JPH03502248A - アッセイ用水性洗浄液、診断試験キット及び単純ヘルペスウイルスの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 洗浄組成物、試験キット及び単純ヘルペスウィルス抗原を測定するためのそれら の使用 技術分野 本発明は、洗浄溶液及び単純ヘルペスウィルスの検出へのその使用に関する。特 に、この溶液は、抗原とその抗体との複合体から未複合化物質を分離することに より単純ヘルペスウィルス抗原を検出するのに使用される。本発明は、診断法に 有用である。また、本発明は、洗浄溶液を含んでなる診断試験キットに関する。

背景技術 近年、イムノアッセイは、感染症に罹っているかを検出するのに使用されるよう になった。このアッセイに有効であるためには、高度の信頼性をもって特定の生 体を検出しなければならない。はとんどの場合、これには、その生体に特有の抗 原を単離することと、その生体に特有の抗原と対応する抗体とを反応させること が必要である。試験が商業的に成功するには、比較的安価で、簡単に使用でき、 そして迅速であることも必要である。

イムノアッセイにより検出できるこのような生体の一つに、単純ヘルペスウィル スがある。ワクチン接種や種々の抗つィスル剤を用いた治療により種々のウィル スが抑制されることが多くなってきているが、単純ヘルペスウィルス（以下、ｒ Ｈ３Ｖ」と称する）による感染は依然として重大な問題である。Ｈ３Ｖは、主に 口の周囲に生じる１型と、人体の性器の周辺に生じる２型の二つの型に分類され る。Ｈ３Ｖ感染から生じる重大な結果をもたらすのは、皮膚感染とウィルス脳炎 の二種類にすぎない。

Ｈ３Ｖ感染の広範に広がる性質から、原因となるウィルスを検出する迅速で、簡 単で、そして信頼性のある試験方法にかなりの関心が持たれている。しかしなが ら、既知の診断法では、Ｈ８Ｖとは区別のできない類似のウィルスがいくつかあ る。したがって、Ｈ３Ｖ−１又はＨ３Ｖ−２に有効な診断試験は、これらのウィ ルスのみに特異的であり、そしてＥＢウィルス、サイトメガロウィルス、水痘− 帯状庖疹ウィルス又は他のフローラ等のウィルスに対して感受性があってはなら ない。

Ｈ３Ｖは、電気泳動、凝集及び酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）をはじめ とした種々の分析手法を用いて検出されてきた。Ｈ３Ｖ抗原とその抗体の間に免 疫複合体が形成される技法では、検出感度を向上させるために通常未複合化物質 から複合体が分離される。分離は、濾過、遠心分離又はアフィニティークロマト グラフィーにより行うことができる。

はとんどの場合、複合体をある種の方法で不溶化し、そして蒸留水、りん酸緩衝 液又は非イオン性界面活性剤を含有する多数の溶液で洗浄して、未複合化物質を 除去している。

例えば、米国特許第４，５３５．０５７号には、単純ヘルペスウイルス抗原のよ うなウィルス抗原の固相アッセイが記載されている。このアッセイでは、抗体− 抗原複合体を、トウィーン２０の商品名で市販されている非イオン性界面活性剤 を含有するりん酸緩衝生理食塩水で数回洗浄している（前記特許第２１欄、第６ ６〜６７行参照）。このような溶液のｐＨは、一般的に７．０〜７．５である。

上記の洗浄溶液は、通常免疫学的な方法で使用されているが、アッセイの感度の 向上とＨ３Ｖ検出における望ましくないバックグランドシグナルの減少が引き続 き必要とされている。

発明の開示 本発明は、単純ヘルペスウィルスのアッセイに有効な水性洗浄液であって、ｐＨ が約９〜約１１．５でアルコールアミン又はその塩と非イオン性界面活性剤を必 須のものとして含んでなる水性洗浄液を用いることによって分析操作中で既知の 洗浄液を使用する場合の欠点を克服できる。

さらに、本発明により、 Ａ、単純ヘルペスウィルス抗原を含有する疑いのある生物学的被検体を、前記抗 原の抗体と接触させて免疫複合体を生成し、 Ｂ、前記の水性洗浄液を用いて未複合化物質を複合体から分離し、そして Ｃ９前記被検体中の単純ヘルペスウィルスの存在の指標として複合体の存在を測 定する、ことを含んでなる単純へルベスウイルスの測定方法が提供される。

また、本発明によれば、 （ａ）前記の洗浄液と、そして （ｂ）単純ヘルペスウィルス抗原に対する抗体、を含んでなる単純ヘルペスウィ ルスの測定に有効な診断試験キットが提供される。

本発明のＨ３Ｖアッセイは、迅速で、信頼性があり、そして容易に使用できる。

例えば、室温で約３０分未満でアッセイを行うことができる。本発明のＨ３Ｖア ッセイは、例えば、Ｈ３Ｖ細胞若しくはＨ３Ｖ感染細胞又はＨ３Ｖ細胞膜若しく はＨ８Ｖ感染細胞膜から抽出された抗原の検出に用いると非常に信頼性が高い。

このアッセイは、非常に感度が高く、バックグランドが低く、そして抗原−抗体 複合体を含有する固体支持体への抗体の非特異的結合を最小限に抑えることがで きる。これらの利点は、ｐＨが約９〜約１１．５であり、アルコールアミン又は その塩と非イオン性界面活性剤を含んでなる本発明の特定の水性洗浄液を用いる ことにより達成される。

