FR2463807A1 - Procede de fixation de molecules biologiques sur des supports magnetiques en particules a base de polymeres vinylaromatiques et ses applications - Google Patents
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Abstract
L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE FIXATION DE MOLECULES BIOLOGIQUES SUR DES SUPPORTS MAGNETIQUES EN PARTICULES A BASE DE POLYMERES VINYLAROMATIQUES ET SES APPLICATIONS. LE PROCEDE CONSISTE A METTRE EN CONTACT UNE SOLUTION CONTENANT LES MOLECULES BIOLOGIQUES A FIXER AVEC UN SUPPORT MAGNETIQUE SOUS FORME DE PARTICULES A BASE DE POLYMERES VINYLAROMATIQUES, LE CONTACT ETANT REALISE PENDANT UN TEMPS SUFFISANT POUR REALISER L'ADSORPTION DESDITES MOLECULES BIOLOGIQUES SUR LEDIT SUPPORT ET A SEPARER DE LA SOLUTION LE SUPPORT BIOLOGIQUE RESULTANT. APPLICATION: DOSAGES IMMUNOLOGIQUES ET SEPARATION DE MOLECULES BIOLOGIQUES.
Description
La présente invention concerne un procédé de fixation de molécules biologiques sur des supports magnétiques sous forme de particules à base de polymères vinylaromatiques et ses applications.
Il est connu de fixer des molécules biologiques sur des supports insolubles; les supports biologiques résultants ont diverses applications parmi lesquelles on peut citer la séparation de substances biologiques, telles que les bactéries, les virus, les cellules, la détection d' anticorps et d'antigènes, les dosages, par exemple les dosages radioimmunologiques, les dosages immunoenzymatiques, les dosages par fluorimétrie.
Les supports insolubles couramment utilisés sont par exemple des tubes en polystyrène, des plaques telles que les plaques GREINER, et des billes, également en polystyrène, des gels ou perles à base de dérivés de cellulose, d'agarose d'acrylamide, d'adrylamide/agarose, de dextrane, etc..
La fixation des molécules biologiques sur de tels supports est réalisée soit par adsorption physique soit par des liaisons covalentes; dans ce dernier cas, il est généralement nécessaire de mettre en oeuvre un agent de couplage, tel que le glutaraldéhyde / T. TERNYNCK et S. AVRAMEAS F.E.
B.S. Letters, 23 ; 24, 1972 7
Ces supports biologiques, c'est à dire les supports insolubles sur lesquels sont fixées des molécules biologiques, présentent cependant des inconvénients importants. Par exemple, les plaques ne permettent pas de réaliser un dosage avec une précision élevée; en effet, des essais immunologiques réalisés avec de telles plaques ne sont pas toujours reproductibles. D'autre part, l'utilisation des billes ou gels comme supports insolubles implique autant lors de la séparation de molécules biologiques que lors de dosages immunologiques, des étapes de lavage et/ou centrifugation, qui augmentent considérablement la durée du dosage ou de la séparation.
Ces supports biologiques, c'est à dire les supports insolubles sur lesquels sont fixées des molécules biologiques, présentent cependant des inconvénients importants. Par exemple, les plaques ne permettent pas de réaliser un dosage avec une précision élevée; en effet, des essais immunologiques réalisés avec de telles plaques ne sont pas toujours reproductibles. D'autre part, l'utilisation des billes ou gels comme supports insolubles implique autant lors de la séparation de molécules biologiques que lors de dosages immunologiques, des étapes de lavage et/ou centrifugation, qui augmentent considérablement la durée du dosage ou de la séparation.
Ces étapes supplémentaires nuisent à la sensibilité et à la précision, qui sont généralement exigées dans le domaine
biologique.
biologique.
Pour palier ces inconvénients, on a déjà proposé d'utiliser des gels magnétiques à base de polyacrylamide, d'agarose ou d'acrylamide/agarose. A cet effet, on peut se référer au brevet FR 75 36 889 (publié sous le n02.334.106) au nom de la demanderesse. Toutefois, l'utilisation de ces gels est limitée car on ne peut fixer sur de tels gels que des molécules biologiques qui comportent des groupes aminés primaires. De plus, la fixation ne peut être réalisée que par des liaisons covalentes, ce qui implique alors la mise en oeuvre d'un agent de couplage, tel que le glutaraldéhyde.
On a maintenant trouvé que l'on peut utiliser, comme support magnétique de molécules biologiques, des polymères vinylaromatiques magnétiques se présentant sous la forme de particules.
La présente invention consiste donc d'une part en un procédé de fixation de molécules biologiques sur des supports magnétiques qui consiste à mettre en contact une solution, contenant les molécules biologiques à fixer, avec un support magnétique constitué de particules magnétiques de polymères vinylaromatiques, le contact entre ledit support et ladite solution étant réalisé pendant un temps suffisant pour réaliser l'adsorption desdites molécules biologiques sur ledit support et à séparer le support biologique résultant de la solution. La granulométrie des particules magnétiques de polymères vinylaromatiques n'est pas critique.
