CN101196518B - 丙型肝炎病毒抗体化学发光法诊断试剂盒及其制备方法 - Google Patents

丙型肝炎病毒抗体化学发光法诊断试剂盒及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种化学发光法检测丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法、检测方法。将包被用HCV重组抗原加入到缓冲液中,混匀,移至发光微孔板内,4℃温育18小时,洗涤发光板后,加入封闭液,温育后弃去液体,充分干燥发光板,完成预包被发光板的制备;将标记用抗人IgG与辣根过氧化物酶用改良过碘酸钠法结合,完成酶标记物的制备;用鲁米诺、Tween20及发光增强剂制备化学发光底物液A,用双氧水制备化学发光底物液B,试剂盒中还包含有样品稀释液,浓缩洗涤液,阴性对照为正常人血清,阳性对照为含HCV抗体阳性混合血清的人血清。本发明的试剂盒比ELISA具有更高的检测灵敏度,安全可靠,操作简便,成本低廉,并不需要昂贵的全自动化学发光测量仪。

Description

丙型肝炎病毒抗体化学发光法诊断试剂盒及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种丙型肝炎病毒(HCV)抗体诊断试剂盒(化学发光法)及其制备方法,以及使用这种试剂盒的检测方法。

背景技术

[0002] 丙型肝炎病毒(HCV)为一线状单股正链RNA病毒,属黄病毒属。HCV呈全世界分布, 据⑶C调查发现,HCV的发病率约为7. 1/10万,目前全世界的HCV感染者超过1. 7亿人,其中我国占4000万以上。HCV的主要传播途径为:1.静脉注射毒品、共用针头及注射器(> 40% ) ;2.性接触及家庭成员的密切接触(10% ) ;3.输血或血制品) ;4.医源性传播 (3%) ;5.垂直传播;6.原因不明(45%)。我国的HCV感染途径主要以输血或血制品为主, 尤其反复输入多个献血员血液或血制品更易发生。

[0003] 目前尚无有效的治疗丙型肝炎方案,预防丙型肝炎最有效的方法是切断传染源, 特别是加强血液安全检测,因此采取有效的HCV检测试剂尤为重要。

[0004] 目前用于HCV感染诊断的两项主要指标为HCV抗体和HCV-RNA,HCV抗体检测是常规检测方法,包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫印迹试验(WB)、重组免疫印迹法 (RIBA)、免疫印迹条法(RIBA)及免疫荧光试验(IFA)等。HCV-RNA的检测方法主要是PCR 检测,HCV-RNA检测阳性是HCV感染的最好标志。随着血液制品在世界范围的流通,HCV感染呈世界性分布,为了控制丙型肝炎病毒的血液传播,世界各国均开展了对献血员HCV抗体的检测。1991年起,我国卫生部要求对每一个献血员进行HCV抗体的筛查。常用的HCV 抗体诊断试剂采用间接酶联免疫法(ELISA),第一代HCV抗体ELISA采用的抗原C100-3是 HCV非结构基因(NS3/NS4)和人超氧化物歧化酶基因嵌合后表达的融合蛋白,灵敏度低,漏检率较高;第二代HCV抗体ELISA在第一代基础上增加了核心区重组蛋白C22和NS3区重组蛋白C33c,虽然在灵敏度和特异性上有很大改善,但仍不能排除由于重组融合蛋白带来的少数假阳性和极少数的漏检。目前我国多采用第三代HCV抗体ELISA试剂,其包被抗原为HCV核心抗原、NS3、NS4和NS5抗原,特异性超过99 %,并进一步提高了试剂的敏感性, 对于免疫功能正常的HCV RNA阳性感染者,HCV抗体检出率也高于99%,但仍然存在“窗口期”漏检的问题。

[0005] 外周血中检出HCV-RNA是HCV复制活跃的可靠指标,在感染HCV的1_2周内血清中可检测到HCV-RNA,在感染HCV自然恢复前血清中HCV-RNA将达到一个高峰,但HCV-RAN 在达到峰值或重新出现前数天或数周内偶尔也可能检测不到。在大多数向慢性转化的HCV 感染者中,HCV-RNA含量降低速度逐渐减慢,最后趋于稳定,晚期肝病患者的HCV-RNA水平很低,甚至无法测出。