発明を実施するための最良の形態 本発明は、洗浄水溶液並びに標準的な医学的手法及び微生物学的手法を用いて患 者から得た生物学的被検体中のＨ３Ｖの存在を測定する方法に関する。生物学的 被検体としては、例えば、患者の頚部、尿道、眼、咽喉又は肛門から得られるス ワブ被検体及び滑液又は外傷に由来する流体等の体液が挙げられる。このように して得られた生物学的被検体は、測定すべき抗原を含んだＨ５Ｖ又はＨ３Ｖ感染 細胞を含有する疑いがある。

本発明は、ウィルス細胞若しくはライスル感染細胞又感染細胞膜そのものを検出 するのに使用できるが、ウィルス細胞又はウィルス感染細胞を効果的に溶解して 比較的短時間で感度のよいアッセイを行うのに十分な抗原を放出させることが好 ましい。

本発明で検出できる抗原は、Ｈ３Ｖ−１かＨ３Ｖ−２のいずれか一方か、両方の 株に存在する。本発明により、ピリオンの糖タンパク質を抽出そして検出するこ とができる。

抗原の抽出は、米国特許第４，４３０．４３７号及び同４．６６１．３４９号並 びにヨーロッパ特許第０１８３３８３号に記載されているものをはじめとして、 いずれの抽出手法又は試薬を用いても行うことができる。

好ましい抽出組成物のｐＨは、約８．５〜約１２である。

所望のｐＨは、適当な緩衝液か塩基を用いて得ることができる。ある種の緩衝液 は、塩基がアルカリ性条件を提供するだけでなく緩衝能力を有するに十分な強さ を有している。他の緩衝液はこのような十分な強さを有しておらず、強塩基（水 酸化す）　ＩＪウム又は水酸化カリウム等）を使用して所望のｐＨとし、次いで その後緩衝液を使用してｐＨを維持する。

抽出組成物は、一種以上のアルコールアミン又はその塩を少な（とも約０．０５ モル濃度、好ましくは約０．１〜約１０モル濃度で含んでなる。有効なアルコー ルアミンとしては、エタノールアミン、ジェタノールアミン、プロパツールアミ ン、トリエタールアミン及びそれらの塩（塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、ピクリン酸 塩及びシコウ酸塩等）が挙げられる。他のアルコールアミンは、当業者には容易 に明らかとなろう。

アルコールアミン類やそれらの塩類の混合物を必要に応じて用いることができる 。

また、組成物は、アルキルフェノールと酸化エチレンとの縮合生成物である一種 以上の非イオン性界面活性剤も含んでいる。アルキルフェノールとしては、フェ ノールに炭素数１〜２００線状又は分岐状アルキル基の付いたものが好ましい。

オクチルフェノールが最も好ましい。一般的に、これらの化合物は、５〜約３５ 個の酸化エチレン基を有している。これらの非イオン界面活性剤は、公知の手法 及び原料を用いて容易に調製できるが、多くのものは市販されている。

他の有効な非イオン性界面活性剤として、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）（商ａ）、 例えば、トリトンＸ−１００（商標）及びトリトンＮｌ０Ｉ（商標）又はブリジ ェ（Ｂｒｉｊ）（商標）等のポリオキシエチレンエーテル、トウィーン（Ｔｗｅ ｅｎ）（例えば、トウィーン−２０）の商標で販売されているポリオキシエチレ ンソルビタン誘導体、及びタージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（例えば、タージ トールＮＰＸ及びタージトールＮＰ−７）の商標で販売されているポリグリコー ルエーテルが挙げられるが、これらには限定されない。

他の有用な物質については、特に界面活性剤についての標準的な文献、マクカッ チョンの乳化剤と洗浄剤（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’　　ｓ　　Ｅｍｕｌｓｉｆｉ ｅｒｓ　　　ａｎｄ　　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）　、１９８６年版、マクカッチ ョン・ディビジョン、パブリッシング社、米国ニューシャーシー州グレン・ロッ クを参照することにより当業者には容易に明らかとなろう。

一種以上の非イオン界面活性剤が、抽出組成物中に、総組成物重量に対して少な くとも約１重量％、好ましくは約４〜約１０重量％の量で存在する。

抽出組成物の第三の必須成分は、コール酸、その塩又は誘導体の一種以上である 。有用な物質としては、コール酸、ケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、 デオキシコール酸ナトリウム、ケノデオキシコール酸カリウム、コール酸アンモ ニウム及び当業者にとって容易に明らかとなる他の物質が挙げられるが、これら には限定されない。これらのうち、デオキシコール酸ナトリウムが最も好ましい 。この成分は、組成物中に、総組成物重量に対して少なくとも約０．　２重量％ 、好ましくは約０．　５〜約５重量％の量で存在する。

抽出組成物には、陰イオン界面活性剤も、総組成物重量に対して少なくとも約０ ．１重量％、好ましくは約０．　２〜約１重量％の量で含まれる。有用な陰イオ ン界面活性剤としては、硫酸アルキルアニオン及びアルカリ金属（例えば、リチ ウム、ナトリウム又はカリウム）又はアンモニウムカチオンを含有する水溶性又 は分散性化合物が挙げられるが、これらには限定されない。ここで、上記アルキ ルは、炭素原子数が約６〜２０個のものである。アルキルは、炭素原子数６〜１ ２個（線状又は分岐状ヘキシル、オクチル、デシル、２−メチルヘキシル及びド デシル基等）のものが好ましい。また、アリール核に炭素原子を６〜１０個有す るアリールスルホン酸又はその塩（上記したもの）も有効である。陰イオン界面 活性剤の代表例としては、ドデシル硫酸アンモニウム、ドデシル硫酸ナトリウム 、ドデシル硫酸ルビジウム、デシル硫酸ナトリウム、ヘキシル硫酸リチウム、オ クチル硫酸カリウム及びデシル硫酸リチウムが挙げられる。