Toutefois, on préfère les particules ayant une granulométrie inférieure à 3 mm environ, de préférence comprise entre 0,5 et 0,05 mm.
L'invention concerne d'autre part, l'application du support biologique obtenu selon le procédé de l'in- vention dans les dosages immunoenzymatiques, radioimmunologiques et par fluorimétrie, ou d'autres marqueurs, ainsi que dans la séparation de substances biologiques, telles que les bactéries, les virus, les cellules, les antigènes et les anticorps.
A titre d'exemples de substances biologiques -qui peuvent etre fixées selon le procédé de l'invention, on peut citer les protéines, telles que par exemple, les anticorps, les enzymes, les bactéries, les virus, les cellules, etc.
Les polymères vinylaromatiques mis en oeuvre selon l'invention sont des polymères magnétiques, c'est à dire qu'ils possèdent une charge magnétique attachée dans leur masse par tout moyen approprié. De plus, ces polymères vinylaromatiques magnétiques doivent avoir de préférence une granulométrie inférieure à 3 mm, par exemple comprise entre 0,05 et 0,5 mm.
Les polymères vinylaromatiques préférés aux fins de l'invention sont les polymères obtenus selon un procédé de préparation de perles magnétiques de polymères vinylaro matiques par polymérisation en suspension, procédé qui fait l'objet de la demande de brevet FR déposée ce Jour au nom de
RHONE-POULENC INDUSTRIES sousle n 79 21 34 Ce procédé consiste à effectuer une polymérisation en suspension d'un composé vinylaromatique seul ou en mélange avec un monomère copoly mérisable en présence d'un initiateur, d'un agent de suspension et d'une charge magnétique, ledit procédé étant Ca- ractérisé en ce que la charge magnétique est dispersée dans une solution d'homo- ou co-polymère dans le ou les monomères puis la dispersion obtenue est mise en suspension dans l'eau et le ou les monomères sont polymérisés.
RHONE-POULENC INDUSTRIES sousle n 79 21 34 Ce procédé consiste à effectuer une polymérisation en suspension d'un composé vinylaromatique seul ou en mélange avec un monomère copoly mérisable en présence d'un initiateur, d'un agent de suspension et d'une charge magnétique, ledit procédé étant Ca- ractérisé en ce que la charge magnétique est dispersée dans une solution d'homo- ou co-polymère dans le ou les monomères puis la dispersion obtenue est mise en suspension dans l'eau et le ou les monomères sont polymérisés.
Les polymères vinylaromatiques particulièrement préférés sont les homocolymeres et copolymères de styrène, d'alphaméthylstyrène, d'éthylstyrène ou de vinyltoluène obtenus selon le procédé défini ci-dessus et dont la granulométrie est comprise entre 0,05 et 3 mm, de préférence entre 0,1 et 2 mm et notamment les polystyrènes spécifiques décrits dans les
exemples illustratifs de la demande de brevet déposée
ce jour et citée ci-dessus.
exemples illustratifs de la demande de brevet déposée
ce jour et citée ci-dessus.
Il est particulièrement avantageux de laver les particules de polymères avant la mise en contact avec la solution de molécules biologiques. En général, on effectue un lavage avec de l'hydroxyde de sodium, puis ensuite avec de l'alcool et enfin avec de l'eau. Ces lavages ont pour but d'éviter les bruits de fond.
Les lavages peuvent aussi être effectués dans un ordre différent. Les particules sont ensuite séchées selon les méthodes classiques, comme par exemple sous vide, lyophilisation, traitement aux solvants organiques, etc..
La solution de molécules biologiques à mettre en oeuvre est généralement une solution dans un tampon approprié vis à vis des molécules biologiques considérées. Par exemple, lorsque les molécules biologiques sont des protéines, on peut utiliser des tampons basiques, des tampons carbonate ou des tampons phosphate. Il s'agit d'une solution diluée en molécules biologiques, la dilution étant relative à la quantité de support que l'on veut préparer. En général, on utilisera des solutions contenant de 1 à 20 mg/ml de molécules biologiques.
La fixation des molécules biologiques est réalisée par mise en contact ou incubation des particules de.poly- mères magnétiques vinylaromatiques avec la solution de molécules biologiques pendant un temps suffisant pour réaliser l'adsorption desdites molécules sur le polymère. Il sera aisé à l'homme de l'art de déterminer ce temps d'incubation en fonction des molécules biologiques considérées. Toutefois on peut indiquer qu'un temps d'incubation d'environ 1 nuit à 40C ou d'environ 1 heure à 370C plus une nuit à 40C sont tout à fait appropriés.
