寒天をすくいとってウェルを形成し、該
    ウェル中に該血清を充填することによ）形成される特許
    請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ■　検出すべき病原性微生物を抑制する適当な血清を含
    有する領域が、該血清を含浸させた小さな紙の円盤を、
    寒天中に埋め込まれ且つ培養コロニーで侃われたマタネ
    テイツクビーズの近傍に配置することによ多形成される
    特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の方法。 ■　寒天中に形成され、且つ検出すべき病原性微生物を
    抑制する血清を含有する領域が、病原性微生物を抑制す
    る異なる複数の血清を含有し、これによυ数種の病原性
    微生物の同時検出を行なう特許請求の範囲第１項乃至第
    ４項のいずれかに記載の方法。 ■　マタネテイツクゲルのビーズ等に固定され、且つ特
    異的抗原決定基を抑制する抗体が、特異的抗原決定基を
    抑制する超免疫血清を出発原料とし、該超免疫血清から
    ＩｆＧを抽出することにより得られる抗体である特許請
    求の範囲第１項又は第２項の方法。 ■　検出すべき病原性微生物の各培養物から由来し、且
    つ特異的決定基を抑制する抗体を固定逼せたマクネテイ
    ックゲルの一連のビーズ等を、生物学的媒質と接触させ
    、これにより該生物学的媒質中の数種の病原性微生物を
    特徴とする特許請求の範囲第６項記載の方法。 ■　寒天中に形成された領域中に含有され、且つ病原性
    微生物を抑制する血清が、特異的抗原決定基を抑制する
    微生物に特異的な血清、特異的抗原決定基を有する病原
    性微生物を抑制する多価血清、病原性微生物の毒素を抑
    制する血清及び該病原性微生物の毒素のサブユニットＡ
    又はＢを抑制する血清から選ばれたものである特許請求
    の範囲第５項記載の方法。 ■　生物学的媒質が、大便、血液、尿、排出物及び水か
    ら選ばれたものである特許請求の範囲第１項乃至第８項
    のいずれかに記載の方法。 ［相］　生物学的媒質をイン＋ユペート後、該生物学的
    媒質からマクネテイックゲルのビーズ等を除去するため
    に用いる磁気的手段が、好ましくは絶縁された磁化ロッ
    ドからなる特許請求の範囲第１項記載の方法。 ■　寒天中に埋め込まれたビーズ上で培養された微生物
    の溶菌剤が、トルエン、タルコース、及び脂肪酸エステ
    ルとソルビトールとから形成された洗剤“スパン（ｓｊ
    ａｎ）”とエチレンオ十サイドとの縮合生成物から選ば
    れた化学的溶菌剤である特許請求の範囲第１項記載の方
    法。 ０　寒天中に埋め込まれたビーズ上で培養された微生物
    の溶菌剤が、酵素的溶菌剤である特許請求の範囲第１項
    記載の方法。 ［相］　磁気的手段に付着されたマタネテイツクゲルの
    じ一ズ等を、寒天に接種する前に数回洗浄する特許請求
    の範囲第１項乃至第１０項のいずれかに記載の方法。 ■　磁気的手段に付着されたマタネテイツクゲルのビー
    ズ等を、寒天に接種すべく、磁界の作用によシ磁気的手
    段から脱離される特許請求の範囲第１項乃至第１０項の
    いずれかに記載の方法。 ［相］　特異的抗原決定基を抑制する抗体を固定きれた
    マクネテイツクゲルのビーズの接触時間が、室温下で約
    ２時間である特許請求の範囲第１項乃至第１４項のいず
    れかに記載の方法。 ［相］　マクネテイックゲルのビーズに固定された微生
    物の寒天中での培養時間が、３７°Ｃ±Ｉ　°Ｃで１４
    〜！８時間である特許請求の範囲第１項乃至第１４項の
    いずれかに記載の方法。 Ｏ特異的抗原決定基を抑制する抗体と免疫拡散法による
    、ウェル中に含有される血清の抗原との反応時間が、室
    温下で１４〜１８時間である特許請求の範囲第１項乃至
    第１６項記載のいずれかに記載の方法。 ［相］　（ａ）特異的抗原決定基を抑制する抗体が固定
    されたマクネテイックゲルのじ−ズを適当量含有する容
    器、 （ｂ）適当に絶縁された磁化０ツド又はその類似物、 （Ｃ）底部の中心部の外側に非常に強力な磁石を備えた
    培養皿、 （→特異的抗原決定基を有する病原性微生物を培養する
    だめの寒天培地を適当量含有する容器、（１）検出すべ
    き病原性微生物を抑制する血清を適当量含有する容器、 φ寒天上の病原性微生物の培養物を溶菌するだめの溶菌
    剤を適当量含有する容器、及び（ｐ）緩衝化生理的洗浄
    水を適当量含有する容器を備えていることを特徴とする
    特許請求の範囲第１項乃至第１７項のいずれかに記載の
    方法を実施するための簡易使用＋ット。 σ■　特異的抗原決定基を抑制する抗体が、分画ｌ、＋
    ２を抑制する抗体であ）、特異的抗原決定基が分画１＋
    ２である特許請求の範囲第１８項記載の士ット。 ［相］　特異的抗原決定基を抑制する異なる複数の抗体
    が固定されたマグネティックゲルのビーズを夫々適当量
    含有する数個の容器と、上記異なる複数の抗体に対応し
    、且つ検出すべき病原性微生物を抑制する血清を夫々含
    有する容器とを備えてお９、これによシ生物学的媒質中
    の数種の病原性微生物を同時に検出する特許請求の範囲
    第１８項又は第１９項に記載の簡易使用＋ット。
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