CN105548565A - 一种用于检测克氏锥虫抗体的试剂盒及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于检测chagas抗体的试剂盒及其制备方法,所述试剂盒包括组分A和组分B,其中组分A为标记有示踪标记物或包被磁球的chagas抗原,组分B为包被磁球或标记有示踪标记物的chagas二抗;并且,组分A和组分B中的任意一种标记有示踪标记物,另一种则包被磁球。本发明还提供了一种检测chagas抗体的方法,利用本发明提供的试剂盒,可以准确、灵敏地测定样本中的chagas浓度。在此基础上,以预处理液进行预处理优化,可以降低背景干扰,提高检测灵敏度。同时,该方法可以借助化学发光免疫分析仪,实现全自动化学发光法检测,减少了操作时间,降低人为操作误差。
Description
技术领域
本发明涉及生物物质检测的技术领域,具体涉及一种用于检测克氏锥虫抗体的试剂盒及其制备,以及应用该试剂盒检测克氏锥虫抗体的方法。
背景技术
克氏锥虫病,又名美洲锥虫病(Americantrypanosomiasis)/查加斯病(Chagas),是由克氏锥虫(Trypanosomacruzi)引起的一种人兽共患的寄生原虫病。病原体是克氏锥虫,它是一种单细胞原生动物,能够以不同形态在哺乳动物(包括人)的血液、细胞和锥蝽的消化道内生长,流行区主要通过“患者或储存宿主→锥蝽→人”的途径传播。非流行区病原体可通过血制品、器官移植、垂直传播或进食污染的食物等方式传播。
该病的临床症状因感染阶段不同而异,急性期约95%的患者在感染克氏锥虫后无症状,但外周血涂片中可找到病原体,锥虫侵入部位可形成红斑和硬结,其他急性症状还包括发热、皮疹、肌肉关节痛、嗜睡、腹泻、水肿、全身淋巴结肿大、肝脾肿大、呼吸紊乱、发绀、昏迷等。绝大多数急性期症状和体征在数周至数月时间内自发的逐渐消退进入隐匿期,此期无任何临床症状和体征,显微镜检查外周血涂片亦难以发现克氏锥虫,但特异性抗体存在。约三分之一的患者经历隐匿期后逐渐进入慢性期,常发生于感染后10-20年,患者可累及心脏,称为查加斯心脏病,表现为心悸、眩晕甚至晕厥等。而后可逐渐发展至心肌肥大或心力衰竭,多为右心衰,可见心脏增大,伴见充血性肝肿大和外周性水肿,部分患者可见食管和结肠扩张,继而形成巨食管症和巨结肠症。
因克氏锥虫与人免疫缺陷病毒HIV的早期传播模式、漫长的潜伏期和难以治愈等方面极其相似,有专家将查加斯病称为“美洲的新艾滋病”。该病曾局限于美洲地区,但现已随人口迁移传播到欧洲等大陆。
美洲锥虫病的诊断试验包括显微镜检查、病原分离、血清学试验和分子生物学技术。急性感染的诊断以寄生虫检测为基础,血液、脑脊髓液或组织样品经吉姆萨或瑞氏染色,可在显微镜下观察克氏锥虫。但该方法不适用于大通量样本的快速检测。
分子生物学检测技术主要是通过PCR和免疫印迹试验,可用来检测血液或组织中的克氏锥虫DNA。当血清学方法不确定时,可以进一步证实,也可用于治疗效果的辅助监测手段。但该技术需要专业人员且操作复杂,同样不适用于大通量样本的快速检测。
克氏锥虫感染后1周~2周,进入急性期,持续约2月,为严重的虫血症,以持续升高的IgG抗体为特征。急性期后,虫血症非常低,IgG抗体达到最高水平,并持续终生。因此,血清免疫学试验经常用来检测IgG抗体以诊断慢性感染。血清免疫学检查具有方便、快捷和准确等优点,已经普遍应用于医疗检测和诊断领域。较常见的血清免疫学检查方法有免疫荧光技术(ABS)、放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附技术(ELISA)、免疫层析体技术(ICA)及化学发光免疫分析技术(CLIA)等。
目前市场上检测chagas抗体主要的方法是酶联免疫法和化学发光法。酶联免疫法采用双抗体夹心捕获目标物,以辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(ALP)显色来实现目标物检测。采用ELISA方法检测血清中的chagas抗体,灵敏度较差,此外ELISA方法需要反复洗板,依赖人工操作,且检测周期长,使临床无法在早期快速准确的诊断出chagas,因而限制了ELISA方法在chagas临床检测方面的进一步应用。