Après incubation, le support biologique formé, c'est à dire le polymère magnétique vinylaromatique solide sur lequel sont fixées les molécules biologiques est séparé de la solution par tous moyens connus à l'aide d'n aimant puis lavé par exemple- avec in tampon phosphate et avantageusement avec un détergent, tel que le produit connu sous la dénomination commerciale "TWEEN". Ces lavages ont pour but d'éviter ou e diminuer les bruits de fond qui correspondent à l'activité minimum due à une adsorption non spécifique des molécules biologiques sur le support insoluble. Le support biologique ainsi obtenu peut être utilisé pour la séparation des substan-ces biologiques ou dans des dosages, tels que des dosages immunoenzymatiques ou radioimmunologiques.
Les supports biologiques selon l'invention peuvent être utilisés dans n'importe quel type de dosages où il est nécessaire de séparer du complexe formé au cours du dosage le réactif marqué (par une enzyme ou par un élément radioactif) n'ayant pas réagi.
Par exemple, pour le dosage d'un anticorps par la méthode à double anticorps, on opère de la façon suivante:
- on fixe sur le polymère vinylaromatique magnétique l'antigène de l'anticorps à doser;
- on fait incuber l'anticorps à doser avec le support biologique (polymère/antigène);
- on sépare la phase solide résultante et
- on fait incuber la phase solide avec un anticorps de l'anticorps à doser, ce second anticorps étant généralement une immunoglobuline, ledit second anticorps étant marqué par une enzyme ou un élément radioactif, et on mesure l'activité enzymatique ou radioactive de la phase solide résultante, les séparations phase solide/phase liquide étant réalisées rapidement à l'aide d'un aimant.
- on fixe sur le polymère vinylaromatique magnétique l'antigène de l'anticorps à doser;
- on fait incuber l'anticorps à doser avec le support biologique (polymère/antigène);
- on sépare la phase solide résultante et
- on fait incuber la phase solide avec un anticorps de l'anticorps à doser, ce second anticorps étant généralement une immunoglobuline, ledit second anticorps étant marqué par une enzyme ou un élément radioactif, et on mesure l'activité enzymatique ou radioactive de la phase solide résultante, les séparations phase solide/phase liquide étant réalisées rapidement à l'aide d'un aimant.
L'homme de l'art comprendra que les supports biologiques selon l'invention peuvent être utilisés dans d' autres types de dosages, tels que dosages par compétition, dosage sandwich, dosage immunométrique.
Il faut noter que le procédé de l'invention permet de fixer du DNA alors que celui-ci ne peut pas être fixé de façon reproductible sur une plaque en polystyrène. On peut donc réaliser un dosage précis de l'anti-DNA. Le test de la rubéole peut être également réalisé aisément selon l'invention alors que celui-ci nécessite la mise en oeuvre d' une plus grande quantité de virus pur avec le gel magnétique selon le brevet FR 75 36 889.
L'invention va être maintenant décrite plus en détail par les exemples non limitatifs ci-après. Dans ces exemples, on a utilisé les perles magnétiques de polystyrène obtenues selon le mode opératoire de l'exemple 5 de la demande de brevet FR déposée ce jour et citée ci-dessus. On rappellera ci-après ce mode opératoire:
Dans un réacteur de 4 litres, muni d'un agitateur, sont introduits:
- 240 g d'une solution à 10% en poids dans le styrène distillé d'un polystyrène dé viscosité 41 mPa.s.
Dans un réacteur de 4 litres, muni d'un agitateur, sont introduits:
- 240 g d'une solution à 10% en poids dans le styrène distillé d'un polystyrène dé viscosité 41 mPa.s.
La viscosité Brookfield de la solution à 19,50C, aiguille nO 1, est de 76 mPa.s.
- 320 g de la même solution de polystyrène dans laquelle sont dispersées 16,8 g d'aiguilles de ferrite ou magnétite de 0,2 à 1 um de longueur.
Le mélange est agité pendant 30 mn; 3,73 g de péroxyde de benzoyle sont alors ajoutés, puis 2858 g d'une solution aqueuse contenant 9,6 g de phosphate disodique et 2,52 g d'alcool polyvinylique. La dispersion est alors chauffée à 900C, puis maintenue à cette température pendant 10 heures.
Après refroidissement, le produit formé est filtré, lavé à l'eau, puis séché à 600C.
530 g de perles brunes sont obtenus. Leur répartition granulométrique est la suivante:
- 0,20mm 7,1% en poids
- entre 0,20 et 0,40 mm 80,6% en poids
- > 0,40 mm 12,3% en poids
Des essais ont montré que la fraction 0,20-0,40 mm contenait 1,5 en poids de charge magnétique.
- 0,20mm 7,1% en poids
- entre 0,20 et 0,40 mm 80,6% en poids
- > 0,40 mm 12,3% en poids
Des essais ont montré que la fraction 0,20-0,40 mm contenait 1,5 en poids de charge magnétique.
