JPH03502247A - 高分子粒子への直接結合による単純ヘルペスウイルス抗原の測定方法及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 高分子粒子への直接結合による単純ヘルペスウィルス抗原の測定方法及びキット 技術分野 本発明は、単純ヘルペスウィルスの測定に有効な診断試験キット及び方法に関す る。より詳細には、本発明では、高分子小粒子への抗原の直接結合を利用して、 生物学的被検体中のウィルスの存在の指標として単純ヘルペスウィルス抗原を測 定する。

背景技術 近年、イムノアッセイは、感染症に罹っているかを検出するのに使用されるよう になった。このアッセイに有効であるためには、高度の信頼性をもって特定の生 体を検出しなければならない。はとんどの場合、これには、その生体に特有の抗 原を単離することと、その生体に特有の抗原と対応する抗体とを反応させること が必要である。試験が商業的に成功するには、比較的安価で、簡単に使用でき、 そして迅速であることも必要である。

イムノアッセイにより検出できるこのような生体の一つに、単純ヘルペスウィル スがある。ワクチン接種や種々の抗つイスル剤を用いた治療により種々のウィル スが抑制されることが多くなってきているが、単純ヘルペスウィルス（以下、ｒ Ｈ３ＶＪと称する）による感染は依然として重大な問題である。Ｈ３Ｖは、主に 口の周囲に生じる１型と、人体の性器の周辺に生じる２型の二つの型に分類され る。Ｈ３Ｖ感染から生じる重大な結果をもたらすのは、皮膚感染とウィルス脳炎 の二種類にすぎない。

単純ヘルペスウィルス感染の広範に広がる性質から、原因となるウィルスを検出 する迅速で、簡単で、そして信頼性のある試験法にかなりの関心が持たれている 。しかしながら、既知の診断法では、Ｈ３Ｖとはしばしば区別のできない類似の ウィルスがいくつかある。したがって、Ｈ３Ｖ−１又はＨ３Ｖ−２に有効な診断 試験は、これらのウィルスのみに特異的であり、そしてＥＢウィルス、サイトメ ガロウィルス、水痘−帯状庖疹ウィルス又は他のフローラ等のウィルスに対して 感受性があってはならない。

培養法、免疫電気泳動、酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬ　Ｉ　ＳＡ）及び凝 集アッセイ（例えば、米国特許第４，４３０．４３７号及び同４，６９５，５３ ７号、参照）をはじめとして、ウィルスを測定する種々の方法が開発された。

既存の方法の利点を有したまま、感度と精度が向上した固体支持体上で単純ヘル ペスウィルス抗原を直接検出するアッセイが当該技術分野において要望されてい る。

発明の開示 Ａ、単純ヘルペスウィルスから抽出された抗原を含有する疑いのある被検体を、 ヘルペスウィルス抗原と結合する能力を有する表面積が約０．１〜約６００ｍ” ７ｇ−粒子の高分子粒子と接触させ、 Ｂ、接触工程Ａの約１０分内に、粒子に結合した単純ヘルペスウィルス抗原をそ れに対する抗体と接触させて粒子上に免疫複合体を形成させ、 Ｃ６未複合化物質から結合複合体を分離し、そしてり、被検体中の単純ヘルペス ウィルスの存在の測度として複合体の存在を測定すること、を含んでなる単純ヘ ルペスウィルスの測定方法によって従来技術が改善される。

また、本発明によれば、 ａ、ヘルペスウィルス抗原と結合する能力を有しうる表面積が約０．１〜約６０ ０ｍ”７ｇ−粒子の高分子粒子、Ｃ０単純ヘルペスウィルス抗原に対する抗体、 を含んでなる単純ヘルペスウィルスの測定に有効な診断キットが提供される。

本発明の方法により、試験被検体中のＨ３Ｖの存在を測定するための、効率的で 、感度が高く、そして精度のよい手段が提供される。一般的にウィルス粒子から 抽出される単純ヘルペスウィルス抗原は、共有結合手段か吸着により小高分子粒 子に捕捉（又は結合）されるのでこれらの利点が得られる。

結合抗原を、次に、適当な抗体と複合化し、そして被検体中のウィルスの量の測 度として検出する。

高分子粒子は抗原捕捉に有効な表面積を有することから、この粒子により感度が 向上する。即ち、粒子は、約０．１〜約６００ｍ２／ｇ−粒子の表面積を有する 。好ましい態様では、粒子を、粒子を保持するとともに未複合化物質と流体を通 過させる微孔質膜と組み合わせて用いる。このような例では、抗原は、粒子と膜 との両方に結合させることができる。

図面の簡単な説明 図面は、以下に示す実施例１〜４に記載の比較アッセイの結果を示した棒グラフ である。グラフには、種々の高分子粒子（固体０．２重量％）及び微孔質膜に抗 原を捕捉させて行ったアッセイで得られた色素濃度（Ｄ、）が示されている。

発明を実施するための最良の形態 生物学的被検体中に存在する単純ヘルペスウィルスを本発明により検出できる。

生物学的被検体は、標準的な医学的手法及び微生物学的手法を用いて患者から得 ることができる。

生物学的被検体としては、例えば、患者の頚部、尿道、眼、咽喉又は肛門から得 られるスワブ検体及び滑液又は外傷からの液体等の体液が挙げられる。このよう にして得られた生物学的被検体は、測定すべき抗原を含んだＨ３Ｖ又はＨ３Ｖ感 染細胞を含有する疑いがある。

本発明は、ウィルスそのものまたは抽出ウィルス抗原を検出するのに使用できる 。さらに、無傷のウィルス感染細胞や無傷のウィルス感染細胞膜を溶解して、そ のウィルス粒子や抗原を放出することができる。ウィルスを効果的に溶解し、そ して十分な抗原を抽出して比較的短時間で高感度アッセイができることは有利で ある。

本発明で検出できる抗原は、Ｈ３Ｖ−１かＨ３Ｖ−２のいずれか一方か、あるい は両方の株に存在する。本発明により、糖タンパク質が抽出・検出されることが 好ましい。

抗原抽出は、超音波による生体の物理学的破砕、加熱又は遠心分離をはじめとす るいずれか適当な手法を用いて行うことができる。非イオン性又は陰イオン性界 面活性剤を用いる化学的抽出組成物も開発されてきた（例えば、米国特許第４゜ ６６１．３４９号及び同４，４３０，４３７号、参照）。

好ましい抽出組成物は、ｐＨが約８．５〜約１２で、一種以上のアルコールアミ ン又はその塩を少なくとも約０．０５モル濃度、好ましくは約０．１〜約１のモ ル濃度で含有する。

有効なアルコールアミンとしては、エタノールアミン、ジェタノールアミン、プ ロパツールアミン、トリエタールアミン及びそれらの塩（塩酸塩、硫酸塩、酢酸 塩、ピクリン酸塩及びシュウ酸塩等）が挙げられる。他のアルコールアミンは、 当業者には容易に明らかとなろう。アルコールアミンやそれらの塩混合物を、必 要に応じて用いることができる。

また、組成物は、アルキルフェノールと酸化エチレンとの縮合生成物である一種 以上の非イオン性界面活性剤も含んでいる。好ましいアルキルフェノールとして は、フェノールに炭素数１〜２０の線状又は分岐状アルキルを有する。オクチル フェノールが最も好ましい。一般的に、これらの化合物は、５〜約３５個のエチ レンオキシド基を有している。