采用化学发光法检测血清中的chagas抗体,其灵敏度和精密度均远高于ELISA方法。现有技术文献中有记载通过化学发光法测定chagas抗体,采用双抗原夹心方法捕获目标物,以发光标记物进行化学发光产生信号实现目标物检测。但在采用双抗原夹心法检测chagas的化学发光方法中,能够相互配对的抗原多数特异性不好,容易出现非特异性结合,导致检测灵敏度受限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测chagas抗体的试剂盒及其制备方法,利用chagas抗原与抗体的特异性结合,结合示踪标记物的发光性能和磁球的磁分离性,该试剂盒能够增强特异性,降低背景信号干扰,准确、灵敏地测定样本中的chagas抗体含量。
本发明的目的还在于提供一种检测chagas抗体的方法,利用本发明提供的试剂盒,根据间接法或捕获法的测定原理,准确地测定样本中的chagas抗体含量。尤其是采用该试剂盒,通过全自动化学发光法检测chagas抗体,提高检测灵敏度的同时,还能够减少操作时间,降低人为操作误差。
根据本发明,提供了一种用于检测chagas抗体的试剂盒,所述试剂盒包括组分A和组分B,其中组分A为标记有示踪标记物或包被磁球的chagas抗原,组分B为包被磁球或标记有示踪标记物的chagas二抗;并且,组分A和组分B中的任意一种标记有示踪标记物,另一种则包被磁球;其中,所述chagas二抗为抗人IgG抗体。
根据本发明,所述示踪标记物可以选自本领域中常用于标记抗原或抗体的示踪标记物,例如金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯,尤其优选为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)。
适用于本发明的磁球也称为磁珠,可以是本领域中常用的磁性微球或颗粒。优选的,本发明使用的磁球,是将纳米级的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合,形成具有超顺磁性和极大量蛋白吸附容量的微米级的固相微球,具有在外加磁场作用下可迅速被磁化,在撤走磁场后剩磁为零的属性。其中,所述有机高分子材料的种类没有特别限制,可根据需要进行选择。
本发明所使用的磁性微球应能满足直径为0.1-5μm,磁性微球还可以通过表面改性而带有多种活性功能基团,包括但不限于-OH、-COOH、-NH2。
在一个具体实施例中,所述磁球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体,并具有0.1-5μm的粒径;并且,所述磁球任选地通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。
在本发明的一些实施方案中,所述示踪标记物直接或间接地标记chagas抗原。间接标记的方式包括但不限于通过异硫氰酸荧光素(FITC)与抗FITC抗体体系或链霉亲和素(SA)与生物素(Biotin)体系进行间接标记。直接标记是指示踪标记物直接与chagas抗原连接进行标记;间接标记是指通过中间媒介链接体系使得示踪标记物标记抗chagas抗原,所述中间媒介链接体系包括但不限于FITC与抗FITC抗体体系或SA-Biotin体系,可以自由选用相同或不同的中间媒介链接体系进行间接标记。
在这些实施方案中,所述chagas二抗直接或间接地包被磁球。间接包被磁球的方式包括但不限于通过FITC与抗FITC抗体体系或SA-Biotin体系进行间接包被。直接包被是指利用chagas二抗直接对磁球进行包被;间接包被是指通过中间媒介链接体系,使得chagas二抗对磁球进行包被,所述中间媒介链接体系包括但不限于FITC与抗FITC抗体体系或SA-Biotin体系,可以自由选用相同或不同的中间媒介链接体系进行间接包被。
根据本发明,所述试剂盒还包括组分C预处理液,所述预处理液的成分包括:牛血清白蛋白、新生牛血清、羊血清、鼠血清、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘露醇、丙三醇、酪蛋白、乙二胺四乙酸二钾、TritonX-100、十二烷基硫酸钠、甘氨酸、PEG6000和防腐剂。所述预处理液中各组分的含量如下:0.1~15质量%的牛血清白蛋白、10~2质量%的新生牛血清、0.1~5质量%的羊血清、0.1~5质量%的鼠血清、1~100mmol/L的Tris-HCl缓冲液、1~100mmol/L的磷酸盐缓冲液、0.1~2质量%的甘露醇、0.1~2质量%的丙三醇、0.1~5质量%的酪蛋白、0.1~2质量%的乙二胺四乙酸二钾、0.1~2质量%的TritonX-100、0.05~1质量%的十二烷基硫酸钠、0.01~1质量%的甘氨酸、0.01~1质量%的PEG6000和0.01~1质量%的防腐剂。