抽出組成物の任意成分として、アルキル金属塩、アンモニウム塩又はアルカリ土 類金属塩等の一種以上の無機塩がある。

塩の代表例としては、塩化ナトリウム（最も好ましい）、塩化カリウム、塩化ア ンモニウム、塩化カルシウム、硫酸アンモニウム、硫酸バリウム及び当業者にと って容易に明らかとなる他の物質が挙げられるが、これらには限定されない。塩 は、少なくとも０．３モル濃度で存在するのが好ましく、約０、　５〜約２モル 濃度で存在するのがより好ましい。

抗原の抽出は、いずれかの適当な手法を用いて行うことができる。この目的のた めに特別に設計した適当な抽出装置を用いて行うのが好ましい。このような装置 は、米国特許第４．７４６，６１４号に記載されているもの等、当該技術分野に おいて多数開示されている。

生物学的被検体（濾過済又は未濾過）は、多数の分析手法のいずれを用いてヘル ペス抗原（感染細胞そのものかピリオンそのものから抽出）の存在を測定しても よい。このような手法としては、培養法、カウンター免疫電気泳動及び血清試験 が挙げられ、好ましくないとはいえ、場合によっては、これらの単に一つの手法 が選ばれるかもしれない。

Ｈ３Ｖ抗原は、免疫学的に一種以上の適当な抗体と反応させて免疫複合体を生成 するイムノアッセイを用いて検出することが好ましい。Ｈ３Ｖ−１若しくはＨ３ Ｖ−２のいずれか一方又は両方から抗原を検出できる。好ましくは両方が同時に 検出される。本発明の洗浄液を用いて複合体から未複合化物質を分離した後、適 当な放射性、比色性、螢光性又は酵素標識試薬を用いて複合体を検出する。ある 場合には、この試薬は抗原に対する標識抗体であり、そして他の場合には、標識 抗抗体は、抗原に対して反応性のある未標識抗体に対するものである。

好ましい実施態様では、複合体はある種の固体支持体（塗布済又は未塗布）上に 固定させ、適当な検出操作を行う。他のアッセイでは、複合体の形成中に互いに 凝集するある種の標識化又は未標識化粒子に複合体の少なくとも一種の反応体（ 抗体等）を付着させるとき免疫複合体が凝集する。凝集アッセイは、ヨーロッパ 特許公開第０１８３２１５号公報で説明されている。

有用なアッセイとしては、例えば、競争イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ （放射免疫沈澱を含む）又は酵素結合免疫吸着剤アッセイ（又は、一般的にｒＥ ＬＩＳＡＪと呼ばれているもの）が挙げられる。このようなアッセイの手法は、 一般的に、米国特許第４，４３０．４３７号及び列挙できないほど多数の他の従 来技術に記載されている。使用するＨ３■抗体は、好ましくはピリオン又は細胞 から抽出される一方の抗原に対するものでも、数種の抗原に対するものでもよい 。

一実施態様では、抗体は、Ｈ３Ｖ−１かＨ３Ｖ−２の単−糖タンパク質に向けら れる。他の実施態様では、異種の抗体の混合物が、Ｈ３Ｖ−１及びＨ３Ｖ−２の 両方に由来する糖タンパク質の数種の抗原に対するものである。さらに、第三実 施態様である好ましい態様では、Ｈ３Ｖ−１とＨ３Ｖ−２の両方に由来する特異 的糖タンパク質と反応する単一抗体が使用される。このアッセイで使用される抗 体は、購入又は公知の方法も用いて調製できるポリクローナル抗体か、モノクロ ーナルである。モノクローナル抗体が好ましい。このような抗体の一つは、モノ クローナルで、且つハイブリドーマ細胞系２８３−２　Ａ　Ｉ−Ｉ　Ｄ　４−２ 　Ｃ３（ＡＴＣＣ寄託第ＨＢ−９６８４号）から標準的な操作法を用いて得られ る。

有用な固相イムノアッセイでは、抽出された糖タンパク質抗原は、吸着によるか 、あるいは遊離アミン又はスルフヒドリル基と反応する粒子上の反応性基との共 有結合反応により、高分子小粒子上に「捕捉（ｃａｐｔｕｒｅ）Ｊされる。次に 、捕捉された抗原を適当な抗体と反応させて、結合免疫複合体を生成する。未複 合物質は、微孔質膜フィルターを用いて分離する。

好ましいイムノアッセイは、抽出抗原を塗布又は未塗布微孔質膜フィルター上に 捕捉することにより行う。この微孔質膜フィルターは、未複合物質を得られる免 疫複合体から分離するのにも使用される。別のイムノアッセイは、界面活性剤塗 布微孔質膜を用いて行われる。微孔質膜が以下の実施例２に示すような未塗布又 は未処理ナイロン物質であることが最も好ましい。

一般的に、本発明の方法の好ましい実施態様では、ある種の固体支持体（好まし くは、上記した膜又はビーズ）を使用して、以下のように行う。抽出抗原を、ガ ラス、セルロース材料、セラミック材料又は高分子材料等の固体支持体と接触さ せる。この支持体は、好ましくないインキュベーション又は他の調整を行うこと なく抽出抗原が急速に結合するいずれかの天然又は合成高分子物質で構成されて いることが好ましい。有用なポリマーとしては、ポリエステル、ポリアミド、ポ リカーボネート、ポリエチレンイミン、セルロース材料及びエチレン系不飽和ビ ニルモノマー並びに他の当該技術分野において公知の材料から製造される付加重 合体が挙げられる、一般的に、膜が正に帯電している場合には、カチオン基が第 四級アンモニウム塩、第四級ホスホニウム塩、第四級スルホニウム塩、第四級ピ リジニウム塩、第四級ピリミジニウム塩又は第四級イミダゾリウム塩であり、こ れらのうち第四級アンモニウム塩が好ましい。