他の有効な非イオン性界面活性剤としては、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（商標） （ローム・アンド・ハース社製）、例えば、トリトンＸ−１００（商標）及びト リトンＮ１０１（商標）か、ブリジヱ（Ｂｒｉｊ）の商品名で販売されているポ リオキシエチレンエーテル、トウィーン（Ｔｗｅｅｎ）の商品名（例えば、トウ ィーン−２０）で販売されているポリオキシエチレンソルビタン誘導体、及びタ ージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）の商品名（例えば、タージトールＮＰＸ及びタ ージトールＮＰ−７）で販売されているポリグリコールエーテルが挙げられるが 、これらには限定されない。他の有用な物質については、特に界面活性剤につい ての標準的な文献、マクカッチョンの乳化剤と洗浄剤（ＭｃＣｕｔｃｈｅ。

ｎ’ｓ　　Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　　ａｎｄ　　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）、１ ９８６年版、マクカッチョン・ディビジョン、パブリッシング社、米国ニューシ ャーシー州グレン・ロックを参照することにより当業者には容易に明らかとなろ う。

抽出組成物の第三の必須成分は、コール酸、その塩又は誘導体の一種以上である 。有用な物質としては、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、 デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸カリウム、コール酸アンモ ニウム及び当業者にとって容易に明らかとなる他の物質が挙げられるが、これら には限定されない。

抽出組成物には、陰イオン界面活性剤も含まれる。有用な陰イオン界面活性剤と しては、硫酸アルキルアニオン及びアルカリ金属（例えば、リチウム、ナトリウ ム又はカリウム）又はアンモニウムカチオンを含有する水溶性又は分散性化合物 が挙げられるが、これらには限定されない。ここで、上記アルキルは、炭素原子 数が約６〜２ｏのものである。アルキルは、炭素原子数６〜１２（線状又は分岐 状ヘキシル、オクチル、デシル、２−メチルヘキシル及びドデシル基等）のもの が好ましい。また、アリール核に炭素原子を６〜１０個有するアリールスルホン 又はその塩（上記したようなもの）も有効である。陰イオン界面活性剤の代表例 としては、ドデシル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸 ルビジウム、デシル硫酸ナトリウム、ヘキシル硫酸リチウム、オクチル硫酸カリ ウム及びデシル硫酸リチウムが挙げられる。

抽出組成物の重要な任意成分として、アルキル金属塩、アンモニウム塩又はアル カリ土類金属塩等の一種以上の無機塩がある。塩の代表例としては、塩化ナトリ ウム（最も好ましい）、塩化ナトリウム、塩化アンモニウム、塩化カルシウム、 硫酸アンモニウム、硫酸バリウム及び当業者にとって容易に明らかとなる他の物 質が挙げられるが、これらには限定されない。

抽出は、Ｈ３Ｖ又はＨ３Ｖ感染細胞を含有する疑いのある生物学的被検体を準備 し、そしてアッセイに適する状態で抗原を抽出することができる。一般的には、 抽出操作にががる時間は、１０分未満である。しがしながら、被検体によっては もっと長い時間が望まれるかも知れない。抽出に要する時間が約２分未満である ことが好ましい。接触は、一般的に、室温（即ち、１８〜２５°Ｃ）で行われる が、必要に応じて約４０°Ｃまでのより高い温度を使用してもよい。この目的の ために特別に設計した適当な抽出装置で抽出を行うことが好ましい。多数のこの ような装置が、米国特許第４．７４６，６１４号等の従来技術に示されている。

適当にインキュベーションした後、必要に応じて、抽出抗原を含有する溶液を適 当な酸で中和してｐＨを６〜８に減少させることができる。また、処理をして内 因性過酸化物を除去してもよい。抗原をＨ３Ｖ又はＨ３Ｖの細胞膜から抽出した ら、さらなる操作に附する前に、溶液を予備濾過して細胞砕片、粒状物質及び他 の望ましくない物質を除去することが望ましいが、これは必須ではない。予備濾 過は、ある種のフィルターを入れた適当な容器内で行うことができる。

抗原を含有する被検体は、抗原を結合状態にする高分子粒子と接触させる。この 接触は、水性懸濁液中で行ってもよいし、粒子を支持体上又は支持体中（微孔質 膜、ミクロタイタープレート又は当業者に周知の他の材料）に担持させて行って もよい。粒子は、一般的に、ポリエステルアイオノマー、ポリウレタン又はビニ ルポリマー等の水溶性高分子粒子である。

ポリマーは、ビニル芳香族（例えば、スチレン及びその誘導体）、アルキルアク リレート、アルキルメタクリレート及び当業者に容易に明らかである他のもの等 の水への溶解度が一般的に約１０％（ｗ　／　ｗ　）未満である疎水性ビニル付 加モノマーから製造するのが好ましい。他の例は、以下で説明すこれらの粒子は 、単位重量当たりの表面積が、抗原を十分に捕捉して所望のアッセイ感度を提供 できるものでなければならない。一般的には、この表面積は、約０．１〜約６０ ０ｍ”／ｇ−粒子、好ましくは約０．４〜約１２ｍ”／ｇ−粒子である。さらに 、これらの粒子は、抗原の結合を妨害する化学物質又は生物学的物質を実質的に 含有しないものである。

特に、粒子は界面活性剤を含有しない。抗原の捕捉は、吸着か、粒子の一部分で ある表面化学基との共有結合反応か、それらの組み合わせである。共有結合に対 する表面基は、反応性部分を形成するように粒子をある方法で処理して提供する か、好ましくは、表面基をポリマーを形成する単量体成分から粒子に組み込む。

粒子は、必要な表面積を有し、そして結合抗原・抗体複合体を未複合化物質から 分離できるようにアッセイで取り扱うことができる限りは、規則的形状でも、不 規則な形状であってもよい。即ち、形状は、球状、楕円状、立方体状又は不規則 形状でよい。好ましい形状は、球状ビーズである。このような高分子粒子は、一 般的に、平均粒度が約０．０１μｍを超え、好ましくは約０．１〜約１ＯｕＩ１ １である水不溶性ラテックス粒子である。

好ましい実施態様では、接触させるか、室温又はわずかに室温より高い温度で適 度にインキュベーションした後に抗原を容易に吸着するポリマーから製造する。

従来技術の材料で必要なことのある高温で長時間インキュベーションすることは 避けるのが望ましい。

別の実施態様では、粒子は、抗原の遊離アミン、カルボキシ又はスルフヒドリル 基に共有結合する表面反応性基を有する。代表的な表面反応性基としては、アル デヒド、ヒドラジド、活性ハロゲン、活性化２−置換エチルスルホニル及びビニ ルスルホニル基が挙げられるが、これらには限定されない。

特に有効な反応性基としては、活性ハロゲンとともに、活性エステル基、活性ハ ロゲン、活性化２−置換エチルスルホニル及びビニルスルホニル基が挙げられ、 活性化２−置換エチルスルホニル基が最も好ましい。

有効な高分子粒子は、以下でより詳細に説明するエチレン性不飽和重合性モノマ ーの一種から製造される。モノマーの少なくとも一種により、少なくとも粒子表 面に所望の反応性基が提供される。ある実施態様では、粒子は均質である。即ち 、粒子は、全体を通じて同じポリマーから構成されている。