根据本发明,所述试剂盒还包括chagas抗体的低点校准品和高点校准品,并任选地包括缓冲液。本发明所述低点校准品与高点校准品是两者相对而言,其中低点校准品的浓度为0.05~10index/mL,高点校准品的浓度为100~1000index/mL。
根据本发明,在所述试剂盒中,磁球的浓度为0.1~2mg/mL,chagas抗原的浓度为50~5000ng/mL,示踪标记物的浓度为5~500ng/mL,chagas二抗的浓度为50~5000ng/mL。
以上各具体实施方案中,为保证试剂的稳定性,抑制细菌增长导致试剂失效,试剂盒各组分均含有BSA和防腐剂,所述BSA浓度为0.01~0.5质量%,所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠、叠氮钠、亚硝酸钠、Proclin系列(免疫诊断常用防腐剂之一,主要活性成分为2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮和5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮)中的任一种或两种以上混合物;chagas抗原可为天然抗原或重组抗原;示踪标记物可为吖啶酯、异鲁米诺及其衍生物、鲁米诺及其衍生物中的任意一种。
本发明提供了一种用于制备如上所述的组分B为chagas二抗的试剂盒的方法,所述方法包括:将chagas二抗直接或间接标记示踪标记物,将chagas抗原直接或间接包被磁球。所述间接标记包括将示踪标记物通过FITC与抗FITC抗体体系或SA-Biotin体系标记所述chagas二抗;所述间接包被包括将所述chagas抗原通过FITC与抗FITC抗体体系或SA-Biotin体系间接包被磁球。
在本发明的一个具体实施例中,还包括在所述间接包被的过程中,以预处理液进行预处理反应的操作。
根据本发明的试剂盒制备方法还可以包括低点校准品和高点校准品的配置,还可以进一步包括试剂盒的组装。
根据本发明,还提供了一种检测chagas抗体的方法,所述方法包括使用如上所述的试剂盒,通过化学发光免疫法检测待测样品中的chagas抗体浓度。
具体地,所述方法包括:将所述试剂盒的组分A和组分B与待测样品混合,温育,经磁分离,向沉淀物中加入激发底物,检测光信号强度;以同样方法测定chagas抗体的低点校准品和高点校准品的光信号强度,并获得chagas抗体的浓度与发光强度之间的标准曲线;将检测得到的待测样品的光信号强度与标准曲线对照,获得待测样品中的chagas抗体浓度。
在试剂盒组分B为chagas二抗的情况中,在使用试剂盒测定chagas抗体时,经温育,组分A和组分B与待测样品中的chagas抗体形成chagas二抗-chagas抗体-chagas抗原的免疫复合物。之后,外加磁场沉淀,去上清液,用洗液清洗沉淀免疫复合物,加入发光激发底物,测定相对光强度,对照chagas抗体浓度与光强度的标准曲线,可获得样品中的chagas抗体浓度。
为避免特异性不好而导致灵敏度不够的问题,本发明主要采用间接法测定chagas抗体。在一个具体实施方案中,具体加样步骤为:a.将待测样本(血清/血浆样本)、高点校准品和低点校准品分别加入到不同的反应杯孔中;b.加入包被有chagas抗原的磁球悬浮液;c.加入标记chagas二抗的示踪标记物溶液;d.37℃温育15-40分钟,置于磁环境下清洗2次;e.加入发光激发底物,检测光信号强度;f.通过校准品修正后的工作曲线,根据样本检测光强度计算出待测样本的chagas抗体浓度。
在本发明一个优选的具体实施方案中,所述b步骤中的包被有chagas抗原的磁球悬浮液,在加入之前采用预处理液进行优化预处理反应,然后清洗进行磁分离并洗涤之后,再加入到待测样本以及高低校准品中,可以降低抗原之间的空间位阻,保留其更多的免疫反应性,使其能够更好地与目标待测物结合,排除多余未结合抗原的干扰,降低检测的背景值,可以进一步提高chagas的检测灵敏度。
在本发明的一个实施方案中,所述检测chagas抗体浓度的方法包括使用如上所述的试剂盒,通过化学发光免疫分析仪检测chagas抗体浓度。在本发明的一个优选的实施方案中,所述方法全自动地进行。根据本发明,所述化学发光免疫分析仪优选为Maglumi系列化学发光免疫分析仪(深圳新产业生物医学工程股份有限公司生产)。当使用化学发光免疫分析仪时,仪器可根据设定自动加样、检测和计算结果,可加快检测进程,减少人为误差。
根据本发明提供的chagas抗体检测试剂盒,包含以多种标记方式标记示踪标记物或者以多种包被方式包被磁性微球的chagas抗原或chagas二抗,利用间接检测法,提高结合特异性,可准确、灵敏、快速地测定样本中的chagas抗体浓度。