EXEMPLE I
Fixation du DNA sur les perles magnétiques de polystyrène
On a utilisé 2 ml de perles magnétiques de polystyrène (lot 100); on les a lavées avec de l'hydroxyde de sodium 6 N, de l'alcool et de l'eau. On a ensuite mis en contact 0,5 ml de ces perles avec une solution de DNA tymus de veau 500 ug/ml dans un tampon citrate de sodium.
Fixation du DNA sur les perles magnétiques de polystyrène
On a utilisé 2 ml de perles magnétiques de polystyrène (lot 100); on les a lavées avec de l'hydroxyde de sodium 6 N, de l'alcool et de l'eau. On a ensuite mis en contact 0,5 ml de ces perles avec une solution de DNA tymus de veau 500 ug/ml dans un tampon citrate de sodium.
On a laissé incuber 1 heure à -370C et 1 nuit à 40C. On a ensuite séparé avec un aimant les perles de la solution.
On a ensuite mis en évidence la fixation du DNA en faisant incuber le support biologique résultant avec un sérum anti DNA T+ (témoin positif) 59 /0 @ et un sérum anti
DNA T (témoin négatif), 13% offerts par le Docteur BACH de l'hopital NECKER. On a utilisé les sérums dilués au 1/500, 1/2000 et 1/8000 dans un tampon phsophate, en présence de sérum albumine bovine et de "TWEEN".
DNA T (témoin négatif), 13% offerts par le Docteur BACH de l'hopital NECKER. On a utilisé les sérums dilués au 1/500, 1/2000 et 1/8000 dans un tampon phsophate, en présence de sérum albumine bovine et de "TWEEN".
On a ensuite séparé la phase solide de la phase liquide à l'aide d'un aimant et on a fait incuber la phase solide avec un anti Ig γ marqué à la P -galactosidase.
L'activité enzymatique de la phase solide a été révélée à l'aide d'ortho notrophényl ss -D galacto-pyranoside et on a mesuré la densité optique de cette phase à 420 NM.
Les résultats obtenus sont indiques dans le tableau I ci-après dans lequel on a reporté les résultats obtenus avec différents lots de perles magnétiques de polystyrène (lots 102 et 104)
TABLEAU I
Activité enzymatique
Dilution du sérum Bruits de fond
1/500 1/2000 1/800 Perles + DNA sans
PSM Lot 100 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ sérum T+ ou T
1910 1194 856 291
Sérum T+ 1880 1430 734 280
Sérum T 682 446 301
687 377 344
PSM Lot 102
Sérum T+ 1530 965 489 143
1590 990 618 186
Sérum T 451 296 236
525 310 246 PSM Lot 104
Sérum T+ 1940 1680 1053 -231
1990 1610 918 199
Sérum T 1010 525 402
1452 486 321
A titre de comparaison, on a réalisé un essai semblable en utilisant comme support une plaque en-polysty- rène (plaque M 129 A "GREINER") ou une plaque en polypropylène (plaque "LIMBRO"). La plaque M 129 A avait des cupules de 300 p1 et la plaque LIMBRO des cupules de 200 ,ul.
TABLEAU I
Activité enzymatique
Dilution du sérum Bruits de fond
1/500 1/2000 1/800 Perles + DNA sans
PSM Lot 100 ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ sérum T+ ou T
1910 1194 856 291
Sérum T+ 1880 1430 734 280
Sérum T 682 446 301
687 377 344
PSM Lot 102
Sérum T+ 1530 965 489 143
1590 990 618 186
Sérum T 451 296 236
525 310 246 PSM Lot 104
Sérum T+ 1940 1680 1053 -231
1990 1610 918 199
Sérum T 1010 525 402
1452 486 321
A titre de comparaison, on a réalisé un essai semblable en utilisant comme support une plaque en-polysty- rène (plaque M 129 A "GREINER") ou une plaque en polypropylène (plaque "LIMBRO"). La plaque M 129 A avait des cupules de 300 p1 et la plaque LIMBRO des cupules de 200 ,ul.
On a utilisé une solution à 500 pg/ml de DNA tymus de veau dans un tampon citrate de sodium. On.a fait incuber la plaque avec cette solution de DNA 1 heure à 370C et 1 nuit à 40C. On a ensuite fait incuber la plaque avec le sérum anti DNA T+ défini ci-dessus puis avec l'anti Ig γ marqué à la ss-galactosidase (5 pg/ml) et on a mesuré la densité optique de la phase liquide résultante après dilution au 1/3 pour la plaque en polystyrène et du 1/5 pour la plaque au polypropylène. Les quantités des différents réactifs sont indiquées dans le tableau Il ci-après.