他の実施態様では、粒子は、二種以上のポリマー、例えば、米国特許第４，４０ １，７６５号に記載されているコアー／シェル粒子、又は、例えば、米国特許第 ３，７００．０６９号に記載されているグラフトポリマーから構成されている。

活性ハロゲン原子を有する七ツマ−としては、クロロ酢酸ビニル、ブロモ酢酸ビ ニル、ハロアルキル化ビニル芳香族（例えば、クロロメチルスチレン又はブロモ メチルスチレン）、ハロアルキルアクリルエステル又はハロアルキルメタクリル エステル（例えば、クロロエチルメタクリレート、３−クロロ−２−ヒドロキシ プロピルメタクリレート及び３−クロロプロピルアクリレート）、Ｎ　　（３［ Ｎ’　　　（３−クロロプロピオニル）ウレイド］プロピル）メタクリルアミド 、４−（３−クロロプロピオ　ナミド）スチレン、４−ＥＮ’−（３−クロロプ ロピオニル）ウレイド］スチレン、２−（３−クロロプロビオナミド）エチルメ タクリレート、Ｎ−［３−（３−クロロプロピオナミド）プロピル］メタクリル アミド、Ｎ−（３−クロロアセタミドプロピル）メタクリルアミド、Ｎ−（２− クロロアセタミドエチル）メタクリレート、４−クロロアセタミドスチレン、４ −クロロアセタミドメチルスチレン、Ｎ−［３−（Ｎ’−クロロアセチルウレイ ド）プロピル］メタクリルアミド、Ｎ−［２−（Ｎ’−クロロアセチルウレイド ）エチル］メタクリルアミド、４−（Ｎ’−クロロアセチルウレイド）スチレン 、ｍ−（Ｎ“−クロロアセチルウレイドメチル）スチレン、ｐ−（Ｎ’−クロロ アセチルウレイドメチル）スチレン及び当業者に公知の他のモノマーが挙げられ る。活性ハロゲン原子を反応性基として使用するときには、ハロアルキル化ビニ ル芳香族、例えば、炭素原子数１〜３の活性ハロアルキル基を有するものが好ま しい。

クスロメチルスチレンが最も好ましい。

活性化２−置換エチルスルホニル及びビニルスルホニルモノマーは、下記式（Ｉ ）： で表すことができる。

上式中、Ｒは水素又はメチル、エチル、イソプロピル若しくはヘキシル等の置換 若しくは未置換アルキル（一般的に、炭素原子数１〜６個）である。Ｒは水素か 、メチルが好ましい。

Ｒ１は、−ＣＨ＝ＣＨＲ”か、　ＣＨ２ＣＨ２Ｘ　（咳式中、Ｘは、求核性基に より置換されるか、塩基（ハロ、アセトキシ、メチルスルホニルオキシ等のアル キルスルホニルオキシ、ｐ　−１−リルスルホニルオキシ等のアリールスルホニ ルオキシ、トリアルキルアンモニオ、例えば、トリメチルアンモニオ塩又はピリ ジニオ塩等）での処理によりＨＸの形態で除去される脱離基である）で表される 。Ｒ２は、水素、置換若しくは未置換アルキル（一般的にＲについて定義した炭 素原子数１〜６のもの）又は置換若しくは未置換アリール（フェニル、ナフチル 、キシリル又はトリル等の核炭素原子数が一般的に６〜１２個）である。Ｒ１は −ＣＨ，ＣＨ，Ｘが好ましい。

活性化２−置換エチル基であるこの基は、脱離基Ｘの置換に悪影響を及ぼさない いずれの基で置換してもよい。

Ｌは、結合基であり、この結合基は、一般的に炭素原子数１〜２０個で主鎖にペ テロ原子を有する置換又は未置換アルキレンであることができる。このアルキレ ンの定義では、オキシ、チオ、−ＮＲ’−（咳式中、Ｒ３は水素、炭素原子数１ 〜６の置換若しくは未置換アルキル（メチル、クロロメチル又は２−ヒドロキシ エチル等）か、炭素原子数６〜１０個の置換芳しくは未置換アリール（フェニル 、ナフチル又はキシリル等）である〕、エステル（−ＣＯＯ−）、アミド（−Ｃ スルホニル（−ＳＯＺ−＞、カーボネート、スルボンアミド、アゾ、ホスホノ又 は他の類似基で中断されているが、それを末端基とするアルキレン基を含むこと を意味する。アルキレン基の代表例としては、メチレン、エチレン、イソブチレ ン、ヘキサメチレン、カルボニルオキシエチレンオキシカルボニルエチレン、メ チレンビス（イミノカルボニル）エチレン、カルボニルオキシドデシレンヵルボ ニルオキシエチレン、カルボニルイミノメチレンイミノカルボニルイミノエチレ ン、カルボニルイミノメチレンイミノカルボニルエチレン及び米国特許第４．１ ６１，４０７号及び同４，５４８，８７０号に記載されているか、示唆されてい る他の基が挙げられる。

また、Ｌは、一般的に核炭素原子数が６〜１２個の置換又は未置換アリーレンで もよい。アリーレン基の代表例としては、フェニレン、トリレン、ナフチレン及 び上記した特許に記載の他のものが挙げられる。また、このしの定義では、上記 で定義したアルキレン及びアリーレン基の一種以上の組み合わせである二価の基 （例えば、アリーレンアルキレン、アルキレンアリーレンアルキレン及び当業者 によって容易に決定できる他のもの）だけでなく、一種以上のアミド又はエステ ル基（例えば、カルボニルイミノアリーレンアルキレン）により中断されている かそれが末端基となっているものの組み合わせも含まれる。好ましくは、Ｌは、 置換若しくは未置換フェニレンアルキレン〔例えば、一種以上のアルキル基（Ｒ について定義したようなもの）、アルコキシ基（一般的に炭素数１〜６、例えば 、メトキシ、プロポキシ又はブトキシ）又はハロ基で置換されているもの〕、カ ルボニルイミノアリーレンアルキレン（但し、アリーレンは上記で定義した通り である）又はカルボニルイミノアルキレンイミノカルボニルアルキレン（但し、 アルキレンは上記で定義した通りである）である。

存効なモノマーの代表例としては、ｍ及びｐ　−（２−クロロエチルスルホニル メチル）スチレン、ｍ及ヒｐ　−［２−（ｐ　−）リルスルホニルオキシ）エチ ルスルホニルメチル］スチレン、ｍ及びｐ−ビニルスルホニルメチルスチレン、 Ｎ−［ｍ及びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニルコアクリルア ミド及びＮ−［２−（２−クロロエチルスルホニル）エチルホルムアミドメチル コアクリルアミドが挙げられる。最初に挙げたモノマーが好ましい。

上記した七ツマ−の一種以上の組み合わせて重合してポリマーを形成することが できる。好ましくは、それらのうちの一種以上を本明細書に記載の少なくとも一 種以上の疎水性物質のエチレン性不飽和重合性七ツマ−と共重合する。一般的に 、このようなモノマーは、疎水性、分散性又は他の特徴等の種々の望ましい性質 を提供する。好ましいポリマーは、下記式（Ｉｒ）　ニ ー←Ａ　＋　Ｂ−ｈ−＋−Ｃ→−７−（ＩＩ）（上式中、−Ａ−は、一種以上の 疎水性エチレン系不飽和上ツマー由来の反復単位であり、 −Ｂ−は、上記した必要な反応性基を有する一種以上のエチレン性不飽和七ツマ ー由来の反復単位であり、そして−Ｄ−は、−Ａ−又は−Ｂ−で表されるものと は異なる一種以上のエチレン性不飽和七ツマー由来の反復単位である）により表 すことができる。