好ましい実施態様では、粒子と膜の両方が抽出抗原を捕捉する微孔質膜に粒子を 担持したものを利用する。

支持体の形状は、ビーズ、ゲル、フィルム又は膜等のいずれかの適当な形態でよ い。本明細書で開示されるような微孔質膜が好ましい。一般的には、この膜の平 均孔径は、約０゜１〜約２０μｍである。

本明細書で開示される支持体は、アッセイを行うために他の器具（ボトル、試験 管、スワブ、ビーカー又はカップ）と組み合わせて使用することができる。また 、好ましくは、支持体は、アッセイを行うことができ、そして全ての流体を収容 することのできる使い捨て試験装置に嵌め込んだ微孔質膜である。試験装置の有 用な形状は、米国特許第３．８２５゜４１０号、同３，８８８，６２９号、同３ ，９７０，４２９号及び同４，４４６，２３２号をはじめとして当該技術分野に おいて公知である。特に有用な装置が、ヨーロッパ特許公開第０２８０５５８号 公報に記載されている。

抗原が支持体と接触すると直ちに、抗原が支持体に結合する。結合は直接でもよ い。このことは、抗原が、支持体に付着している結合性生物学的化合物（抗体等 ）を介しては結合していないことを意味しているが、上記の結合性化合物を介し て間接的に結合していてもよい。未結合物質は、本発明の洗浄液（以下で述べる ）を用いて洗い流すことができる。

接触の約１０分以内、好ましくは１０〜１２０秒以内に、結合抗原を、Ｈ３Ｖ抗 原の適当な抗体（又はその混合物）と接触させて、支持体上に免疫複合体を形成 する。アッセイを使い捨て試験装置を用いて行う場合には、支持体は抗原が粒子 に結合するにつれて流体と被検体中の未複合物質が通過できる微孔質膜であるこ とができる。

好ましい実施態様では、抗原に対する抗体を標識して検出を行う。有用な標識が 当該技術分野において公知であり、適当な手法及び装置を用いて直接又は間接的 に検出できる化学的化合物又は生物学的化合物並びに化学的又は特異的結合反応 により検出可能な種を生成して検出することができる化合物が挙げられる。有用 な標識としては、例えば、ラジオアイソトープ、酵素、補酵素、酵素インヒビタ ー、螢光化合物、化学発光化合物、リン光性化合物、補因子、ビオチン又はその 誘導体、アビジン又はその誘導体、フェリチン、磁性粒子、染色粒子及び当業者 にとって容易に明らかとなる他の標識が挙げられる。ラジオアイソトープ又は酵 素が好ましい標識である。標識は、公知の手法を用いて抗体に付着できる。標識 が直接検出可能でない場合には、反応生成物又は特異的結合生成物を検出可能に するためにさらに試薬又は化合物が必要となる。例えば、標識がビオチンである 場合には、酵素と結合して検出可能な種を生成するするアビジンと反応できる。

標識が、グルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性 ホスファターゼ等の酵素の場合、基質及び色素生成試薬も必要である。ペルオキ シダーゼとアルカリ性ホスファターゼが特に有用である。

特に好ましい実施態様では、標識がペルーオキシダーゼであり、そしてアッセイ のある時点で、過酸化水素及び適当な色素形成試薬を添加して、検出可能な色素 を生成する。有用な色素生成試薬としては、例えば、テトラメチルベンジジン及 びその誘導体、並びにトリアリールイミダゾールロイコ染料等のロイコ染料（米 国特許第４，０８９，７４７号に記載されているようなもの）又はペルオキシダ ーゼ及び過酸化水素の存在下で反応して色素を生成する他の化合物（即ち、ペル オキシダーゼの触媒作用で反応して色素を生成する化合物）が挙げられる。

別の実施態様では、Ｈ３Ｖ抗体を標識せず、そして形成され支持体に結合した抗 体−抗原複合体を、Ｈ３Ｖ抗体に特異的で検出のために適当に標識した（上記し た方法で）第二抗体（以下で説明する）を用いて検出を行う。

アッセイで用いる抗体は、支持体上での非特異的相互作用を減少させる一種以上 のブロッキングタンパク質との混合物の形態で供給できる。有用なタンパク質は 周知であり、例えば、カゼイン、α−カゼイン、ウシ胎児血清及びブタガンマグ ロブリンが挙げられる。有用なブロッキング組成物の一つは、非免疫ブロッキン グタンパク質及び両性界面活性剤を含有している。

支持体に結合した免疫複合体の生成を早めるために、抗体と抗原を、一般的に、 約１５〜約３０℃の温度で１ｏ分以下インキュベーションする。このインキュベ ーションは、室温で（即ち、１８〜２５℃）で５分まで行うことが好ましい。

インキュベーション後で、且つ抗体−抗原接触の約１ｏ分以内に、結合複合体を 一回以上、水性洗浄液で洗浄する。このような洗浄の少なくとも一回は、本発明 の洗浄液（以下で説明する）を用いて行う。

Ｈ３Ｖ抗体が標識されている場合について上記で説明した実施態様では、洗浄後 のアッセイ手法として、適当な試薬を添加後に標識を直接又は間接的に検出する 。これは、結合複合体を洗浄後、比較的迅速になされる。必要に応じて、試薬に 悪影響がなければ、インキュベーションを行って検出を早めてもよい。次に、適 当な時間のあとに、標準装置と標準手法を用いて標識を検出する。