本发明还提供了一种预处理液,能够降低检测样本的非特异性结合,进一步提高反应灵敏度,并且该种预处理液能有效消除HAMA、RF等多种干扰免疫反应的因子,同时也可以作为样本的反应缓冲液进行使用,为Chagas抗原与磁性微球的特异性结合提供一个稳定良好的体系反应环境。
使用上述带有预处理液的试剂盒测定chagas抗体,可对检测试剂进行预处理优化,降低抗原之间的空间位阻,保留其更多的免疫反应性,使其能够更好地与目标待测物结合,排除多余未结合抗原的干扰,降低检测的背景值,可以进一步提高chagas的检测灵敏度。
本发明所述待测样本可为空白管血清、分离胶管血清、促凝剂管血清、EDTA血浆和肝素血浆中的任意一种。
本发明提供的chagas抗体检测方法,通过采用更为先进的化学发光免疫分析法,试剂盒的特异性及灵敏度得到了很大的提升,可以更好的服务于临床诊断。
本发明提供的chagas抗体检测方法,使用所提供的试剂盒,借助化学发光免疫分析仪,加样方式完全由仪器全自动操作,降低了人为因素对实验结果造成的干扰;大幅度缩短了测试时间,有利于临床上快速的得到检测数据。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合具体实施例,对本发明进行进一步详细说明。
本发明所述实施例采用Maglumi系列化学发光免疫分析仪(深圳新产业生物医学工程股份有限公司生产)进行检测。
chagas抗原来源:天然抗原或市场化的chagas重组抗原,如来源于Reckom公司的chagas重组抗原。
chagas商业化检测试剂盒来源:市场采购。
chagas二抗来源:美国Medix公司,人源性抗IgG抗体。
磁性微球来源:深圳新产业生物医学股份有限公司生产,浓度为0.6-1.2mg/mL,80%粒径分布为1-5μm,磁化强度为4000高斯时沉淀时间为10-15秒,BSA为30mg时蛋白吸附浓度为0.8mg-1.2mg。
ABEI来源:购自上海纪宁实业有限公司。
生物素来源:美国Biosources公司。
链霉亲和素来源:Roche公司。
chagas抗体校准品:来源于Fapon公司的兔抗血清。
以下为试剂盒各组分的制备方法:
制备1:包被chagas抗原的磁球悬浮液的制备
此制备步骤使用的免疫磁球选择Merck公司生产的浓度为100mg/mL,羟基为95mgKOH/g的纳米磁性微球悬浮液。
(1)缓冲液的配制:
称取2.55g三水合乙酸钠,用4500mL纯化水溶解,再加入14mL乙酸,混匀后,即得pH为3.6的醋酸缓冲液。
(2)磁球包被chagas抗原的反应:
将磁性微球中悬浮于5倍于包被体积的上述pH3.6醋酸缓冲液,使磁球浓度为20mg/mL;再加入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸盐(CMC),使其浓度为10mg/mL;按所得溶液与chagas抗原的重量比为200:3的比例加入chagas抗原,放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时。
(3)磁性微球的清洗:
清洗液的配置:以0.1mol/L的PBS缓冲液:纯化水=1:9的体积比配置pH为7.4的PBS缓冲液500mL,加入2.5gBSA混匀溶解,即为磁珠清洗液。
清洗:将步骤(2)中温育好的磁球倒入烧杯中,然后置于磁铁上沉淀后,倒掉上清,加入5倍体积的磁球清洗液搅拌清洗,然后放置在磁铁上,待上清液清亮后倒掉上清液,重复该清洗步骤四次。
(4)磁球的悬浮:
将步骤(3)清洗后的磁球加入包被体积的混合溶液(混合溶液主要成分:0.2g/mL的KH2PO4、2.9g/mL的NaHPO4、8g/mL的NaCl、2g/mL的NaN3、5g/mL的BSA,2mL/mL的吐温T-20,余量为纯化水)中,得到包被体积的磁球悬浮液,悬浮浓度为20mg/mL,即为包被了chagas抗原的磁球悬溶液。
上述chagas抗原以chagas二抗替代,即可完成包被chagas二抗的磁球悬浮液的制备。
制备2:包被SA的磁球悬浮液的制备
此制备步骤使用的免疫磁球选择Merck公司生产的浓度为100mg/mL,羟基为95mgKOH/g的纳米磁性微球悬浮液。
(1)缓冲液的配制:
称取2.55g三水合乙酸钠,用4500mL纯化水溶解,再加入14mL乙酸,混匀后,即得pH为3.6的醋酸缓冲液。
(2)磁球连接SA:
将磁球悬浮于5倍于包被体积的上述pH3.6醋酸缓冲液,使磁球浓度为20mg/mL;再加入CMC,使其浓度为10mg/mL;按所得溶液与SA的重量比为200:3μg的比例加入SA,放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时。
(3)磁球的清洗:
清洗液的配置:以0.1mol/L的PBS缓冲液:纯化水=1:9的体积比配置pH为7.4的PBS缓冲液500mL,加入2.5gBSA混匀溶解,即为磁珠清洗液。
清洗:将步骤(2)中温育好的磁球倒入烧杯中,然后置于磁铁上沉淀后,倒掉上清,加入5倍体积的磁球清洗液搅拌清洗,然后放置在磁铁上,待上清液清亮后倒掉上清液,重复该清洗步骤四次。
(4)磁球的悬浮:
将步骤(3)清洗后的磁球加入包被体积的混合溶液(混合溶液主要成分:0.2g/mL的KH2PO4、2.9g/mL的NaHPO4、8g/mL的NaCl、2g/mL的NaN3、5g/mL的BSA,2mL/mL的吐温T-20,余量为纯化水)中,得到包被体积的磁球悬浮液,悬浮浓度为20mg/mL,即为包被有SA的磁球悬溶液。
将上述步骤中的SA以FITC替换,即可制备得到相应的包被有FITC的磁球悬浮液。
制备3:生物素(Biotin)化的chagas抗原的制备
(1)pH9.5透析液的配置:在5000mL烧杯中加入Na2CO314.31g,NaHCO326.46g,加水定容至4500mL。将配制好的透析液置于磁力搅拌器上备用。
(2)选用截留量为14000的透析袋,量取合适的尺寸备用。取1mgchagas抗原,用透析液溶解并调整到1mL,放入透析袋中,搅拌透析2h。将透析好的溶液加入50μg生物素,37℃反应2h,得到生物素化的chagas抗原溶液。
(3)以G-25凝胶柱纯化上述反应得到的生物素化的chagas抗原溶液。
(4)在纯化后的生物素化的chagas抗原溶液中加入等体积的含5g/mL的BSA的保护液,即得。
上述chagas抗原以chagas二抗替代,即可制备得到生物素化的chagas二抗溶液。
制备4:标记有示踪标记物的chagas二抗的制备
本发明中,常用发光标记物有:鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物等。以ABEI(N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺)作为发光标记物为例,对其制备过程表述如下:
(1)pH9.5透析液的配置:在5000mL烧杯中加入Na2CO314.31g,NaHCO326.46g,加水定容至4500mL。将配制好的透析液置于磁力搅拌器上备用。
(2)选用截留量为14000的透析袋,量取合适的尺寸备用。取1mgchagas二抗,用上述配置的透析液溶解并调整到1mL,放入透析袋中,搅拌透析2h。将透析好的溶液加入100μgABEI-半琥珀酰胺酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(ABEI-hemisuccinimide-N-Hydroxysuccinimide),37℃反应2h,得到标记ABEI的chagas二抗溶液。
(3)以G-25凝胶柱纯化上述反应得到的标记ABEI的chagas二抗溶液。
(4)在纯化后的标记ABEI的chagas二抗溶液中加入等体积的含5g/mL的BSA的保护液,即得。
上述chagas二抗以chagas抗原替代,即可制备得到带有ABEI标记的chagas抗原。
制备5:chagas抗体低点、高点校准品的制备
以牛血清为溶剂,配制浓度为2.435index/mL的低点校准品,以及浓度为205.846index/mL的高点校准品。
一、试剂盒及其制备
本发明的目的之一在于提供一种检测chagas抗体的试剂盒及其制备方法。
为实现上述目的,本发明提供实施例1,其试剂盒组分及制备如下:
按照上述制备1制备得到包被chagas抗原的磁球悬浮液;
按照上述制备4制备得到标记有ABEI的chagas二抗;
按照上述制备5制备chagas抗体的低点校准品和高点校准品。
实施例1采用直接连接包被或标记的方式,操作简单,制备容易。
为进一步提升试剂盒的检测效果,本发明提供优选实施例2,其组分及制备如下:
按照上述制备2制备得到包被SA的磁球悬浮液;
按照上述制备3制备得到生物素化的chagas抗原;
将上述两步骤中得到的产物,按照磁球悬浮液与chagas抗原重量比为200:3的比例混合,放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时,清洗多次并重悬浮,得到间接包被有chagas抗原的磁球悬浮液。