[0006] 化学发光免疫分析(Chemiluminescence Immunoassay, CLIA)于 1977 年问世, 1985年第一代化学发光免疫试剂盒研制成功并投放市场。进入九十年代,化学发光免疫分析试剂盒的研制和自动化测量仪的生产取得了突破性进展,从而进入高速发展阶段。化学发光免疫分析是继荧光、放射性同位素和酶免疫分析之后发展起来的一项新的免疫分析技术,根据大量的实验结果及临床应用资料,从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看,在非放射性标记分析技术中化学发光免疫分析处于领先地位,代表了当今世界发展的方向和潮流,它不仅具有免疫反应的特异性,而且具有化学发光反应的高灵敏性(检测限度可达 10_15〜10 _18mol/L)。化学发光免疫分析技术具有灵敏度高、快速、准确、重复性好、效期长并安全无毒无污染等优点,成为取代放射免疫分析和酶免疫分析技术的首选。

[0007] 化学发光酶免疫分析是以酶标记生物活性物质(如酶标记的抗原或抗体)进行免疫反应,免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物,在信号试剂作用下发光,用发光信号测定仪进行发光测定。目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶(HRP),HRP常用的底物为鲁米诺 (3-氨基邻苯二甲酰胼,luminol)或其衍生物如异鲁米诺(4-氨基邻苯二甲酰胼)等,鲁米诺的氧化反应在碱性缓冲液中进行,在过氧化物酶及活性氧的存在下,生成激发态中间体, 当其回到基态时发光,其波长为425nm。发光强度依赖于酶免疫反应物中酶的浓度。

[0008] 然而,现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒均为封闭式全自动化学发光测量系统,需要昂贵的全自动化学发光测量仪,价格昂贵,操作复杂,从而限制了推广使用,无法有效广泛地应用于临床诊断和科研工作。

[0009] 发明内容

[0010] 本发明提供了一种采用辣根过氧化酶(HPR)标记抗体的开放式操作化学发光免疫分析系统,它简便快速,适用性广,试剂成本低并不需要昂贵的全自动化学发光测量仪, 同时,由于采用了独创的化学发光物底液,在检测丙型肝炎病毒抗体上具有很高的灵敏度。

[0011] 本发明提供了一种丙型肝炎病毒(HCV)抗体诊断试剂盒(化学发光法),其包括辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人IgG抗体,HCV抗原包被板,化学发光底液和阴阳性对照。

[0012] 具体的说,这种试剂盒包括HCV抗原包被板48或96孔、酶标记物1瓶、化学发光底物液1-2瓶、20倍浓缩洗涤液1瓶、阴性对照和阳性对照各1瓶、样品稀释液1瓶以及其它辅助试剂。

[0013] 本发明同时提供了一种独创的化学发光底物液,它由以下方法制备而成:

[0014] A液:在双蒸水中加入iTris和浓HCl配成0. IM pH8. 5的Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入Luminol、Tween20以及苯并荧蒽(结构如下图所示),混合均勻。

[0015] B液:在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸,配制成0. IM pH4. 6的柠檬酸缓冲液, 在此溶液中加入30%过氧化氢溶液。

[0016] 使用前将A液与B液按1 : 1比例混合后使用。

[0017]

Figure CN101196518BD00051

[0018] 本发明提供了一种丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒(化学发光法)的制备方法,其包括:(I)HCV抗原包被发光板的制备

[0019] 将包被用HCV重组抗原加至碳酸盐缓冲液中混勻,加入发光板内,每孔lOOuL,4°C 温育过夜,用含有TWerm20的磷酸盐缓冲液洗涤发光板3遍后,再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液,室温静置2小时后,弃去孔内液体,彻底干燥发光板,于铝钼袋真空包装,放2-8°C保存。