Ｈ３Ｖ抗体が未標識の場合、結合を洗浄後、未標識抗体に対する抗体と接触させ る。この第二抗体（即ち、抗抗体）を、上記した標識のいずれかで適当に標識し 、そして上記したブロッキング組成物とともに供給することができる。抗体は、 モノクローナルでもポリクローナルでもよく、そして購入したものでも、公知の 手法で調製したものでもよい。

この接触後、得られる粒子に結合した抗原−抗体−抗体複合体を約１０分以下、 約１５〜約３０℃の温度でインキュベーションする。インキュベーションは、室 温で約５分まで行うことが好ましい。

さらなる洗浄を行って未複合物質を除去し、そして適当な酵素基質又は他の必要 な試薬を添加して検出可能な種を生成する。結合抗原−抗体−標識抗体複合体は 、次に、標準的な放射性、比色性、螢光性又は他の検出法を用いて支持体上で検 出する。

本発明の洗浄液は、本発明の方法を通じて一回以上使用することができ、上記し たようにバックグランドを低くし、そして感度を高めることができる。さらに、 本発明の洗浄液を少なくとも一回、好ましくは最初の洗浄工程で使用するならば 、標準的な洗浄液を使用することもできる。

本発明の水性洗浄液のｐＨは、約９〜約１１．５であり、好ましくは約１０〜約 １１である。一種以上の適当な緩衝液又は強塩基を用いてこのｐＨとすることが できる。有用な塩基としては、アルカリ金属水酸化物又はアンモニウム水酸化物 （水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又は水酸化アンモニウム及び他の当該技術 分野において公知のもの等）が挙げられるが、これらに限定されない。場合によ っては、所望のレベルまでｐＨを上昇させるのに緩衝液で十分なことがあるが、 他の場合には、ｐＨを上昇させるのに強塩基を使用後、緩衝液でｐＨを維持する 必要がある。例えば、アルコールアミン又はその塩を使用し、そして約９．５を 超えるｐＨが望ましいときには、溶液のｐＨを上昇させるのには水酸化ナトリウ ム等の強塩基が必要である。

洗浄液は、実質的にアルコールアミン又はその塩からなり、約０．０５モル濃度 から、好ましくは約０．１〜約１モル濃度である。有用なアルコールアミンとし ては、エタノールアミン、ジェタノールアミン、プロパツールアミン、トリエタ ノールアミン及びそれらの塩（塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩、ピクリン酸塩及びシュ ウ酸塩等）が挙げられる。他のものは当業者には容易に明らかとなろう。必要に 応じて、アルコールアミン類又はそれらの塩類の混合物を使用することができる 。

エタノールアミン又はその塩が特に好ましい。

また、洗浄液は、一種以上の水溶性又は水分散性の非イオン界面活性剤も含んで おり、この量は総溶液重量に対して少なくとも約０．０５重量％、好ましくは約 ０．　１〜約２重量％である。有用な界面活性剤としては、トリトン（Ｔｒｉｔ Ｏｎ）（商標）（例えば、トリトン（商標）Ｘ−１００）として販売されている もの又はブリジエ（Ｂｒｉｊ）（例えば、ブリジェ３０）の商標で販売されてい るもの等のポリオキシエチレンエーテル、トウイーン（Ｔｗｅｅｎ）（例えば、 トウィーン−２０、トウイーン２１、トウイーン４０）の商標で販売されている ポリオキシエチレンソルビタン、タージトール（Ｔｅｒｇｉｔｏｌ）（例えば、 タージトールＮＰ−７）の商標で販売されているポリグリコールエーテルが挙げ られるが、これらに限定されない。

特に有用な非イオン界面活性剤は、上記したポリエチレンエーテル及びポリオキ シエチレンソルビタン、とりわけトウィーン２０（商標）である。他の有用な物 質については、特に界面活性剤についでの標準的な文献、［マクカツチョンの乳 化剤と洗浄剤（ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’　　ｓ　　Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ　　 ａｎｄ　　Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）Ｊ、１９８６年版、マクカッチョン・ディビ ジョン、パブリッシング社、米国ニューシャーシー州グレン・ロックを参照する ことにより当業者には容易に明らかとなろう。

本発明の代表的な洗浄液とその調製を、以下の実施例１で説明する。

単純ヘルペスウィルスの好ましい測定方法は、Ａ、使い捨て試験装置内で生物学 的被検体から抽出されたＨ３Ｖ抗原を含有する疑いのある溶液と固体支持体とを 抗原が固体支持体に結合することができるのに十分な時間接触させ、 Ｂ０本発明の水性洗浄液を用いて結合抗原から未結合物質を洗い出し、 Ｃ１結合抗原をそれに対する抗体と接触させて固体支持体に結合した免疫複合体 を形成し、 Ｄ、水性洗浄液（好ましくは本発明のもの）を用いて、複合体から未複合化物質 を分離し、そしてＥ、前記被検体中の単純ヘルペスウィルスの存在の指標として 結合複合体の存在を測定することを含む。

本発明の洗浄液は、必要に応じて、一種以上の他の試薬、診断器具又は他の有用 な材料も含まれている診断試験キットの一部分として供給することができる。一 般的には、キットは、Ｈ３Ｖ抗原に対する少なくとも抗体（標識化又は未標識化 ）を含んでいる。また、抗抗体（必要に応じて）、抽出組成物、抽出装置、試験 装置、色素生成試薬又は組成物、ピペット、使用説明書、スワブ及びアッセイを 行うのに有用な他の構成部材をも含むことができる。構成部材は、いずれかの適 当な方法で梱包し、−個以上の梱包又は容器で供給できる。