按照上述制备4制备得到标记有ABEI的chagas二抗;
按照上述制备5制备chagas抗体的低点校准品和高点校准品。
本实施例中的SA与生物素也可以以FITC-抗FITC替代。
本实施例采用间接包被chagas抗原得到磁球悬浮液,采用间接法测定待测样本中的chagas抗体,可以减少空间位阻,降低非特异性结合,提高检测灵敏度。
为进一步提高试剂盒的检测效果,提升其灵敏度,本发明提供优选实施例3,所述试剂盒组份及制备如下:
按照上述制备2制备得到包被SA的磁球悬浮液;
按照上述制备3制备得到生物素化的chagas抗原;
将上述两步骤中得到的产物,按照磁球悬浮液与chagas抗原重量比为200:3的比例混合,放入恒温震荡水浴箱中37℃反应24小时,清洗多次并重悬浮,得到间接包被有chagas抗原的磁球悬浮液。
利用本发明提供的预处理液,以20μL磁球悬浮液:60μL预处理液的比例进行混合,37℃温育15min,进行预处理反应,然后磁分离后清洗,得到预处理后包被有chagas抗原的磁球悬浮液。
按照上述制备4制备得到标记有ABEI的chagas二抗;
按照上述制备5制备chagas抗体的低点校准品和高点校准品。
本实施例中,加入预处理液,能够降低检测样本的非特异性结合,进一步提高反应灵敏度,并且该种预处理液能有效消除HAMA、RF等多种干扰免疫反应的因子,同时也可以作为样本的反应缓冲液进行使用,为chagas抗原与磁性微球的特异性结合提供一个稳定良好的体系反应环境。
二、chagas抗体检测
本发明的目的之一,在于提供一种以本发明检测试剂盒检测chagas抗体的方法。利用本发明提供的检测试剂盒,以间接法进行chagas检测,可以避免传统双抗原夹心法抗原抗体之间结合特异性差的弊端,提高结合特异性,可准确、灵敏、快速地测定样本中的chagas抗体浓度。
本发明在上述间接检测法的基础上,利用增加的预处理液对试剂盒中的成分进行预处理优化,降低抗原之间的空间位阻,保留其更多的免疫反应性,使其能够更好地与目标待测物结合,排除多余未结合抗原的干扰,降低检测的背景值,可以进一步提高chagas的检测灵敏度。
为证明上述技术效果,本发明利用第一部分中所述的实施例2(标记为试验1方案)及实施例3(标记为试验2方案)制备得到的检测试剂盒,同时按照专利文献US6203974(B1)记载的技术,制备双抗原夹心法为原理的检测试剂盒(标记为对比试验方案,按照专利记载步骤进行操作),以及市场上购买的商品化chagas检测试剂盒(标记为参照试验方案,按照产品说明书进行操作),利用深圳市新产业生物生产的Maglumi2000Plus免疫分析仪进行试验。
标准曲线的测定:在测定试验开始之前,利用试剂盒中的高、低校准品(Chagas抗体的兔抗血清,Fapon公司,原始浓度为500000index/mL),用夹心法稀释十个浓度点,通过两点定标法校正曲线计算得到工作曲线。
其中,试验1利用第一部分中实施例2中制备的试剂盒,具体操作如下:
1)将20μL待测样本、高低浓度校准品加入到反应杯中;
2)加入20μL间接包被有chagas抗原的磁球悬浮液;
3)37℃温育15min,置于磁环境下清洗3次;
4)加入150μL人源性IgGchagas二抗标记的ABEI;
5)37℃温育15min,置于磁环境下清洗3次;
6)加入发光激发底物1(NaOH)和发光激发底物2(H2O2),检测光信号强度;
7)利用校准品修正后的工作曲线,根据待测样本检测得到的光强度,计算得出待测样本的chagas浓度。
试验2利用第一部分中实施例3中制备的试剂盒,在试验1的步骤2)与步骤3)之间加入60μL预处理液进行预处理优化,后续操作不变,得到试验2的检测数据。
按照上述设定的试验1方案、试验2方案及对比试验方案,同时按照商品化参照试剂盒的产品说明书记载的参照试验方案,对待测样本进行数据检测。实施例中所用待测样本包括:采购自Seracare公司的chagas定性血清盘(0845-0073)、chagas阳转盘(0615-0038),以及从美洲地区医院收集到的118例chagas临床标本(该118例样本经确诊,包含70例阴性样本,30例阳性样本,阳性样本编号为03、05、07、14、17、27、34、42、47、49、51、55、57、59、67、69、71、73、75、76、77、80、82、85、89、91、96、98、99、106)。
检测试验一:定性血清盘样本检测
