检测感染的多元方法
本发明涉及用于体外检测感染性微生物、特别是病毒感染的方法。本发明涉及同时检测针对该相同感染性微生物的总免疫球蛋白和免疫球蛋白M的方法。更具体来说,本发明涉及同时检测针对人类肝炎病毒的总免疫球蛋白和免疫球蛋白M的方法。
总的来说,由人体内微生物、特别是病毒例如肝炎病毒引起的感染,构成了引人注目的健康问题,这个问题长期以来已经被意识到了,特别是在输血和诊断中。
一般来说,为了阻止感染因子、特别是肝炎病毒不受控制的蔓延,重要的是尽可能早地确定来自患者或输血用血袋的样品是否被这样的因子或病毒污染。此外,同样重要的是能够在感染的整个过程中跟踪患者的免疫状态,以便确定患者是否已进入恢复期,从而当后者发生时使用适合的治疗步骤和/或免疫接种。
用于体外检测这种类型的感染的方法,最通常是基于通过针对感染因子的抗体的免疫分析(或定量免疫测定)进行的检测。免疫球蛋白M(“IgMs”)出现得较早并且短暂,是最近的急性、或原发感染的标志。总免疫球蛋白,将各种免疫球蛋白同种型(IgM、IgG和IgA)聚集在一起,是慢性感染或感染持续时间、或患者的恢复期的标志。在急性感染后相当长的时间内,总免疫球蛋白主要由IgG构成,用于支持长期免疫(Hollinger等,Fields Virology,p.735-785,1996)。因此,重要的是能够在整个感染过程中在患者中区分IgMs和总免疫球蛋白。这在体外血清学中是非常普遍的情况。
具体来说,这种类型的问题发现在由肝炎病毒引起的人类感染病例中:甲型肝炎病毒感染被称为HAV;乙型肝炎病毒感染被称为HBV,等等。类似的情况也发现在人类的其它血液病毒的情况:HSV(单纯性疱疹病毒),CMV(细胞肥大病毒),登革热病毒,其它黄病毒(例如西尼罗病毒),风疹病毒,流感病毒,VZV(水痘带状疱疹病毒)等,各种不同细菌的情况(梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、博氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)等),以及各种单细胞寄生生物中(例如刚地弓形虫(Toxoplasma gondii))。
通过间接形式(将样品在带有靶抗原的固相上反应,然后通过标记的抗人类免疫球蛋白抗体观察)检测总免疫球蛋白,已经被了解许多年了,尤其是随着1970年代开创性的ELISA专利。但是,这种形式不是优选的,因为它易受非特异性干扰的影响,尤其是受可能存在于被测试样品中的类风湿因子的影响。
此外,FX Heinz等的“用于在血清和脑脊液中检测蜱媒脑炎病毒的两种不同酶免疫分析方法的比较”(″Comparison of two differentenzyme immunoassays fordetection of tick-borne encephalitis virus inserum and cerebrospinal fluid″(Journal of Clinical Microbiology,14:p.141-146,(1981))中提到,在用于检测IgM的间接EIA分析(免疫酶法分析)中,存在IgMs与IgGs之间的竞争,影响了最终检测的灵敏性和特异性。
通过“双抗原夹心(double antigen sandwich)”形式检测总免疫球蛋白(将待检测的带有免疫球蛋白的样品与带有抗原的固相进行反应,然后使用被可检测地标记的第二抗原观察),自从1978年就已经知道(Maiolini等,Journal of Immunological Methods,20(1978)p.25-34;还有公开的法国专利申请FR 2383446)。