下記の材料、組成物及び溶液を実施例で使用した。実施例は本発明を説明するた めのものであって、本発明の範囲は実施例には限定されない。

抗体の調製 単純ヘルペスウィルスに対するモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細 胞を、ケーラー（Ｋ６ｈｌｅｒ）等〔ネーチａｒ　　　（Ｎａｔｕｒｅ）　、２ ５６．４９５〜４９７（１９７５））に記載されている公知の手法を用いて調製 した。Ｈ３Ｖ−１とＨ３Ｖ−２との両方に共通の糖タンパク質の抗原決定基に対 して反応性のあるモノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞系が生じた 。このハイブリドーマ細胞系は、ＡＴＣＣ１ＨＢ−９６８４号として寄託した。

抗原の調製 正対照として使用するための抗原を調製するために、Ｈ３Ｖ−１株ＦとＨ３Ｖ− ２株Ｇを別々にＨＥＰＧ−２細胞（ＡＴＣＣ第ＣＣＬ−２３号）中で増殖させた 。感染細胞は、低速遠心分離でペレット化した。ペレットを、コレックス（Ｃｏ ｒｅｘ）管中で、１５−の容量までりん酸緩衝生理食塩水に再懸濁した。再懸濁 細胞を超音波破砕し、アミノメチルトリオキサジン（５００ｍｇ／Ｗ１１）に１ ５分間暴露後、一定に攪拌しながら紫外線を１５分間照射した。

試験装置の正対照ウェルにはＨ３Ｖ−１抗原及びＨ３Ｖ−２抗原（ＵＶ不活性化 及び洗浄剤で溶解したもの）が入っており、ウシ胎児血清アルブミン（０，１重 量％）と親水性ポリマー（５重量％）との混合物の形態で試験ウェルの濾過膜に 取り込んだ。

抗体複合体の調製 単純ヘルペスウィルスに対するモノクローナル抗体を、ヨシタケ等、ユーロ・ジ ェイ・バイオケム（Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１０１．３９５　（１９ ７９）に記載されている方法を用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼに結合させ た。得られた結合体を、α−カゼイン（０，５重量％）、トウィーン２０非イオ ン性界面活性剤（０，１重量％）、チメロサール防腐剤（０，０１重量％）及び ｐ−メトキシフェノール（１００ミリモル濃度）を含有するブロッキング組成物 と混合後、無菌濾過した。この溶液の最終抗体濃度は１．５μｇ／ｒｒＬ１であ った。これをウシ血清アルブミン（１重量％）とともに保存した。試験装置の負 対照ウェル用の複合体は、上記した手法を用いて調製したタレアチンキナーゼに 対するペルオキシダーゼ標識抗体であった。

ロイコ染料生成組成物 この組成物は、過酸化水素（１０ミリモル濃度）、２−（４−ヒドロキシ−３− メトキシフェニル）−４，５−ビス（４−メトキシフェニル）イミダゾールロイ コ染料（０，００５重量％）、ポリ　（ビニルピロリドン）（１重量％）、４′ −ヒドロキシアセトアニリド（５ミリモル濃度）及びジエチレントリアミン五酢 酸（１０ミリモル濃度）を含有するもの過酸化水素（１０重量％）、ジエチレン トリアミン五酢酸（０，００５重量％）及び防腐剤（０，０１重量％）を含有す る水溶液を調製した。

抽出組成物 下記の成分を水中で混合することにより抽出組成物を調製した：ノニデットＮＰ 　　４０　（Ｎｏｎｉｄｅｔ　　ＮＰ　　４０）非イオン性界面活性剤（５重量 ％、商標）、デオキシコール酸ナトリウム（０，７５重量％）、ドデシル硫酸ナ トリウム陰イオン界面活性剤（０，４重量％）及び塩化ナトリウム（１モル濃度 ）。この組成物のｐＨを１２Ｎ水酸化ナトリウムで１０．７５に調整した。

りん酸緩衝生理食塩水 この溶液（０，０５モル濃度）は、塩化ナトリウム（０゜１５モル濃度）、りん 酸二水素ナトリウム（０，０１モル濃度）及びりん酸水素ナトリウム（ｐＨ７， ２，０，０４モル濃度）から調製した。

ブロッキング組成物 α−カゼイン（０，５重量％）、トウィーン２０　（０，１重量％）、ｐ−メト キシフェノール（１００ミリモル濃度）及び防腐剤（０，０１重量％）を含有す る水性ブロッキング組成物を調製した。

３個の試験ウェルを有する使い捨て試験装置をアッセイに用いた。この試験装置 の各試験ウェルには、未塗布ナイロン微孔質膜〔バイオダインＡ（Ｂｉｏｄｙｎ ｅ　　Ａ）（商標）〕が付いているものであった。

実施例１ 洗浄溶液 下記の物質を水中で混合することにより本発明の洗浄液を調製したニドウィーン ２０非イオン界面活性剤（商標、０゜１重量％）及びチメロサール防腐剤（０， ０１重量％）、エタノールアミン塩酸塩（０，２６モル濃度）及びチメロサール 防腐剤（０，０１重量％）。溶液のｐＨは、１２Ｎ水酸化ナトリウムを添加する ことにより１０．７５まで上昇させた。

実施例２ Ｈ８Ｖ−１及びＨ３Ｖ−２のアッセイ この実施例では、Ｈ３Ｖ−１かＨ３Ｖ−２又はそれらの両方を含有する患者から の被検体を用いて本発明を説明する。

被検体は、各患者について２本のスワブを用いていくつかの診療所と病院で種々 の患者から得た。１本のスワブは、診療所又は病院でシュアセル（Ｓｕｒｅｃｅ ｌｌ）（商標）試験装置において本発明を実施するのに使用し、そして第二のス ワブは、標準的な培養法を用いる追試に使用した。