Seracare的chagas定性血清盘(0845-0073)编号01-20为阳性样本,21为阴性样本。利用上述三种试验方案,对Seracare公司的chagas定性血清盘(0845-0073)进行测定,结果如表1所示:
表1、chagas定性血清盘测定结果
从表一的对比结果可以看出:试验1方案和参照试验方案的检测结果基本接近;试验2方案的检测结果,阳性样本的结果均明显高于参照试验及试验1方案阳性样本的结果,而阴性样本的结果则明显低于参照试验及试验1方案阴性样本的结果,说明试验2方案高值样本与低值样本的区分度更好,具有更高的灵敏度;而对比试验方案相较于其他方案,灵敏度最差,且阴性样本的非特异也较高。
检测试验二:阳转盘样本检测
Seracare阳转盘(0615-0038)编号01-10分别为自接种后第一次取血间隔不同天数的样本。利用所述三种试验方案,对Seracare公司的chagas阳转盘(0615-0038)进行测定,结果如表2所示:
表2、chagas阳转盘测定结果
从表2数据结果分析可以得出:在相同阳转天数的情况下,试验1方案的检测结果略高于参照试验方案的结果;试验2方案与参照试验方案及试验1方案相比,检测值明显较高;如检测相同水平的浓度,三者所需的阳转时间,参照试验最长,试验1方案次之,而试验2方案所需时间最短,由此可知,试验2方案比参照试验方案及试验1方案可更早检测到转阳,说明三者中,试验2方案检测的灵敏度最高,试验1方案次之,参照试验最差;而对比试验方案在检测相同水平的浓度时,所需时间最长,说明对比试验方案在四者中的检测灵敏度最差。
检测试验三:临床标本样品检测
针对从美洲地区医院收集到的118例chagas临床标本(该118例样本经确诊,包含70例阴性样本,30例阳性样本,阳性样本编号为03、05、07、14、17、27、34、42、47、49、51、55、57、59、67、69、71、73、75、76、77、80、82、85、89、91、96、98、99、106),利用所述三种试验方案对其进行测定,结果如表3所示:
表3、118例克氏锥虫抗体的临床标本检测数据
根据行业判定标准,chagas浓度﹥1index/mL即判定其为阳性样本。从表3临床标本的检测结果可以看出:试验1方案及试验2方案检测结果的阴阳性与参照试验方案检测结果保持一致,符合临床样本的阴阳性结果;试验1方案阳性样本的检测结果普遍略高于参照试验方案,试验2方案阳性样本的检测结果明显高于试验1方案及参照试验方案,且阴性的结果非特异很低,说明试验方案2的检测灵敏度要高于试验1方案和参照试验方案;对比试验方案的检测结果中,标号为20、63、93、102的4例样本与临床标本的诊断结果不符,阴性样本的非特异情况非常明显。
综合上述三个检测试验的结果可知:根据试验1方案中的间接法进行chagas抗体检测,可以避免传统双抗原夹心法抗原抗体之间结合特异性差的弊端,提高结合特异性,可准确、灵敏、快速地测定样本中的chagas抗体浓度。
根据试验2方案,采用预处理液处理生物素化chagas重组抗原—链霉亲和素的抗体复合物,预处理液中的保护性蛋白和糖类等成分能够显著降低杂蛋白非特异性结合的干扰;同时,预处理液中的表面活性剂等成分能够使得链霉亲和素磁球和生物素化重组抗原在体系中更好的混合接触并发生特异性结合,降低了生物素化重组抗原的空间位阻,保留了抗原更多的免疫反应性,从而更好的捕获样本中的chagas抗体;生物素化chagas重组抗原—链霉亲和素抗体复合物再经过预处理液的洗涤,通过磁分离进一步排除多余未结合生物素化重组抗原对后续反应的干扰,可以进一步降低后续的非特异性反应。
虽然本发明已作了详细描述,但对本领域技术人员来说,在本发明精神和范围内的修改将是显而易见的。此外,应当理解的是,本发明记载的各方面、不同具体实施方式的各部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部分互换。在上述的各个具体实施方式中,那些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当地与其它实施方式组合,这是将由本领域技术人员所能理解的。此外,本领域技术人员将会理解,前面的描述仅是示例的方式,并不旨在限制本发明。
Claims (14)
1.一种用于检测克氏锥虫抗体的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括组分A和组分B,其中组分A为标记有示踪标记物或包被磁球的克氏锥虫抗原,组分B为包被磁球或标记有示踪标记物的克氏锥虫二抗;并且,组分A和组分B中的任意一种标记有示踪标记物,另一种则包被磁球;