式（ｎ）において、Ｘは０〜約１００モル％であり、ｙは約０〜７０モル％であ り、そして２は０〜約２０モル％である。好ましくは、Ｘは約４５〜約１００モ ル％であり、ｙは約０〜７０モル％であり、そしてＺは０〜約１０モル％である 。

−Ａ−反復単位が誘導されるモノマーは、一般的な実施態様及び好ましい実施態 様の両方において、疎水性であり、そして水不溶性のホモポリマーを形成する。

これらのモノマーは芳香族基を有することが好ましい。疎水性モノマーの代表例 としては、スチレン及びスチレン誘導体（例えば、４−ビニルトルエン、２，５ −ジ−メチルスチレン、４−　ｔ−７”チルスチレン、２−クロロスチレン及び 他の当該技術分野において公知のもの）、アクリルエステル及びメタクリル酸エ ステル（例えば、ｎ−ブチルアクリレート、プロピルメタクリレート、メチルア クリレート、メチルメタクリレート、エチルメタクリレート、２−エチルへキシ ルメタクリレート、Ｎ−フェニルアクリルアミド及び他の当該技術分野において 公知のもの）、アクリロニトリル及びビニルアセテートが挙げられるが、これら には限定されない。

必要に応じてポリマーはいずれかの適当な方法で架橋できる。一つの方法は、二 種以上のエチレン系不飽和重合性基を有するモノマーを少量（約１０モル％以下 、好ましくは約０゜３〜約５モル％）含有せしめることである。これらのモノマ ーは、Ａが誘導される疎水性モノマーに含まれる。モノマーの代表例は、リサー チ・ディスクロージャー（Ｒｅｓｅａｒｃｈ　　Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅ）、パブ リケーション第１９５５１号、１９８０年７月、第３０４頁に記載されており、 例えば、ジビニルベンゼン、エチレンジメタクリレート、Ｎ。

Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド、２．２−ジメチル−１゜３−プロピレンジ アクリレート、アリルアクリレート、エチリデントリメタクリレート及びエチレ ンジアクリレートが挙げられる。しかしながら、このようなモノマーとの架橋は 、トレーサー物質を高分子粒子に吸収させるための好ましい手法で用いられる有 機溶媒によって生じるポリマー、とりわけコアー／シェルポリマーのコアーの膨 潤性を減少させる。従って、一般に、架橋は水不溶性を付与するのに必要とされ る程度の少量に限定される。

−Ａ−反復単位が誘導される好ましい七ツマ−は、ビニル芳香族モノマー、とり わけスチレン及びスチレン誘導体である。

−Ｂ−反復単位が誘導される七ツマ−は、上記した反応基を有するものである。

一〇−反復単位が誘導されるモノマーとしては、−Ａ−及び−Ｂ−が誘導される ものとは異なるモノマーが挙げられる。

具体的には、−Ｄ−反復単位は、粒子に水性分散安定性又は他を性質を付与する モノマー由来のものである。代表的なモノマーとしては、２−アクリルアミド− ２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、アクリル酸、メタクリル酸、２−カ ルボキシエチルアクリレート、スチレンスルホン酸カリウム塩等の陰イオンモノ マー、ｍ及びｐ−カルボキシメチルスチレン及び他のエチレン系不飽和重合性ス ルホネート、カルボキシレート、サルフェート及びホスホネート、２−ヒドロキ シエチルアクリレート及び２−ヒドロキシエチルメタクリレート等の他の疎水性 であるが非イオン性のモノマー並びに当業者にとって公知の他の七ツマ−が挙げ られるが、これらには限定されない。

−Ｄ一単位が誘導されるモノマーの好ましいものは、アクリル酸、メタクリル酸 、２−アクリルアミド−２−メチルプロパンスルホン酸ナトリウム、ｍ及びｐ− カルボキシメチルスチレン及びｐ−スチレンスルホン酸、カリウム塩である。

上記したモノマーから製造したポリマーの代表例としては、下記のものが挙げら れる：ポリ（ｍ及びｐ−クロロメチルスチレン）、ポリ（スチレンーコーｍ及び ｐ−クロロメチルスチレン−ツー２−ヒドロキシエチルアクリレート）（モル比 、６７：３０：３）、ポリ［スチレンーコーｍ及びｐ−（２−クロロエチルスル ホニルメチル）スチレン］（モル比、９５゜５：４．５）、ポリ（スチレン−］ −Ｎ−［ｍ及びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニルコアクリル アミド）　（モル比、９９．３二〇、７）、ポリ（ｍ及びｐ−クロロメチルスチ レンーコーメタクリル酸）（モル比、９５．５：５．９８：２及び９９．８：０ ．２）、ポリ（スチレンーコーｍ及びｐ−クロロエチルスルホニルメチルスチレ ンーコーメタクリル酸）（モル比、９３．５１．５：２）、ポリ（スチレンーコ ーＮ−［ｍ及びＰ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）フェニル〕アクリル アミドーコーメタクリル酸）　（モル比、９７．３：Ｑ、７：２）、ポリ（スチ レンーコーｍ　及ヒｐ−クロロメチルスチレン）（モル比、７０：３０）、ポリ （スチレンーコービニルベンジルクロＩＪ　Ｆ−コーアクリル酸）（モル比、８ ５：１０：５）、ポリ（スチレンーコーアクリル酸）（モル比、９９：１）、ポ リ（スチレンーコーメタクリル酸）（モル比、９０：１０）、ポリ（スチレンー コーアクリル酸−コーｍ及びｐ−ジビニルベンゼン）（モル比、８９：１０：１ ）、ポリ（スチレン−ヨー２−カルボキシエチルアクリレート）（モル比、９０ ：１０）、ポリ（メチルメククリシートーコーアクリル酸）（モル比、９５：５ ）、ポリ（スチレン）及びポリ（スチレンーコ−ｎ　−プチルアクリシートーコ ーメタクリル酸）（重量比、４５：４５：１０）。

高分子粒子は、乳化重合（バッチ、半連続及び連続を含む）、縮合重合及び懸濁 重合、グラフト共重合及びポリマー化学の技術分野の当業者に公知の他の手法を はじめとするいずれかの適当な重合法を用いて製造できる。重合法は、縮合重合 体か付加重合体かの所望のポリマーの種類にって異なる。乳化重合は、例えば、 米国特許第４．４１５，７００号及びリサーチ・ディスクロージャー、パブリケ ーション第１５９６３号（１９７７年７月号）に記載されているように、界面活 性剤や乳化剤を使用しないで粒子を生成できるので、エチレン系不飽和重合性モ ノマーからポリマーを製造するのに好ましい。リサーチ・ディスクロージャーは 、英国のハンプシャー州ＰＯＩＯ７ＤＤ、エムスワース、ザ・オールド・ハーバ ーマスダーズ　８ノースストリート（Ｔｈｅ　　Ｏｌｄ　　Ｈａｒｂｏｕｒｍａ ｓｔｅｒ’　　ｓ、８Ｎｏｒｔｈ　　５ｔｒｅｅｔ。