通过“免疫球蛋白捕获”形式检测类型特异性免疫球蛋白,其本身也已被知道许多年了。它在1979年由Duermeyer W.等(Journal ofMedical Virology4(1979):p.25-32)描述,用于通过ELISA特异性检测抗HAV IgMs(也参见美国专利4,292,403)。该分析方法的原理是基于使用包被有抗人类IgM抗体的微板孔,向其中加入含有待检测IgMs的血样。在温育期后,洗涤微板的孔,加入已知量的HAV抗原,然后温育。最后,在进一步洗涤后,通过在存在针对HAV抗原并用酶标记的抗体(F(ab’)2)的情况下进行最后的温育,检测了任何与孔结合的抗原。美国专利4,273,756以同样的方式描述了类型特异性的“免疫球蛋白捕获”形式,用于检测针对各种不同肝炎病毒(HAV,HBV)的IgAs、IgDs、IgEs、IgGs和IgMs。
总的来说,在仅涉及HAV的诊断之外,出于明显的成本和简化的原因,当然已经进行了尝试,以开发同时检测早期的IgMs和较晚期的IgGs(一般来说占总免疫球蛋白的大部分)的方法。
正如Olli Meurman(“抗病毒IgM抗体的检测及其问题——综述”,在PeterA.Bachmann主编的《诊断病毒学新进展》中(“Detection ofantiviral IgM antibodiesand its problems-A review”,in NewDevelopments in Diagnostic Virology,PeterA.Bachmann editor,Springer-Verlag,Berlin Heidelberg New York 1983))和W.Duermeyer(《在A型肝炎的ELISA中使用的特异性IgM抗体检测的新原理》(《A newprinciple for the detection of specific IgM antibodies applied inan ELISA forhepatitis A》,Journal of Medical Virology 4(1979):p.25-32))所报道的,进行的尝试已被证明是费时的并过于繁琐。这是因为它们包含了分离各种不同免疫球蛋白类型的基本步骤,分离或者通过区带或蔗糖梯度超离心,或者通过凝胶过滤,或者通过使用葡萄球菌蛋白A或使用抗Fcγ抗体吸附IgGs,或者通过用β-巯基乙醇裂解IgMs进行。
另一种替代方案是组合两种不同的观察方法。Angarano等(Journalof ClinicalMicrobiology,June 1984,p.905-910)提出了用于同时检测抗HBc IgMs和总Igs(主要为IgG)的系统,被称为RIELISA(放射免疫酶联免疫吸附分析),它将用于检测总的抗HBc免疫球蛋白的竞争性放射免疫分析(来自Abbott Laboratories的CORAB分析)与用于检测抗HBcIgMs的间接ELISA免疫分析相组合。在两种分析方法中,将同样的抗原(重组HBc抗原)吸附到一个、并且只在一个固相上(聚苯乙烯珠子,放置在孔中),但是另一方面,使用了针对HBc抗原和放射活性标记(碘125)的抗体来检测总的抗HBc免疫球蛋白,并且在另一方面使用酶标记(使用过氧化物酶)的抗IgM抗体来检测抗HBcIgMs。Angarano等(如上)指出,唯一的关键点是抗原特异性抗体的标记应该是不同的,并且不应该干扰免疫球蛋白类型特异性抗体的标记。
显然,Angarano等的具有两种强制的不同的信号系统(即带有两种可检测标记)的系统决不是简单的:在首先同时进行两种分析方法的免疫步骤后,必须以复杂的方式分别并连续地测量信号。事实上,方法首先测量第一个与固相结合的放射活性信号,从而反映出总的抗HBc免疫球蛋白的滴度,然后在第二个步骤中,向珠子加入过氧化物酶标记的抗IgM抗体,然后在温育后,加入底物(H2O2)+发色体(OPD)混合物。在温育和显色后,使用盐酸终止该最后的反应并测量获得的最终光密度,它反映出抗HBc IgM滴度。