[0020] (2)辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体的制备

[0021] 用改良的过碘酸钠法将羊抗人IgG抗体和辣根过氧化物酶联结在一起。

[0022] (3)化学发光底物液的制备

[0023] A液:在双蒸水中加入iTris和浓HCl配成0. IM pH8. 5的Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入Luminol、Tween20以及苯并荧蒽(结构如下图所示),混合均勻。

[0024] B液:在双蒸水中加入柠檬酸三钠和柠檬酸,配制成0. IM pH4. 6的柠檬酸缓冲液, 在此溶液中加入30%过氧化氢溶液。

[0025] 使用前将A液与B液按1 : 1比例混合后使用。

[0026]

Figure CN101196518BD00061

[0027] (4)其它组分的制备:

[0028] 样品稀释液为含有指示剂的磷酸盐缓冲液,洗涤液为含有Tween20的磷酸盐缓冲液,阴性对照为混合的正常人血清,阳性对照为新生牛血清稀释的HCV抗体阳性人血清。

[0029] 本发明还提供了一种使用本发明试剂盒的丙型肝炎病毒抗体的检测方法,其包括:

[0030] (1)自2-8°C冰箱中取出试剂盒,室温平衡15分钟。

[0031] (2)取出包被板条,插入板架上。

[0032] (3)每次实验设阴性对照孔,阳性对照孔,每孔分别加入阴性对照或阳性对照 lOOul,样品孔中每孔加入样品稀释液ΙΟΟμ 1,再加入样品10 μ 1,振荡混勻后贴上封板膜, 置37°C温育30分钟。

[0033] (4)甩去反应液,每孔加满稀释后的洗涤液,洗板5次,最后在干净的吸水纸上扣干。

[0034] (5)除空白孔外,每孔加入酶标记物lOOul,贴上封板膜,静置37°C温育30分钟。

[0035] (6)甩去反应液,每孔加满稀释后的洗涤液,洗板5次,最后在干净的吸水纸上扣干。

[0036] (7)使用前将化学发光底物液A和B以1 : 1混合,各孔均加入50ul的化学发光底物混合液,混合均勻,置室温避光反应5分钟。

[0037] (8)在发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU)。

[0038] (9)根据待测样本的RLU值与临界值的比值S/C0值判断。若S/C0值彡1,则为阳性反应,说明样本中含有HCV抗体;若5/0)值< 1,则为阴性反应,说明样本中不含有HCV抗体。

[0039] 本发明的试剂盒采用的是化学发光免疫分析技术,比ELISA具有更高的检测灵敏度,安全可靠,操作简便,成本低廉,不需要昂贵的全自动化学发光测量仪,为临床HCV抗体的检测和血液安全筛查提供了一种新的检测方法。

[0040] 本发明试剂盒经中国药品生物制品检定所用国家参考品检定的结果显示:该试剂盒的阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、灵敏度、精密性和稳定性均符合国家标准。

[0041]

Figure CN101196518BD00071

[0042] 本发明试剂盒的临床考核结果:经北京友谊医院、中国人民解放军总医院和吉林市中心医院3家医院临床考核,实验结果见下表:

[0043]

Figure CN101196518BD00072

具体实施方式

[0044] 1、本发明检测丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒组份实施例:

[0045] (1)、用HCV抗原包被的预包被发光板

[0046] (2)、用辣根过氧化物酶标记的酶标抗人IgG结合物

[0047] (3)、含有指示剂的HCV样品稀释液

[0048] (4)、含有Tween20磷酸盐缓冲液的洗涤液

[0049] (5)、含有鲁米诺、Tween20及其增强剂苯并荧蒽的化学发光底物液A

[0050] (6)、含有过氧化氢的化学发光底物液B

[0051] (7)、为正常人血清的阴性对照

[0052] (8)、为新生牛血清稀释HCV抗体阳性人血清的阳性对照

[0053] 2、本发明检测丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒的制备方法实施例:

[0054] I、用HCV抗原包被的预包被化学发光板的制备

[0055] 将包被用HCV重组抗原加至碳酸盐缓冲液中混勻,加至发光板内,每孔lOOuL,4°C 温育过夜,用含有TWerm20的磷酸盐缓冲液洗涤发光板3遍后,再加入含有BSA的磷酸盐缓冲液,室温静置2小时后,弃去孔内液体,彻底干燥发光板,于铝钼袋真空包装,完成HCV 抗原包被的预包被发光板的制备。

[0056] II、用辣根过氧化物酶标记的酶标抗人IgG结合物

[0057] 将标记用的羊抗人IgG抗体和辣根过氧化物酶用改良过碘酸钠法结合在一起,完成用辣根过氧化物酶标记的酶标结合物。

[0058] 以标记IOmg抗人IgG抗体为例,其具体步骤如下:

[0059] (1)称取5mgHRP溶解于Iml双蒸水中。

[0060] (2)于上液中加入0. 2ml新配的0. IM NaIO4溶液,室温下避光搅拌30分钟。

[0061] (3)将上述溶液装入透析袋中,对ImM pH4. 4的醋酸钠缓冲液透析,4°C过夜。

[0062] (4)加20 μ 1 0. 2Μ ρΗ9· 5碳酸盐缓冲液,使以上醛化HRP的ρΗ升高到9. 0〜9. 5, 然后立即加入IOmg羊抗人IgG在Iml 0. OlM碳酸盐缓冲液中,室温避光轻轻搅拌2小时。

[0063] (5)加0. Iml新配的4mg/mlNaBH4液,混勻,再置4°C 2小时。[0064] (6)将上述液装入透析袋中,对0. 15M pH7. 4PBS透析,4°C过夜。

[0065] (7)在搅拌下逐滴加入等体积饱和硫酸铵,置4°C 1小时。

[0066] (8) 3000rpm离心半小时,弃上清。沉淀物溶于少量0. 15M pH7. 4的PBS中。

[0067] (9)将上述溶液装入透析袋中,对0. 15M pH7. 4的PB缓冲盐水透析,去除铵离子后,10,OOOrpm离心30分钟去除沉淀,上清液即为所需的酶结合物,加入等量优质丙三醇, 分装后,-20°C保存。

[0068] III、化学发光底物液的制备

[0069] A 液:在 IOOml 双蒸水中加入 1. 21g iTris 和 295 μ L 浓 HCl 配成 0. IM ρΗ8. 5 的 Tris-HCl缓冲液。在此缓冲液中加入0. 5g的Lumino 1,20 μ L的Tween20以及0. Ig苯并荧蒽(结构如下图所示),混合均勻。

[0070] B液:在IOOml双蒸水中加入柠檬酸三钠0. 73g和柠檬酸0. 44g,配制成0. 1ΜρΗ4. 6 的柠檬酸缓冲液,在此溶液中加入IOOyL 30%过氧化氢溶液。

[0071] 使用方法:使用前将A液与B液按1 : 1比例混合后使用。

[0072]

Figure CN101196518BD00081

IV、其它组分的包括

[0073] 样品稀释液为含有指示剂的磷酸盐缓冲液,洗涤液为含有Tween20的磷酸盐缓冲液,阴性对照为混和正常人血清,阳性对照为新生牛血清稀释的HCV抗体阳性人清。

[0074] 3、用于检测丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒检测样品中HCV抗体的检测方法实施例:

[0075] a、加样:取HCV抗原包被板,平衡至室温后,每次实验设阴性对照3孔,阳性对照2 孔,每孔分别加入lOOul,样品孔中每孔加入样品稀释液lOOul,再加入样品10ul,混勻,贴上封板膜,置37°C温育30分钟;

[0076]b、洗板:甩去反应液,用稀释后的洗涤液洗板5次,最后在干净的吸水纸上扣干;

[0077]c、加酶:除空白孔外,每孔加入酶标记物lOOul,贴上封板膜,静置370C 30分钟;

[0078]d、洗板:方法同b ;

[0079]e、底物:使用前将化学发光底物液A和BWl : 1混合,置室温避光反应5分钟;