Ｅｍｓｗｏｒｔｈ、Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ　　Ｐｏ１ｏ　　７ＤＤ）にあるケニス ・マソン・パブリケーション・リミテッド（Ｋｅｎｎｅｔｈ　　Ｍａｓｏｎ　　 Ｐｕｂｉｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｌｔｄ、）から入手できる刊行物である。連続乳化 重合は、上記したリサーチ・ディスクロージャーに記載されているように最も好 ましい手法である。製造法の他の詳細な事項については、米国特許第４，１６１ ．４０７号及び４，５４７．８７０号に記載されている。

段階乳化重合を用いて、二種の異なるポリマーから構成されるコアー・シェルポ リマーを生成できる。コアーの乳化重合は、反応体を連続的に標準条件下で反応 容器に添加することにより実質的に終点まで進められる。次に、シェルポリマー を製造するのに必要なモノマー及び触媒を、コアーポリマーのラテックスの入っ た容器に連続的に添加する。この方法では、シェルは、コアモノマーとシェルモ ノマーとの混合物ではなく、限定的な既知の組成を有している。

抗原と粒子との接触のほとんど直後に、抗原は粒子に結合する。結合は「直接（ ｄｉｒｅｃｔｌｙ）」に生じる。このことは、抗原が、支持体に付着している結 合性生物学的化合物（抗体等）を介しては結合していないことを意味している。

次に、接触の約１０分以内、好ましくは約２分以内に、結合抗原を、単純ヘルペ スウィルス抗原の適当な抗体（又はその混合物）と接触させて、支持体上に免疫 複合体を形成する。

好ましくは、使い捨て試験装置を用いてアッセイを行い、そして粒子を、抗原が 粒子に結合するにつれて流体と被検体中の未複合化物質を通過させることのでき る微孔質膜とともに使用する。

アッセイを行うことができ、そして全ての流体を収容することのできる使い捨て 試験装置に微孔質膜を嵌め込むことが好ましい。試験装置の有効な形状は、米国 特許第３．８２５゜４１０号、同３，８８６．６２９号、同３，９７０．４２９ 号及び同４，４４６，２３２号をはじめとして当該技術分野において公知である 。特に有効な装置が、ヨーロッパ特許公開第０２８０５５８号に記載されている 。このような装置には３個の試験ウェルがついており、各ウェルには、試験結果 だけでなく、正対照及び負対照の結果を得るための微孔質膜がついている。膜は 、一般的に、たとえ粒度が膜の孔径よりも小さくても、抗原が結合している粒子 を除く全ての物質が通過できる平均孔径を有するものである。一般的に、平均孔 径は、約約０．１〜約２０μｍ、好ましくは約１〜約１０μｍである。この膜の 孔径は、膜を通過する流体の流量が最大であり、膜を通過する粒子が最小となる ように選択される。

このアッセイで使用される抗体は、購入又は公知の方法を用いて調製できるポリ クローナルでもモノクローナルでもよい。好ましい抗体はモノクローナルで、且 つＨ３Ｖ−１及びＨ３Ｖ−２の両方に由来する垢タンパク質に対して反応性のも のである。このような抗体の一つは、モノクローナルで、且つハイブリドーマ細 胞系２８３−２　Ａ　Ｉ−Ｉ　Ｄ　４−２　Ｃ３（ＡＴＣＣ寄託第ＨＢ−９５８ ４号）から標準的手法を用いて得られる。

好ましい実施態様では、抗原に対する抗体を標識して検出する。有用な標識が当 該技術分野において公知であり、適当な手法及び装置を用いて直接検出できる化 学的化合物又は生物学的化合物だけでなく、さらなる化学的又は特異的結合反応 により検出可能な種を生成して検出することができる化合物が挙げられる。有用 な標識としては、例えば、ラジオアイソトープ、酵素、螢光化合物、化学発光化 合物、リン光性化合物、ビオチン又はその誘導体、アビジン又はその誘導体、フ ェリチン、磁性粒子、染色粒子及び当業者にとって容易に明らかとなる他の標識 が挙げられる。ラジオアイソトープ又は酵素が好ましい標識である。標識は、公 知の手法を用いて抗体に付着できる。標識が直接検出可能でない場合には、反応 生成物又は特異的結合生成物を検出可能にするのにさらに試薬又は化合物が必要 となる。例えば、もし標識がビオチンならば、酵素と複合化して検出可能な種を 生成するするアビジンと反応できる。標識が、グルコースオキシダーゼ、ウレア ーゼ、パーオキシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ等の酵素の場合、基質及び 色素生成試薬も必要である。ペルオキシダーゼとアルカリ性ホスファターゼが特 に有用である。

特に好ましい実施態様では、標識がペルーオキシダーゼであり、そしてアッセイ のある時点で、過酸化水素及び適当な色素生成試薬を添加して、検出可能な色素 を生成する。有用な色素生成試薬としては、例えば、テトラメチルベンジジン及 びその誘導体、並びにトリアリールイミダゾールロイコ染料等のロイコ染料（米 国特許第４，０８９，７４７号に記載されているようなもの）、又はペルオキシ ダーゼ及び過酸化水素の存在下で反応して色素を生成する他の化合物（即ち、ペ ルオキシダーゼの触媒作用で反応して色素を生成する化合物）が挙げられる。

別の実施態様では、Ｈ５Ｖ抗体を標識せず、そして形成され支持体に結合した抗 体−抗原複合体を、Ｈ３Ｖ抗体に特異的で検出のために適当に標識した（上記し た方法で）第二抗体Ｃ以下で説明する）を用いて行う。

アッセイで用いる抗体は、支持体上での非特異的相互作用を減少させる一種以上 のブロッキングタンパク質との混合物の形態で供給できる。有用なタンパク質は 周知であり、例えば、カゼイン、α−カゼイン、ウシ胎児血清及びブタガンマグ ロブリンが挙げられる。有用なブロッキング組成物の一つは、非免疫ブロッキン グタンパク質及び両性界面活性剤を含有している。支持体に結合した免疫複合体 の生成を早めるために、抗体と抗原を、一般的に、約１５〜約３０　”Ｃの温度 で１０分以下インキュベーションする。このインキュベーションハ、室温で（即 ち、１８〜２５℃）で５分以下行うことが好ましい。

インキュベーション後で且つ抗体と抗原の接触の約１０分以内に、結合複合体を 一回以上、りん酸緩衝液又は非イオン性界面活性剤の緩衝液等の緩衝洗浄液で洗 浄する。特に有用な洗浄液は、ｐＨが高く、そしてアッセイのバックグランドを 有利に低下させるものである。このような洗液は、粒子に結合した複合体から未 複合物質と被検体の破砕片を分離するのに有利に使用される。好ましくは、未複 合物質を洗浄して本明細書に説明されている微孔質膜を通過させる。

Ｈ３Ｖ抗体が標識されている場合について上記で説明した実施態様では、洗浄後 のアッセイ手法として、適当な試薬を添加後に標識を直接又は間接的に検出する 。これは、結合複合体を洗浄後に比較的迅速になされる。必要に応じて、試薬に 悪影響がなければ、インキュベーションを行って検出を早めてもよい。次に、適 当な時間のあとに、標準装置と標準手法を用いて標識を検出する。