此外,正如可以注意到的,Angarano等的复合系统,值得赞扬的是明显区分了总的抗HBc免疫球蛋白滴度和抗HBc IgM滴度,但是需要采取特定的预防措施,这是由于与操作放射活性化合物(即碘125)相关的风险。最后,Angarano等的方法仍然不得不依靠在稀释缓冲液中加入热聚集免疫球蛋白G,来事先消除类风湿性因子(在用于检测IgM的间接免疫分析系统中固有的)的干扰。所有这些使得Angarano等的方法相对不利。
常规情况下,针对同样病毒的IgMs和IgGs的检测,主要通过在分离的侧相上执行两种免疫分析来进行,从而避免两种分析方法之间任何可能的干扰,从而获得清楚地区分的IgM和IgG信号。
因此,在常规的“免疫球蛋白捕获”形式中,不得不使用两种不同的固相,例如按照Duermeyer W.等(如上)的两个微板的孔,或按照Venture Technologies Malaisie的技术(Médecines et maladiesinfectieuses[Medicines and infectious diseases],33,2003,p.396-412)的两种硝酸纤维素条板。一种包被有抗IgM抗体,另一种包被有抗IgG抗体,样品加入到每种分析方法中。因此,这些技术需要执行两种不同的测试,因此相对不利。
此外,有可能使用多种类型的技术通过免疫分析方法检测免疫球蛋白:除了上面提到的ELISA和放射免疫分析之外,还存在着在异质或均质相等中,通过免疫荧光、免疫发光等的技术。还存在着基于颗粒免疫凝集的技术,其最终信号可以目测检测,或使用检测仪器进行定量,尤其是使用通过流式细胞术进行检测的仪器。通过流式细胞术进行测量的广为人知的优点之一是,它构成了检测被分析物的快速且灵敏的手段。
流式细胞术是基于微粒的悬浮液,以液流的形式在光线前方通过。电-光学传感器确保在一个时间只有单个颗粒通过光线前方。然后检测并记录由颗粒通过时光线的障碍引起的信号。
具体来说,美国专利6,872,578B2描述了多元免疫分析系统(即同时检测单一样品中几种被分析物的免疫分析系统)。该系统在异质质免疫分析中,组合使用了流式细胞术和几组固体颗粒。这些颗粒是磁性的,分别带有特异性可检测参数(即物理特征例如尺寸、独特的颜色或特异性荧光)。每组微粒含有一定范围的值,用于将颗粒区分成几个不重叠的组,可以通过适合于所指参数的自动化检测方法来进行辨别。
这些颗粒在不同组之间,各带有与表面结合的不同分析试剂。同一组的所有颗粒带有相同的试剂。这些颗粒的磁性特征允许在洗涤过程中自动化分离固相和液相。
具体来说,美国专利6,872,578B2描述了同时检测针对风疹病毒抗原的各种不同免疫球蛋白类型抗体(IgG和IgM)的例子。在该例子中,IgGs和IgMs使用第一种磁性颗粒进行免疫纯化,该颗粒用特异性针对待检测的IgGs和IgMs的抗原致敏。在该第一次温育后,在洗涤过程中消除了非特异性的免疫球蛋白。然后通过加入乙酸,将被吸附在颗粒上的抗原捕获的特异性免疫球蛋白释放到上清液中。然后将该上清液转移到另一个管中,通过夹心形式,使用固相和含有抗人类IgM和抗人类IgG抗体的结合物,对IgGs和IgMs进行分析。该技术是繁琐的,因为它需要预先处理样品,以便只保留抗原特异性Igs。