其中,所述克氏锥虫二抗为抗人IgG抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述示踪标记物为金刚烷、鲁米诺及其衍生物、异鲁米诺及其衍生物、吖啶酯中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述示踪标记物为N-(4-氨丁基)-N-乙基异鲁米诺。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述磁球为Fe2O3或Fe3O4磁性纳米粒子与有机高分子材料的复合体,并具有0.1-5μm的粒径;并且,所述磁球任选地通过表面改性而带有一种或多种活性功能基团。
5.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,
所述示踪标记物直接或间接地标记克氏锥虫二抗,并且间接标记的方式包括通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或链霉亲和素与生物素体系进行间接标记;
所述克氏锥虫抗原直接或间接地包被磁球,并且间接包被磁球的方式包括通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或链霉亲和素与生物素体系进行间接包被。
6.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括组分C预处理液,所述预处理液的成分包括:牛血清白蛋白、新生牛血清、羊血清、鼠血清、Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘露醇、丙三醇、酪蛋白、乙二胺四乙酸二钾、TritonX-100、十二烷基硫酸钠、甘氨酸、PEG6000和防腐剂。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述预处理液中各组分的含量如下:0.1~15质量%的牛血清白蛋白、10~2质量%的新生牛血清、0.1~5质量%的羊血清、0.1~5质量%的鼠血清、1~100mmol/L的Tris-HCl缓冲液、1~100mmol/L的磷酸盐缓冲液、0.1~2质量%的甘露醇、0.1~2质量%的丙三醇、0.1~5质量%的酪蛋白、0.1~2质量%的乙二胺四乙酸二钾、0.1~2质量%的TritonX-100、0.05~1质量%的十二烷基硫酸钠、0.01~1质量%的甘氨酸、0.01~1质量%的PEG6000和0.01~1质量%的防腐剂。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括克氏锥虫抗体的低点校准品和高点校准品,并任选地包括缓冲液。
9.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,在所述试剂盒中,磁球的浓度为0.1~2mg/mL,克氏锥虫抗原的浓度为50~5000ng/mL,示踪标记物的浓度为5~500ng/mL,克氏锥虫二抗的浓度为50~5000ng/mL。
10.一种用于制备如权利要求1-9中任意一项所述的试剂盒的方法,所述方法包括:将克氏锥虫二抗直接或间接标记示踪标记物,将克氏锥虫抗原直接或间接包被磁球。
11.根据权利要求10所述的方法,其特征在于,
所述间接标记包括将示踪标记物通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或链霉亲和素与生物素体系标记所述克氏锥虫二抗;
所述间接包被包括将所述克氏锥虫抗原通过异硫氰酸荧光素与抗异硫氰酸荧光素抗体体系或链霉亲和素与生物素体系间接包被磁球。
12.根据权利要求11所述的方法,其特征在于,在所述间接包被的过程中,以预处理液进行预处理反应。
13.一种检测克氏锥虫抗体的方法,其特征在于,所述方法包括使用如权利要求1-12中任意一项所述的试剂盒,通过化学发光免疫法检测待测样品中的克氏锥虫抗体浓度。
14.根据权利要求13所述的方法,其特征在于,所述方法包括:将所述试剂盒的组分A和组分B与待测样品混合,温育,经磁分离,向沉淀物中加入激发底物,检测光信号强度;以同样方法测定克氏锥虫抗体的低点校准品和高点校准品的光信号强度,并获得克氏锥虫抗体的浓度与发光强度之间的标准曲线;将检测得到的待测样品的光信号强度与标准曲线对照,获得待测样品中的克氏锥虫抗体浓度。
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