Ｈ３Ｖ抗体が未標識の場合、結合を洗浄後、未標識抗体に対する抗体と接触させ る。この第二抗体（即ち、抗抗体）を、上記した標識のいずれかで適当に標識し 、そして上記したブロンキング組成物とともに供給することができる。抗体は、 モノクローナルでもポリクローナルでもよく、そして購入したものでも、公知の 手法で調製したものでもよい。

この接触後、得られる粒子に結合した抗原−抗体−抗体複合体を約１０分以下、 約１５〜約３０″Ｃの温度でインキュベージジンする。インキュベーションは、 室温で約５分以下行うことが好ましい。

さらなる洗浄を行って未複合物質を除去し、そして適当な酵素基質又は他の必要 な試薬を添加して検出可能な種を生成する。結合抗原−抗体−標識抗体複合体は 、次に、標準的なラジオメトリック、比色法、螢光法又は他の検出法を用し）で 支持体上で検出する。

本発明の診断キットは、少な（とも下記の要素を含んでいる： ａ、ヘルペスウィルス抗原と結合する能力を有しうる表面積が約０．１〜約６０ ０ｍ”／ｇ−粒子の高分子粒子と、ｂ、抗原が結合した粒子の膜通過を防止でき る平均細孔径を有する微孔質膜を含んでなる使い捨て試験装置と、ならびに ｃ、単純ヘルペスウィルス抗原に対する抗体。

このキットは、必要に応じて、洗浄液、抽出組成物、酵素基質又は色素生成組成 物、抗抗体組成物、ピペット、試験管、使用説明書又はアッセイを行うのに通常 使用する他の試薬及び装置をはじめとする他の材料を含むことができる。

粒子は、粉末でキットに供給することができるが、適当な緩衝液か分散剤を含有 する水性懸濁液で供給することが好ましい。

下記の材料、組成及び溶液を実施例で使用した。実施例は本発明を説明するため のものであって、本発明は実施例には限定されない。

筑潜【口」袈 単純ヘルペスウィルスに対するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細 胞を、ケーラー（Ｋｏｈｌｅｒ）等〔ネーチ＋−（Ｎａ　ｔｕｒｅ）、２５６． ４９５〜４９７（１９７５））に記載されている公知の手法を用いて調製した。

Ｈ３Ｖ−１とＨ３Ｖ−２との両方に共通の糖タンパク質の抗原決定基に対して反 応性のあるモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系が生じた。この ハイブリドーマ細胞系は、ＡＴＣＣ第ＨＢ−９６８４号として寄託した。

捉凰■閤製 正対照として使用するための抗原を調製するために、Ｈ３Ｖ−１株ＦとＨ３Ｖ− ２株Ｇを別々にＨＥＰＧ−２細胞（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ−２３号）中で成長させた 。感染細胞は、低速遠心分離でペレット化した。ペレットを、コレツクス（Ｃｏ ｒｅｘ）管中で、１５ｄの容量までりん酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。再懸濁 細胞を超音波破砕し、アミノメチルトリオキサジン（５００ｍｇ／ｄ）に１５分 間暴露後、一定に攪拌しながら紫外線を１５分間照射した。

試験装置の正対照ウェルにはＨ３Ｖ−１抗原及びＨＳ　Ｖ　−２抗原（ＵＶ不活 性化及び洗浄剤で溶解したもの）が入っており、ウシ胎児血清アルブミン（０， １重量％）と親水性ポリクローナル（５重量％）との混合物の形態で試験ウェル の濾過膜に取り込まれている。

汎生枝金生■且袈 単純ヘルペスウィルスに対するモノクローナル抗体を、ヨシタケ等、ユーロ・ジ ェイ・バイオケム（Ｅｕｒ、　　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１０１．３９５　（ １９７９）に記載されている方法を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ〔マイ ルス・ラボラトリーズ（Ｍｉｌｅｓ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））に結合さ せた。得られた結合体を、α−カゼイン（０，５重量％）、トウィーン２０非イ オン性界面活性剤（０，１重量％）、チメロサール防腐剤（０，０１重量％）及 びｐ−メトキシフェノール（１００モル濃度）を含有するブロッキング組成物と 混合後、無菌濾過した。この溶液の最終抗体濃度は１６５μｇ／ｄであった。こ れをウシ血清アルブミン（１重量％）とともに保存した。

ロイコ　２ この組成物は、過酸化水素（モル濃度１０）、２−（４−ヒドロキシ−３−メト キシフェニル）−４，５−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾールロイコ染 料（０，００５重量％）、ポリ（ビニルピロリドン）（１重１％）、４°−ヒド ロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）及びジエチレントリアミン五酢酸（１ ０ミリモル濃度）を含有するものであった。

洗企丘 トリトン（商標）Ｘ−１００非イオン性界面活性剤（０゜１重量％）、エタノー ルアミン塩酸塩（０，２６モル濃度）及び防腐剤（０，０１重量％）を含有し、 １２Ｎ水酸化ナトリウムでＰＨを１０．７５に調整した洗浄水溶液を調製した。

釉上ｌ旧え粗 下記の成分を水中で混合することにより抽出組成物を調製した二ノニデットＮＰ −４０（Ｎｏ　ｎ　ｉ　ｄ　ｅ　ｔ　　ＮＰ−４０）非イオン性界面活性剤（５ 重量％）、デオキシコール酸ナトリウム（０，２重量％）、エタノールアミン塩 酸塩（０，２６モル濃度）及びドデシル硫酸ナトリウム陰イオン界面活性剤（０ ，１重量％）。この組成物のｐＨを１２Ｎ水酸化ナトリウムで９に調整した。

ん　　衛生　　ａ この溶液（モル濃度０．０５）は、塩化ナトリウム（モル濃度０．１５）、りん 酸二水素ナトリウム（モル濃度０．０１）及びりん酸水素ナトリウム（ｐＨ７， ２、モル濃度０゜０４）から調製した。

ブロッキング α−カゼイン（０，５重量％）、トウィーン２０（０，１重量％）、Ｐ−メトキ シフェノール（１００ミリモル濃度）及び防腐剤（０，０１重量％）を含有する 水性ブロッキング組成物を調製した。

３個の試験ウェルを有する使い捨て試験装置をアッセイに用いた。この試験装置 の各試験ウェルには、未塗布ナイロン微孔質膜〔バイオダインＡ（Ｂｉｏｄｙｎ ｅ　　Ａ）（商標）〕が付いている。

透光ヱ豆ヱ■旧製 下記に概略記載した３つの溶液を、下記の割合で、８０°Ｃの脱酸素化水の入っ た１３６５ｍの容器に連続的に添加した。

溶液１：スチレン（７３９ｇ）、ｍ及びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチ ル）スチレン（８２ｇ）及び１−ドデカンチオール（８，２ｇ）を２．５ｇ／分 で３８０分かけて添加。