L'activité enzymatique a été révélée selon le mode opératoire défini ci-dessus et les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau III ci-après
TABLEAU II
DNA TYMUS sérum anti anti Igγ substrat
de veau DNA T+ marqué enzymatique
500 ug/ml au 1/1000 à la ONPG
galac
tosidase plaque en polystyrène 250 l 150 l 200 l 350 l plaque en polypropylène 150 pl 100 pl 150 l 175 l TABLEAU III
TABLEAU II
DNA TYMUS sérum anti anti Igγ substrat
de veau DNA T+ marqué enzymatique
500 ug/ml au 1/1000 à la ONPG
galac
tosidase plaque en polystyrène 250 l 150 l 200 l 350 l plaque en polypropylène 150 pl 100 pl 150 l 175 l TABLEAU III
<SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <SEP> 11 <SEP> 12
<tb> <SEP> A <SEP> 325 <SEP> 540 <SEP> 658 <SEP> 858 <SEP> 950 <SEP> 865 <SEP> 865 <SEP> 835 <SEP> 975 <SEP> 934 <SEP> 840 <SEP> 778
<tb> <SEP> B <SEP> 667 <SEP> 810 <SEP> 1020 <SEP> 1045 <SEP> 1060 <SEP> 1030 <SEP> 1080 <SEP> 1100 <SEP> 1130 <SEP> 1140 <SEP> 960 <SEP> 850
<tb> <SEP> C <SEP> 730 <SEP> 935 <SEP> 1040 <SEP> 1045 <SEP> 1100 <SEP> 1070 <SEP> 1070 <SEP> 1080 <SEP> 1120 <SEP> 1100 <SEP> 1150 <SEP> 945
<tb> <SEP> D <SEP> 768 <SEP> 955 <SEP> 1060 <SEP> 1065 <SEP> 1150 <SEP> 1130 <SEP> 1110 <SEP> 1150 <SEP> 1215 <SEP> 1060 <SEP> 1050 <SEP> 1015
<tb> <SEP> E <SEP> 30 <SEP> 37 <SEP> 47 <SEP> 47 <SEP> 51 <SEP> 63
<tb> <SEP> F <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> G
<tb> <SEP> H
<tb>
Les résultats du tableau III montrent que sur une même plaque la fixation n'est pas régulière.
<tb> <SEP> A <SEP> 325 <SEP> 540 <SEP> 658 <SEP> 858 <SEP> 950 <SEP> 865 <SEP> 865 <SEP> 835 <SEP> 975 <SEP> 934 <SEP> 840 <SEP> 778
<tb> <SEP> B <SEP> 667 <SEP> 810 <SEP> 1020 <SEP> 1045 <SEP> 1060 <SEP> 1030 <SEP> 1080 <SEP> 1100 <SEP> 1130 <SEP> 1140 <SEP> 960 <SEP> 850
<tb> <SEP> C <SEP> 730 <SEP> 935 <SEP> 1040 <SEP> 1045 <SEP> 1100 <SEP> 1070 <SEP> 1070 <SEP> 1080 <SEP> 1120 <SEP> 1100 <SEP> 1150 <SEP> 945
<tb> <SEP> D <SEP> 768 <SEP> 955 <SEP> 1060 <SEP> 1065 <SEP> 1150 <SEP> 1130 <SEP> 1110 <SEP> 1150 <SEP> 1215 <SEP> 1060 <SEP> 1050 <SEP> 1015
<tb> <SEP> E <SEP> 30 <SEP> 37 <SEP> 47 <SEP> 47 <SEP> 51 <SEP> 63
<tb> <SEP> F <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> <SEP> G
<tb> <SEP> H
<tb>
Les résultats du tableau III montrent que sur une même plaque la fixation n'est pas régulière.
EXEMPLE II
Fixation de la sérum albumine bovine (BSA) sur les perles magnétiques de polystyrène.
Fixation de la sérum albumine bovine (BSA) sur les perles magnétiques de polystyrène.
Les perles ont été lavées avec H20, de l'alcool à 960 puis de l'hydroxyde de sodium 6N et enfin avec de l'eau.
On a utilisé une solution de 100 ,ug/ml de BSA dans un tampon phosphate 0,002 M pH 8. On a fait incuber dans des tubes à essais 1 ml de perles avec 4 ml de la solution de BSA ("Poviet" Hollande).
On a séparé les perles de la solution et on a utilisé une prise d'essais de 200 rl de billes.
On a fait incuber cette prise d'essai avec une solution d'anti BSA marqué à la P -galactosidase (6yg/ml) pendant 2 heures à la température ambiante. On a utilisé 500 fl de solution par tube contenant une prise d'essai de 200 pl de perles. On a ensuite révélé inactivité enzymatique des perles avec un substrat de l'enzyme approprié et on a mesuré la densité optique à 410 mm.
Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau IV ci-après:
TABLEAU IV polystyrène densité optique densité optique
des perles non des perles après magnétique revêtues de BSA l'essai lot 100 4 150 140 138
4 150 130 142 lot 102 3 237 289 263
5 267 281 259 lot 104 4 200 185 175
4 170 174 173
Ces résultats montrent que la sérum albumine bovine se fixe sur les perles de polystyrène magnétiques quel que soit le lot de fabrication.
TABLEAU IV polystyrène densité optique densité optique
des perles non des perles après magnétique revêtues de BSA l'essai lot 100 4 150 140 138
4 150 130 142 lot 102 3 237 289 263
5 267 281 259 lot 104 4 200 185 175
4 170 174 173
Ces résultats montrent que la sérum albumine bovine se fixe sur les perles de polystyrène magnétiques quel que soit le lot de fabrication.
EXEMPLE 3
Fixation d'Ig de lapin
On a utilisé plusieurs lots de perles magnétiques de polystyrène (lots 100,102,104) obtenues selon le mode opératoire décrit à l'exemple 5 de la demande de brevet FR déposée ce jour et citée ci-dessus.
Fixation d'Ig de lapin
On a utilisé plusieurs lots de perles magnétiques de polystyrène (lots 100,102,104) obtenues selon le mode opératoire décrit à l'exemple 5 de la demande de brevet FR déposée ce jour et citée ci-dessus.
On a lavé ces perles avec H20, NaOH IN, HC10,1 N,
H20, de l'alcool à 960 et de l'eau.
H20, de l'alcool à 960 et de l'eau.
On a utilisé une solution d'Ig lapin "Milles"
F Il à 100 ,ug/ml dans un tampon phosphate 0,02 M pH8.
F Il à 100 ,ug/ml dans un tampon phosphate 0,02 M pH8.
On a mis les perles en contact (1 ml de perles) avec 6 ml de la solution d'Ig lapin pendant 2 heures à la température ambiante sous agitation et pendant 1 nuit à 40C sous agitation douce à la "balancelle".
On a séparé les perles de la phase liquide à l'aide d'un aimant et on a fait incuber le support biologique résultant avec une solution à 6 pg/ml d'anticorps anti Ig de lapin dans un tampon phosphate en présence de BSA et de TWEEN azide, l'anticorps anti Ig y de lapin étant marqué à la peroxydase. Le substrat enzymatique utilisé pour révéler l'activité enzymatique était constitué:
d'ortho-phénylène-diamine 10 /mg
H202 30% (120 volumes) 10
tampon phosphate 0,02 M pH 6 50 ml et on a utilisé 1 ml de ce substrat par tube. On a laissé réagir pendant 90 minutes à la température ambiante et on a ensuite arrêté la réaction enzymatique avec 100 pl de HCl 4N.
d'ortho-phénylène-diamine 10 /mg
H202 30% (120 volumes) 10
tampon phosphate 0,02 M pH 6 50 ml et on a utilisé 1 ml de ce substrat par tube. On a laissé réagir pendant 90 minutes à la température ambiante et on a ensuite arrêté la réaction enzymatique avec 100 pl de HCl 4N.
On a ensuite mesuré la densité optique de la phase solide à 492 nm après séparation phase solide/phase liquide à l'aide d'un aimant.
Lot 100: 1198 1244 1274 1223 1327 1410 1279 97,4%
Lot 102: 1140 1210 1250 1218 1180 1230 1204 91,6%
Lot 103: 1213 1352 1326 1304 1354 1330 1313 100%
Ces résultats montrent que l'on peut obtenir des lots homogènes de supports magnétiques sur lesquels sont fixés de l'Ig de lapin.
Lot 102: 1140 1210 1250 1218 1180 1230 1204 91,6%
Lot 103: 1213 1352 1326 1304 1354 1330 1313 100%
Ces résultats montrent que l'on peut obtenir des lots homogènes de supports magnétiques sur lesquels sont fixés de l'Ig de lapin.
EXEMPLE 4
Fixation de l'antigène Herpès
On a opéré sensiblement selon le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple 3.
Fixation de l'antigène Herpès
On a opéré sensiblement selon le même mode opératoire que celui décrit à l'exemple 3.
On a utilisé:
2 ml de perles magnétiques de polystyrène (lot 102) lavées avec de l'alcool, de la soude, de l'eau.
2 ml de perles magnétiques de polystyrène (lot 102) lavées avec de l'alcool, de la soude, de l'eau.
- 8 ml d'antigène Herpès (lot K préparé par le Docteur
PREVOT à l'Institut Pasteur)
On a mis en contact les perles avec l'antigène (10 ,ug/ml pendant 1 nuit à 40C. On a ensuite séparé le support biologique résultant de la solution à l'aide d'un aimant.
PREVOT à l'Institut Pasteur)
On a mis en contact les perles avec l'antigène (10 ,ug/ml pendant 1 nuit à 40C. On a ensuite séparé le support biologique résultant de la solution à l'aide d'un aimant.