各患者由来の第一のスワブを、抽出管に置き、そして上記した抽出組成物（１μ ｌ）を添加した。スワブを抽出溶液中で１〜２分間かきまぜ、その後得られた抽 出物を、フィルター装置〔上層としてポリエステルプラグ、中間層として１０μ ｍ　ＨＤＣＣ商標、ポール社（Ｐａｌｌ　　Ｃｏｒｐ、）］及び下層として５μ ｍ口プロダイン（Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ）（商標）フィルター（ボール社製）〕か ら構成されている〕を通して予備濾過した。

次に、予備濾過した抽出物（２００ｍＩりを各試験装置の各ウェルに配置して、 Ｈ３Ｖ抗原をウェルの膜に吸着させた。

試験ウェルを実施例１の洗浄液（１２０μｌ）で洗浄し、そして上記した過酸化 水素溶液（１２０μｉ？）を各ウェルに添加して非特異的オキシダーゼを除去し た。ウェルを再び洗浄液（１２０μｌ）で洗浄した。上記したブロッキング組成 物に標識抗タレアチンキナーゼ複合体（３μｇ　／ｍｌ　）を含ませた試料（４ ０μｌ）を、各試験装置の負対照ウェルに添加した。抗Ｈ３Ｖ結合物の試料（４ ０μｌ）を各装置の他の２つのウェルに添加した。

室温で５分間インキュベーションして抗体−抗原複合化を行った後、ウェルを実 施例１の洗浄溶液で２回（毎回２００μｍ）洗浄した。

上記したロイコ染料組成物（４０μｍ）を各試験ウェルに添加し、そして室温で ５分間インキュベーションした後、膜上の赤みがかった色素の存在を、検体中の Ｈ３Ｖ抗原の存在の指標として評価した。試験した患者試料についての感度（真 の陽性を真の陽性と偽の陰性との合計で割ったもの）は８３％であり、特異性（ 真の陰性を真の陰性と偽の陽性との合計で割ったもの）は１００％であった。こ の方法による全ての陽性の結果は、培養法による結果により確認された。

実施例３〜５ 比較例 単純ヘルペスウィルスに関して、本発明の洗浄液を、本発明の範囲外の３種の洗 浄液と比較した。

材料 実施例３：洗浄液を実施例１と同様に調製した。

実施例４ニドウイーン２０の代わりにターシト−ルア（商標、０．１重量％）を 使用した以外は、洗浄液は実施例１のものと同様であった。

実施例５ニドウイ一ン２００代わりにトリトン（商り　Ｘ−１００（０，１重量 ％）を使用した以外は、洗浄液は実施例１のものと同様であった。

対照Ａ：この洗浄液は、塩化す）　ＩＪウム水溶液（１モル濃度、ｐＨ６，８６ ）であった。

対照Ｂ：この洗浄液はエタノールアミン塩酸塩（１モル濃度）、塩化ナトリウム （０，２６モル濃度）及びトウイーン２０非イオン界面活性剤（商標、０．１重 量％）を含有しており、そしてｐＨは８であった。

対照Ｃ：この洗浄液は塩化ナトリウム（１モル濃度）止トリトン（商標）Ｘ−１ ００非イオン界面活性剤（０，１重量％）を含有しており、そしてｐＨは６．８ ６であった。

アッセイ 試験試料を下記のようにして調製した。抗原と細胞を含有するＨ３Ｖ細胞溶菌液 （上記したもの）（４０μｌ）（希釈率１：４０）を、上記した抽出組成物（３ ９６０μりと混合し、そして室温で２分間インキュベーションした。この混合物 を、フィルター装置〔上層としてポリエステルプラグ、中間層として１０ｔｔｍ 　ＨＤＣ［商標、ポール社（ＰａｌｌＣｏｒｐ、）］及び下層として５μｍ口プ ロダイン（Ｌｏｐｒｏｄｙｎｅ）（商標）フィルタ二（ボール社製）〕から構成 されている〕を通して予備濾過し、そして試料（２００μｌ）を、シュアセル（ 商標）試験装置の各試験ウェルに添加した。１個のウェルを負対照として使用し 、そして他の２個のウェルをアッセイ用の試験ウェルとして使用した。

抽出組成物のみを含有するバックグランド試料（各２００μｌ）も、試験装置に 添加した。

各洗浄液（１２０μｍ）を装置の試験ウェルに添加後、過酸化水素溶液（１２０ μｌ）を添加し、二度目の洗浄（１２０μｌ）を行った。次に、上記したブロッ キング溶液にペルオキシダーゼ標識抗Ｈ３Ｖ複合体（１，５μｇ／ｍ１）を含有 せしめた溶液（４０μｌ）を、各装置の試験ウェルに添加した。ペルオキシダー ゼ標識抗タレアチンキナーゼ複合体を含有する溶液（４０μｌ、３μｇ）を、各 負対照ウェルに添加した。室温で５分間インキュベーションした後、各ウェルを 洗浄液（毎回１２０μｍ）で２回洗浄した。上記したロイコ染料生成組成（４０ μｌ）を各ウェルに添加後、室温でさらに５分間インキュベーションした。試験 ウェルの膜上の色素濃度を目視し、０から１０まで段階付けした。０は色素濃度 が観察されない場合であり、１０は最も高い濃度である。結果を下記の表に示す 。アッセイの結果は、各装置についての２個の試験ウェルの平均を表す。