溶液２：過硫酸アンモニウム（１９，７ｇ）及び蒸留脱酸素化水（１１５２ｇ） を２．１４ｇ／分で３８０分かけて添加。

溶液３：メタ亜硫酸水素ナトリウム（９，９ｇ）及び蒸留水（１１５２ｇ）を２ ．２７ｇ／分で３８０分かけて添加。

３８０分後、反応を停止して、固形分子３３．４％のラテックス約１２１８ｇを 得た。このラテックスを３日間透析して、固形分２７．３％でｐＨ５のラテック スを得た。このラテックスを希釈して固形分１３．５％とした。ＮＭＲ分析によ り、スチレンと第二モノマーとのモル比が９６：４であることを確認した。得ら れたポリ［スチレンーコーｍ及びｐ　−（２−クロロエチルスルホニルメチル） スチレン］（モル比、９５．５：４．５）のラテックス粒子の平均直径（及び表 面積）を透過電子顕微鏡で測定したところ、約２．１μｔｓ　　（２゜８６ｍ” ／ｇ）であった。

ポリスチレン、ポリ（スチレン−ヨーｎ−ブチルアセテート）（モル比、８３： １７）及びポリ（スチレンーコーｍ及びｐ−クロロメチルスチレン）（モル比、 ７７：２３）を同様にして調製したところ、平均直径（及び表面積、ｍ”／ｇ） は、１．６μｔａ　　（３，７５）、２．５μｍ　　（２，４０）及び１．９μ ｍ　　（３，１５）であった。

実施例１〜４ ′ヘルペスウィルスのアッセイ これらの実施例では、抽出単純ヘルペスウィルス抗原を結合させるために４種の 異なる高分子粒子をア・ノセイに用いて本発明を実施する。

りん酸緩衝生理食塩水（０，１ｍｇ／＃＋１２ウシ血清アルブミン含有）で１＝ ８０に希釈しＨ３Ｖ細胞溶解液（上記したもの、４μ２）を、さらにりん酸緩衝 生理食塩水（６４μ２）中で混合してＨ３Ｖ抗原を含有する被試験試料を調製し た。

りん酸緩衝液のみのものを対照試料（６８μりとして使用した。

被試験試料と対照試料の両方を、抽出組成物（９３２μりと室温で５分間混合し た。試験ウェルに添加した最終抗原の希釈率は１：２０，０００であった。使い 捨て試験装置のこれらの試験ウェルの全てをアッセイに用いた。被試験試料と対 照試料を、非イオン性界面活性剤を塗工した１０μ！フイルターをにより予備濾 過後、ナイロン微孔質膜の入った試験装置の試験ウェルに添加した。Ｈ３Ｖ抗原 は、直ちに膜に結合した。

試験ウェルを、上記した洗浄液（２００μ℃）で洗浄後、過酸化水素溶液（５％ 溶液１２０μＩ！、）を添加した。第二洗浄（２００μりを行った。

ブロッキング溶液に含有させたペルオキシダーゼ標識抗ＨＳＶ複合体（４０μｌ ）を試験ウェルに添加後、室温で５分間インキュベーションした。２回洗浄（各 ２００μＥづつ）後、ロイコ染料生成組成物（８０μＩｌ）を各ウェルに添加し た。さらに室温で５分間インキュベーション後、アジ化ナトリウムを添加（０， １重量％）して色素生成反応を停止させ、そして各膜上の色素濃度を透過濃度（ ｄｅｎｓｉｔｙ　　ｔｒａｎｓｍｉｔｔａｎｃｅ）（ＤＴ）により測定した。

また、この手法を、抗原結合用高分子粒子を用いて行った。

使用した粒子は以下のものであった。

実施例１　：ポリ（スチレンーコーｍ及びｐ−クロロメチルスチレン 実施例２：ポリ（スチレン） 実施例３：ポリ（スチレン−ツーｎ−ブチルアクリレート）実施例４：ポリ［ス チレンーコーｍ及びｐ−（２−クロロエチルスルホニルメチル）ステ１フ１ 粒子の水性懸濁液（０，２重量％）を、抽出抗原を添加する前に試験装置の試験 ウェルに添加し、そして上記のアッセイを行った。

これらのアッセイの結果を図に示す。図から明らかなように、膜結合のみ（対照 ）と比較して、抗原結合用粒子を用いたときに感度が向上した。

以上、本発明を好ましい実施態様を参照しながら詳細に説明したが、本発明の精 神及び範囲内で変更及び修正ができることが理解されるであろう。

アッセイ 手続補正書 平成３年２月１２日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　　９０１００６０６ ２、発明の名称 ルス抗原の測定方法及びキット ３、補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　イーストマン　コダック　カンパニー４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１ｏ号（外　４　名） ５、補正の対象 （１）受託証 （２）ＡＴＣＣカタログ （３）請求の範囲 ６、補正の内容 （１）、（２）別紙の通り （３）請求の範囲を別紙のとおり補正する。

７、添付書類の目録 （１）受託証　　　　　　　　　　写　１通（２）ＡＴＣＣカタログ　　　　　 写　１通（３）請求の範囲　　　　　　　　　　１通請求の範囲 １、Ａ、単純ヘルペスウィルス抗原を含有する疑いのある被検体を、単純ヘルペ スウィルス抗原と結合する能力を有する表面積が約０．１〜約６００ｍ”　／　 ｇ−粒子の高分子粒子と接触させ、 Ｂ、接触工程Ａの約１０分内に、粒子に結合した単純ヘルペスウィルス抗原をそ れに対する抗体と接触させて粒子上に免疫複合体を形成させ、 Ｃ０未複合化物質から結合複合体を分離し、そしてり、被検体中の単純ヘルペス ウィルスの存在の測度として複合体の存在を測定すること、を含んでなる単純ヘ ルペスウィルスの測定法。

λ　前記結合複合体が、使い捨て試験装置内の微孔質膜であって、前記抗原が結 合した粒子がその膜を通過することを妨げる平均細孔径を有する膜を使用して未 複合化物質から分離される請求項１記載の方法。

３、前記膜の平均孔径が約０．１〜約２０ｔ１ｍである請求項２記載の方法。

４、前記単純ヘルペスウィルス抗体を標識して検出する請求項１記載の方法。

５、前記単純ヘルペスウィルス抗体が酸素で標識されており、そして前記酵素の 基質を含んでなる色素生成組成物を用いて前記複合体を測定する請求項４記載の 方法。

６、前記単純ヘルペスウィルス抗体が未標識であり、そして前記単純ヘルペスウ ィルス抗体に向けられる酵素標識抗体を用いて前記免疫複合体を測定する請求項 １記載の方法。

７．前記粒子が、疎水性エチレン系不飽和付加モノマーから調製したポリマーか ら構成される請求項１記載の方法。

８、前記高分子粒子が、前記単純ヘルペスウィルス抗原と共有結合的に反応でき る表面基を有する請求項１記載の方法。

９、前記表面基が、活性ハロゲン、活性化２−置換エチルスルホニル及びビニル スルホニル基から選ばれる請求項８記載の方法。

１０、　Ａ、生物学的被検体中の単純ヘルペスウィルスから抗原を抽出し、 Ｂ、前記抽出抗原を、約０．１〜約６００ｍ”　／　ｇ−粒子の平面積を有する 高分子粒子であって、実質的に界面活性剤を含まずそしてそれに結合された単純 ヘルペスウィルスを有することができ、かつ平均孔径が約０．１〜約２０μｍの 微孔質膜と組み合わさった粒子と接触させ、 Ｃ０前記接触工程Ａの約２分内に、前記粒子に結合した単純ヘルペスウィルス抗 原をその抗体と接触させて粒子上に免疫複合体を形成させ、 Ｄ、未複合化物質を洗浄して前記膜を通過させることにより前記結合複合体を未 複合化物質からを分離し、そしてＥ、前記被検体中の単純ヘルペスウィルスの存 在の測定として前記複合体の存在を測定すること、を含んでなる単純ヘルペスウ ィルスの測定法。