Pour s'assurer de la bonne fixation de l'antigène sur les perles, on a utilisé deux sérums provenant d'un même malade à des saignées différentes (sérum 3956 I P+ et sérum 3956 II T+) que l'on a dilués aux 1/125, 1/500, 1/2000 et 1/8000 dans un tampon phosphate en présence de BSA et de "TWEEN"
On a fait incuber le sérum avec le support biologique préparé ci-dessus à raison de 0,5 ml/tube de sérum, pendant 2 heures à la température ambiante. On a ensuite séparé les phases solide/liquide et on a fait réagir avec la phase solide 0,5 ml/tube d'une solution d'anti Ig H marqué à la phosphatase alcaline à 20 ,ug/ml. La réaction a été réalisée pendant 2 heures à la température ambiante. On a ensuite révélé l'activité enzymatique de la phase solide à l'aide d'un substrat approprié et on a mesuré la densité optique de la phase solide à 410 nm. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau IV ci-après.
On a fait incuber le sérum avec le support biologique préparé ci-dessus à raison de 0,5 ml/tube de sérum, pendant 2 heures à la température ambiante. On a ensuite séparé les phases solide/liquide et on a fait réagir avec la phase solide 0,5 ml/tube d'une solution d'anti Ig H marqué à la phosphatase alcaline à 20 ,ug/ml. La réaction a été réalisée pendant 2 heures à la température ambiante. On a ensuite révélé l'activité enzymatique de la phase solide à l'aide d'un substrat approprié et on a mesuré la densité optique de la phase solide à 410 nm. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau IV ci-après.
On a également réalisé le même essai en utilisant la méthode dite de "Surcoatage" dans le but de diminuer le bruit de fond, / Clin. exp. Immunol.(1976) 25 191-192 7 qui consiste, après fixation de l'antigène sur le support magnétique, à fixer de la sérum albumine bovine. A cet effet on a utilisé 1 ml de support biologique préparé selon le mode opératoire ci-dessus et on a fait incuber ce support avec une solution de 100 ,ug/ml de BSA dans un tampon phosphate 0,02 M pH 8, pendant 15 heures à 40C.
On a ensuite procédé comme ci-dessus. Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau V.
TABLEAU V Densité optique
Sérum Dilution D.O. du support
1/125 1/500 1/2000 1.8000 biologique 3956 I 1078 877 559 254 30
1099 776 399 154 49 3956 II 960 633 395 158
773 653 436 191 3956 I 904 741 363 249 29 avec support "surcoaté" 995 760 363 209 30 3956 II 880 706 399 208 avec support "surcoaté" 957 664 383 172
Ces résultats montrent que l'on peut, avec le support biologique préparé selon l'invention, déceler des anticorps même dans des sérums très dilués.D'autre part, ces résultats montrent qu'il n'y a pratiquement pas dé diffé rence entre la technique simple et la technique dite de "surcoatage".
Sérum Dilution D.O. du support
1/125 1/500 1/2000 1.8000 biologique 3956 I 1078 877 559 254 30
1099 776 399 154 49 3956 II 960 633 395 158
773 653 436 191 3956 I 904 741 363 249 29 avec support "surcoaté" 995 760 363 209 30 3956 II 880 706 399 208 avec support "surcoaté" 957 664 383 172
Ces résultats montrent que l'on peut, avec le support biologique préparé selon l'invention, déceler des anticorps même dans des sérums très dilués.D'autre part, ces résultats montrent qu'il n'y a pratiquement pas dé diffé rence entre la technique simple et la technique dite de "surcoatage".
Par ailleurs, il faut noter que la quantité d'anticorps marqué avec une enzyme qui se fixe de façon non spécifique sur le support biologique est très faible (DO du spport biologique).
EXEMPLE V
Fixation de l'antigène Candida Albicans
On a utilisé 3 ml de perles magnétiques de polystyrène (lot 104) lavées et séchées de façon classique, et une solution de 100 g/ml d'antigène somatique anti C Albicans soluble préparé par le professeur DROUHET (Institut Pasteur) dans du tampon phosphate 0,02 M pH8. On a utilisé 12 ml de cette solution d'antigène pour la fixation sur les perles magnétiques; la durée du contact a été de 1 nuit à 40C.
Fixation de l'antigène Candida Albicans
On a utilisé 3 ml de perles magnétiques de polystyrène (lot 104) lavées et séchées de façon classique, et une solution de 100 g/ml d'antigène somatique anti C Albicans soluble préparé par le professeur DROUHET (Institut Pasteur) dans du tampon phosphate 0,02 M pH8. On a utilisé 12 ml de cette solution d'antigène pour la fixation sur les perles magnétiques; la durée du contact a été de 1 nuit à 40C.