[0080] f、测量:在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU),测量时间1秒/孔;

[0081] g、结果判定:根据测定OD值与临界值的比值S/C0值判断。若5/0)值> 1,则为阳性反应,说明样本中含有HCV抗体;若5/0)值< 1,则为阴性反应,说明样本中不含有HCV 抗体。

Claims (8)

1. 一种丙型肝炎病毒抗体化学发光法诊断试剂盒,其包括辣根过氧化物酶标记的抗人 IgG抗体,丙型肝炎病毒抗原包被板,化学发光底物液,其特征在于其中化学发光底物液由通过以下方法制备:A液:在 IOOml 双蒸水中加入 1. 21g Tris 和 295 μ L浓HCl 配成0. IM ρΗ8. 5 的 Tris-HCl 缓冲液,在此缓冲液中加入0. 5g鲁米诺、20 μ L吐温-20以及0. Ig苯并荧蒽,苯并荧蒽结构如下图所示,混合均勻;B液:在IOOml双蒸水中加入柠檬酸三钠0. 73g和柠檬酸0. 44g,配制成0. IM pH4. 6的柠檬酸缓冲液,在此溶液中加入100μ L 30%过氧化氢溶液; 使用前将A液与B液按1 : 1比例混合后使用,
Figure CN101196518BC00021
2.权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体的制备方法是改良过碘酸钠法。
3.权利要求1,2所述的试剂盒,其特征在于包被板是不透光的白色微孔板。
4.权利要求1,2所述的试剂盒,其特征在于,该试剂盒包括丙型肝炎病毒抗原包被板、 酶标记物1瓶、化学发光底物液1-2瓶、20倍浓缩洗涤液1瓶、阴性对照和阳性对照各1瓶、 样品稀释液1瓶。
5.权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,其中的洗涤液是含有吐温-20的磷酸盐缓冲液的洗涤液。
6.权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,其中的阴性对照是混合的正常人血清。
7.权利要求4所述的试剂盒,其特征在于,其中的阳性对照是用新生牛血清稀释的丙型肝炎病毒抗体阳性人血清。
8.根据权利要求1所述的丙型肝炎病毒抗体化学发光法诊断试剂盒的制备方法,其包括:(1)丙型肝炎病毒抗原包被发光板的制备将包被用丙型肝炎病毒重组抗原加至碳酸盐缓冲液中混勻,加至发光板孔内,每孔 100uL,4°C温育过夜,用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤发光板3遍后,再加入含有BSA 的磷酸盐缓冲液,室温静置2小时后,弃去孔内液体,彻底干燥发光板,于铝钼袋真空包装, 放2-8 °C保存;(2)辣根过氧化物酶标记抗人IgG抗体的制备用改良的过碘酸钠法将羊抗人IgG抗体和辣根过氧化物酶联结在一起;(3)化学发光底物液的制备A液:在 IOOml 双蒸水中加入 1. 21g Tris和 295 μ L浓HCl 配成 0. IM ρΗ8. 5 的 Tris-HCl 缓冲液,在此缓冲液中加入0. 5g鲁米诺、20 μ L吐温-20以及0. Ig苯并荧蒽,苯并荧蒽结构如下图所示,混合均勻,B液:在IOOml双蒸水中加入柠檬酸三钠0. 73g和柠檬酸0. 44g,配制成0. IM pH4. 6的柠檬酸缓冲液,在此溶液中加入IOOyL 30%过氧化氢溶液, 使用前将A液与B液按1:1比例混合后使用,
Figure CN101196518BC00031
(4)其它组分的制备:样品稀释液为含有指示剂的磷酸盐缓冲液,洗涤液为含有吐温-20的磷酸盐缓冲液, 阴性对照为混合的正常人血清,阳性对照为新生牛血清稀释的丙型肝炎病毒抗体阳性人血清。
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李晓霞.增强化学发光免疫分析的研究进展.《延安大学学报(自然科学版)》.2002,第21卷(第4期),48-51. *
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