１１、前記単純ヘルペスウィルス抗体を標識して検出する請求項ＩＯ記載の方法 。

１２、前記単純ヘルペスウィルス抗体が酸素で標識されており、そして前記酸素 の基質を含有する色素生成組成物を用いて前記複合体を測定する請求項１１記載 の方法。

１３、前記酸素がペルオキシダーゼであり、そして前記色素生成組成物がペルオ キシダーゼと過酸化水素の存在下で色素を生成するロイコ染料を含んでなる請求 項１２記載の方法。

１４、前記抗体が酸素標識されている請求項ユ記載の方法。

１５、前記高分子粒子が、前記単純ヘルペスウィルス抗原と共有結合的に反応で きる表面基を有する請求項１０記載の方法。

１６、前記表面基が、活性ハロゲン、活性化２−置換エチルスルホニル及びビニ ルスルホニル基から選ばれる請求項１５記載の方法。

１７、ａ、ヘルペスウィルス抗原と結合する能力を有する表面積が約０．１〜約 ６００＋＊２／　ｇ−粒子の高分子粒子と、ｂ、抗原が結合した粒子の通過を防 止できる平均孔径を有する微孔質膜を含んでなる使い捨て試験装置、ならびにＣ ０単純ヘルペスウィルス抗原に向けられる抗体を、含んでなる単純ヘルペスウィ ルスの測定に有効な診断キット。

１８、前記抗体が酸素標識されている請求項１７記載の方法。

１９、前記抗体が未標識であり、そして前記キットがさらに前記単純ヘルペスウ ィルス抗体に対する標識抗体を含む請求項１７記載のキット。

２０、前記試験装置が３個の試験ウェルを含み、各ウェルにはポリアミドから調 製した微孔質膜が取りつけられている請求項１７記載のキット。

２１、前記高分子粒子が前記試験装置の微孔質膜上に供給される請求項１７記載 のキット。

２２、前記高分子粒子が水性懸濁液で供給される請求項１７記載のキット。

国際調査報告 ＋ｍ−−＋１−−＋ａｅｏ＋「ａ−ｈ−＊−ＰＣＴ／ＵＳ９０１００６０６国際 調査報告

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．Ａ．単純ヘルペスウイルス抗原を含有する疑いのある被検体を、単純ヘルペ スウイルス抗原と結合する能力を有する表面積が約０．１〜約６００ｍ２／ｇ− 粒子の高分子粒子と接触させ、 Ｂ．接触工程Ａの約１０分内に、粒子に結合した単純ヘルペスウイルス抗原をそ れに対する抗体と接触させて粒子上に免疫複合体を形成させ、 Ｃ．未複合化物質から結合複合体を分離し、そしてＤ．被検体中の単純ヘルペス ウイルスの存在の測度として複合体の存在を測定すること、を含んでなる単純ヘ ルペスウイルスの測定法。
2. ２．前記結合複合体が、使い捨て試験装置内の微孔質膜であって、前記抗原が結 合した粒子がその膜を通過することを妨げる平均細孔径を有する膜を使用して未 複合化物質から分離される請求項１記載の方法。
3. ３．前記膜の平均孔径が約０．１〜約２０μｍである請求項２記載の方法。
4. ４．前記単純ヘルペスウイルス抗体を標識して検出する請求項１記載の方法。
5. ５．前記単純ヘルペスウイルス抗体が酵素で標識されており、そして前記酵素の 基質を含んでなる色素生成組成物を用いて前記複合体を測定する請求項４記載の 方法。
6. ６．前記単純ヘルペスウイルス抗体が未標識であり、そして前記単純ヘルペスウ イルス抗体に向けられる酵素標識抗体を用いて前記免疫複合体を測定する請求項 １記載の方法。
7. ７．前記粒子が、疎水性エチレン系不飽和付加モノマーから調製したポリマーか ら構成される請求項１記載の方法。
8. ８．前記高分子粒子が、前記単純ヘルペスウイルス抗原と共有結合的に反応でき る表面基を有する請求項１記載の方法。
9. ９．前記表面基が、活性ハロゲン、活性化２−置換エチルスルホニル及びビニル スルホニル基から選ばれる請求項８記載の方法。
10. １０．Ａ．生物学的被検体中の単純ヘルペスウイルスから抗原を抽出し、 Ｂ．前記抽出抗原を、約０．１〜約６００ｍ２／ｇ−粒子の平面積を有する高分 子粒子であって、実質的に界面活性剤を含まずそしてそれに結合された単純ヘル ペスウイルスを有することができ、かつ平均孔径が約０．１〜約２０μｍの微孔 質膜と組み合わさった粒子と接触させ、Ｃ．前記接触工程Ａの約２分内に、前記 粒子に結合した単純ヘルペスウイルス抗原をその抗体と接触させて粒子上に免疫 複合体を形成させ、 Ｄ．未複合化物質を洗浄して前記膜を通過させることにより前記結合複合体を未 複合化物質からを分離し、そしてＥ．前記被検体中の単純ヘルペスウイルスの存 在の測度として前記複合体の存在を測定することを、を含んでなる単純ヘルペス ウイルスの測定法。
11. １１．前記単純ヘルペスウイルス抗体を標識して検出する請求項１０記載の方法 。
12. １２．前記単純ヘルペスウイルス抗体が酵素で標識されており、そして前記酵素 の基質を含有する色素生成組成物を用いて前記複合体を測定する請求項１１記載 の方法。
13. １３．前記酵素がペルオキシダーゼであり、そして前記色素生成組成物がペルオ キシダーゼと過酸化水素の存在下で色素を生成するロイコ染料を含んでなる請求 項１２記載の方法。
14. １４．前記抗抗体が酵素標識されている請求抗１４記載の方法。
15. １５．前記高分子粒子が、前記単純ヘルペスウイルス抗原と共有結合的に反応で きる表面基を有する請求項１０記載の方法。
16. １６．前記表面基が、活性ハロゲン、活性化２−置換エチルスルホニル及びビニ ルスルホニル基から選ばれる請求項１５記載の方法。
17. １７．ａ．ヘルペスウイルス抗原と結合する能力を有する表面積が約０．１〜約 ６００ｍ２／ｇ−粒子の高分子粒子と、ｂ．抗原が結合した粒子の通過を防止で きる平均孔径を有する微孔質膜を含んでなる使い捨て試験装置、ならびにｃ．単 純ヘルペスウイルス抗原に向けられる抗体を、含んでなる単純ヘルペスウイルス の測定に有効な診断キット。
18. １８．前記抗体が酵素標識されている請求項１７記載の方法。
19. １９．前記抗体が未標識であり、そして前記キットがさらに前記単純ヘルペスウ イルス抗体に対する標識抗体を含む請求項１７記載のキット。
20. ２０．前記試験装置が３個の試験ウエルを含み、各ウエルにはポリアミドから調 製した微孔質膜が取りつけられている請求項１７記載のキット。
21. ２１．前記高分子粒子が前記試験装置の微孔質膜上に供給される請求項１７項記 載のキット。
22. ２２．前記高分子粒子が水性懸濁液で供給される請求項１７記載のキット。