On a fait réagir le support biologique résultant avec deux sérums, un sérum anti-albicans positif (S+) et un sérum anti-albicans négatif (S-) dilués à 1/100, 1/400, 1/1000 et 1/6400 dans du tampon PBS, TWEEN, BSA. La réaction a été réalisée à raison de 200 ,ul de perles pour 0,5 ml de la solution diluée de sérum pendant 2 heures, à la température ambiante et sous agitation douce.
On a séparé la phase solide de la phase liquide et on a fait incuber la phase solide avec de l'anti Ig H marqué à la phosphatase alcaline (10 Sug/ml dans un tampon phosphate en présence de BSA et de"TWEEN") pendant 2 heures à la température ambiante. On a ensuite révélé l'activité enzymatique au moins du substrat approprié de la phosphatase alcaline, à savoir le para nitrophényl phosphate selon la méthode classique. On a réalisé le même essai selon la technique de "surcoatage".
Les résultats obtenus sont indiqués dans le tableau
VI ci-après.
VI ci-après.
TABLEAU VI
Sérum Dilution D.O.du support
1/100 1/400 1/1000 1/6400 biologique
S- 250 165 96 42 5
252 192 118 52 6
S+ 903 722 467 227
775 751 483 231
S 248 217 131 57 5 "surcoaté" 255 190 132 59 4
S+ 941 740 472 221 surcoaté 962 802 451 209
L'invention a été décrite en détail dans son application dans le domaine immunoenzymatique et plus particulièrement pour la détection de la présence dans un sérum d'anticorps spécifique de l'antigène fixé sur le support.
Sérum Dilution D.O.du support
1/100 1/400 1/1000 1/6400 biologique
S- 250 165 96 42 5
252 192 118 52 6
S+ 903 722 467 227
775 751 483 231
S 248 217 131 57 5 "surcoaté" 255 190 132 59 4
S+ 941 740 472 221 surcoaté 962 802 451 209
L'invention a été décrite en détail dans son application dans le domaine immunoenzymatique et plus particulièrement pour la détection de la présence dans un sérum d'anticorps spécifique de l'antigène fixé sur le support.
On comprendra aisément que l'invention peut également être appliquée aux dosages proprement dits qu'ils soient immunoenzymatiques ou radioimmunologiques ou à la séparation de substances biologiques, telles que les bactéries.
Claims (10)
1.- Procédé de fixation de molécules. biologiques sur des supports magnétiques, caractérisé en ce qu'il consiste à mettre en contact une solution contenant les molécules biologiques à fixer avec un support magnétique sous forme de particules à base de polymères vinylaromatiques, le contact étant réalisé pendant un temps suffisant pour réaliser l'adsorption desdites molécules biologiques sur ledit support et à séparer de la solution le support biologique résultant.
2.- Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les polymères vinylaromatiques sont obtenus par polymérisation en suspension d'un composé vinylaromatique seul ou en mélange avec un monomère copolymérisable en présence d'un initiateur, d'un agent de suspension et d'une charge magnétique, ledit procédé étant caractérisé en ce que la charge magnétique est dispersée dans une solution d'homo-ou co-polymère dans le ou les monomères, puis la dispersion obtenue est mise en suspension dans l'eau et le ou les monomères sont polymérisés.
3.- Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que 1-e polymère vinylaromatique est un homopolymère ou un copolymère de styrène, d' d -néthylstyrè- ne, d'éthylstyrène ou de vinyltoluène.
4.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la solution de molécules biologiques est une solution dans un tampon approprié vis à vis des molécules biologiques.
5.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les molécules biologiques sont des protéines, des enzymes, des antigènes, des anticorps, des bactéries, virus, cellules.
6.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le temps de contact est de 1 nuit à 40C.
7.- Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les particules à base de polymère vinylaromatiques ont'une granulométrie inférieure à 3 mm, de préférence comprise entre 0,05 et 0,5 mm.
8.- Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, aux dosages immunoenzymatiques et radioimmunologiques ou par fluorimétrie.
9.- Application du procédé selon l'une que des revendications 1 à 7, à la séparation de substances biologiques, telles que les bactéries, les virus, les cellules, les antigènes et les anticorps.
10.- Application du procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, à la détection des anticorps, anti DNA, anti-Herpès, IgG de lapin, anti Candida Albicans.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR7921343A FR2463807A1 (fr) | 1979-08-24 | 1979-08-24 | Procede de fixation de molecules biologiques sur des supports magnetiques en particules a base de polymeres vinylaromatiques et ses applications |
Applications Claiming Priority (1)
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| FR7921343A FR2463807A1 (fr) | 1979-08-24 | 1979-08-24 | Procede de fixation de molecules biologiques sur des supports magnetiques en particules a base de polymeres vinylaromatiques et ses applications |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2463807A1 true FR2463807A1 (fr) | 1981-02-27 |
| FR2463807B1 FR2463807B1 (fr) | 1983-10-21 |
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