表 洗浄液　　　　　　　　　　濃度測定 対照Ａ　　　　　　　　　８．　５　　　　　１．　５対照Ｂ　　　　　　　　 　８．　５　　　　　１．　５対照Ｃ８，５１，５ 実施例３　　　　　　　７．　０　　　　　０実施例４　　　　　　　５．　０ 　　　　　０実施例５　　　　　　　７．　０　　　　　０これらの結果から明 らかなように、低いｐＨ（即ち、９未満）を有する洗浄液は、シグナルが高いば かりでなく、バックグランドも許容できないほど高い。実施例３〜５の洗浄液は 、許容濃度を示すとともに、バックグランドも低かった。

さらなる実験により、トリトン（商標）Ｘ−１００を含有する洗浄液が極めて良 好の貯蔵安定性を示すことが分かった。

以上本発明を好ましい実施態様を引用しながら詳細に説明したが、本発明の精神 及び範囲内で変更及び修正ができることが理解されるであろう。

国際調査報告 一一−−＾−噛−ｈａ　ｐＣＴ／ＩＴｅ：Ｏｎ／ｎｌ’ｌ＆ｎ７−２−国際調査 報告 ＵＳ　９０００６０７ Ｓ＾　３６７６６

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．ｐＨ約９〜約１１．５であり、そしてアルコールアミン又はその塩と非イオ ン界面活性剤を必須のものとして構成される単純ヘルペスウイルスのアッセイに 有用な水性洗浄液。
2. ２．ｐＨ約１０〜約１１である請求の範囲第１項に記載の洗浄液。
3. ３．前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレンエーテル、ポリオキシエチ レンソルビタン、ポリグリコールエーテル又はポリエチレングリコールである請 求の範囲第１項に記載の洗浄液。
4. ４．ｐＨ約１０〜約１１であり、そしてエタノールアミン又はその塩と前記非イ オン界面活性剤としてポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート又 はオクチルフェノキシポリエトキシエタノールを必須のものとして構成される請 求の範囲第１項の洗浄液。
5. ５．Ａ．単純ヘルペスウイルス抗原を含有する疑いのある生物学的被検体を、前 記抗原の抗体と接触させて免疫複合体を形成し、 Ｂ．ｐＨ約９〜約１１．５であり、そしてアルコールアミン又はその塩と非イオ ン界面活性剤を必須のものとして構成される水性洗浄液を用いて未複合物質を前 記複合体から分離し、そして Ｃ．前記被検体中の単純ヘルペスウイルスの存在の指標として前記複合体の存在 を測定する、ことを含んでなる単純ヘルペスウイルスの測定法。
6. ６．前記単純ヘルペスウイルス抗体を標識して検出する請求の範囲第５項に記載 の方法。
7. ７．前記単純ヘルペスウイルス抗体を酵素で標識する請求の範囲第６項に記載の 方法。
8. ８．前記酵素標識がペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼである請 求の範囲第７項に記載の方法。
9. ９．前記単純ヘルペスウイルス抗体が未標識であり、そして検出用に標識した抗 抗体を用いて前記抗体−抗原複合体を測定する請求の範囲第５項に記載の方法。
10. １０．前記未複合物質を前記複合体から分離するための微孔質膜を含んでなる使 い捨て試験装置を用いて全体又は一部分行う請求の範囲第５項の方法。
11. １１．Ａ．使い捨て試験装置内の微孔質膜と、単純ヘルペスウイルスを含有する 疑いのある生物学的被検体から抽出された単純ヘルペスウイルス抗原を含有する 疑いのある溶液とを前記膜に前記抗原が結合できる十分な時間接触し、Ｂ．ｐＨ 約９〜約１１．５であり、そしてアルコールアミン又はその塩と非イオン界面活 性剤を必須のものとして構成される水性洗浄液を用いて前記結合抗原から未結合 物質を洗い出し、 Ｃ．前記結合抗原をその抗体と接触させて前記膜に結合した免疫複合体を形成し 、 Ｄ．水性洗浄液を用いて、前記複合体から未複合物質を分離し、そして Ｅ．被検体中の単純ヘルペスウイルスの存在の指標として前記結合複合体の存在 を測定する、ことを含んでなる単純ヘルペスウイルス抗原の測定方法。
12. １２．工程Ｄで使用する前記水性洗浄液が、ｐＨ約９〜約１１．５であり、そし てアルコールアミン又はその塩と非イオン性界面活性剤を必須のものとして構成 される請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．工程Ｂと工程Ｄにおける前記洗浄液が同一である請求の範囲第１２項に記 載の方法。
14. １４．前記洗浄液に含まれている前記非イオン界面活性剤が、ポリエチレンエー テル、ポリオキシエチレンソルビタン、ポリグリコールエーテル又はポリエチレ ングリコールである請求の範囲第１１項に記載の方法。
15. １５．前記非イオン界面活性剤が、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノ ラウレート又はオクチルフェノキシポリエトキシエタノールである請求の範囲第 １４項に記載の方法。
16. １６．前記抗体がペルオキシダーゼで標識されており、そしてペルオキシダーゼ と過酸化水素の存在下で色素を生成する色素生成組成物を添加することにより前 記複合体の測定を行う請求の範囲第１１項に記載の方法。
17. １７．（ａ）ｐＨ約９〜約１１．５であり、そしてアルコールアミン又はその塩 と非イオン界面活性剤を必須のものとして構成される洗浄液と、 （ｂ）単純ヘルペスウイルス抗原に対する抗体とを、含んでなる単純ヘルペスウ イルスの測定に有効な診断試験キット。
18. １８．前記抗体が検出のために標識されている請求の範囲第１７項に記載のキッ ト。
19. １９．アッセイ用の使い捨て試験装置をさらに含んでなる請求の範囲第１７項に 記載のキット。
20. ２０．前記単純ヘルペスウイルス抗体に対する抗体をさらに含んでなる請求の範 囲第１７項に記載のキット。