如同在Multimetrix GmbH公司(海德堡,德国)的“Multimetrix疏螺旋体IgG或IgM分析”系统的情况中那样,使用颗粒的混合物也是可能的,每种颗粒包被有不同的重组疏螺旋体抗原,并通过间接形式,使用荧光标记物(藻红蛋白)标记的抗IgG抗体和抗IgM抗体差异检测IgMs和IgGs。每个珠子的最终复合物的荧光,通过流式细胞术,使用LuminexCorporation公司的分析仪来测量。不需要洗涤步骤,因此使它成为简化的免疫分析方法。然而,方案需要几个反应管和几种在不同的试剂盒指称物下销售的试剂。按照获得的商业手册,该系统被描述为是灵敏和可靠的。在Klutts等(Journal of ClinicalMicrobiology,November 2004,p.4996-5000)的出版物中描述的在Bioplex上进行抗EBV IgG和IgM抗体的检测,其原理是相同的。与上述相同,它需要两种不同的试剂,免疫反应在两种不同的反应管中进行。这两种EBV分析使用了颗粒混合物,每种包被有不同的EBV抗原,通过间接形式,使用两种不同试剂盒,使用荧光标记物(藻红蛋白)标记的抗IgG抗体和抗IgM抗体差异检测IgMs和IgGs。每个颗粒的最终复合物的荧光,通过流式细胞术,使用Luminex Corporation公司的检测器来测量。
因此,对于能够简单执行、快速、灵敏、特异、定量或半定量并可重复的方法存在着真正的需求,为了在感染的整个持续时间并且也在免疫接种之前或之后的跟踪过程中进行筛查,该方法应该可以完全同时地自动检测并区分IgMs和总免疫球蛋白(总Igs),即使用一个并且只有一个未预先处理的样品,在一个并且只有一个分析容器中,在同样数量的温育中,使用单一信号系统,并且在一个并且只有一个信号读取时间中进行。
发明内容
因此,本发明的作者力图解决上面陈述的问题,为此,开发了使用一个并且只有一个优选未预先处理的生物样品,在一个并且只有一个容器中,同时检测针对同一个抗原的IgMs和总免疫球蛋白的替代方法。
因此,本发明的主题是用于微生物感染的体外诊断性检测的方法,包括同时检测生物样品中存在的、针对所述微生物的免疫球蛋白G或总免疫球蛋白以及免疫球蛋白M,该方法包括下列步骤:
a)将所述生物样品在存在颗粒的情况下放置在单一分析容器中,每个颗粒具有至少一个特异性可检测的物理参数,并属于至少两个不同的组,一组带有抗IgM捕获抗体,另一组带有源于所述微生物的捕获抗原,
b)在允许免疫复合物在每组颗粒上形成的条件下,将混合物温育,
c)除去没有结合到颗粒上的免疫球蛋白,
d)将步骤b)的混合物与至少一种标记的结合物温育,所述至少一种结合物只含有源于所述微生物的检测抗原,
e)除去没有结合到步骤b)的免疫复合物上的检测抗原,
f)利用能够区分上面提到的两组颗粒的检测器,同时检测每个颗粒上的步骤d)的免疫复合物,由此显示出针对所述微生物的免疫球蛋白G或总免疫球蛋白和/或免疫球蛋白M的存在或不存在。
根据具体的实施方案,所述颗粒的组彼此之间利用可以通过适合的检测器检测的荧光染料来区分。
有利的情况下,适合的检测器与流式细胞仪相关。
检测抗原的标记可以是直接的或间接的。例如,检测抗原可以带有生物素,它通过加入标记的亲和素或链亲和素来显示。
优选情况下,微生物是人类病毒,特别是人类肝炎病毒。
本发明的主题还有用于执行检测方法的诊断试剂盒或一组试剂,具体来说包含颗粒,每个颗粒带有至少一个特异性可检测的物理参数,并属于至少两个不同的组,一组带有抗IgM捕获抗体,另一组带有源于待检测微生物的捕获抗原。
发明详述
为了解决所述问题,本发明人首先进行了多元分析,用于在单一容器中同时检测样品(血清或血浆)中的抗HAV IgG和IgM,测试组合了两种免疫捕获形式(参见实验部分比较例1中方案和结果的详细情况,分析形式显示在图1中):
-第一种使用带有抗人类IgG抗体的超顺磁性颗粒,
-第二种使用带有抗人类IgM抗体的超顺磁性颗粒。
在温育(样品IgGs和IgMs的捕获以及第一种免疫复合物的形成)和第一次洗涤后,加入HAV抗原。在第二次温育后,HAV抗原(AgHAV)结合到形成的两种类型的复合物上。
第二次洗涤后,通过加入与荧光染料(藻红蛋白,用PE表示)结合的抗HAV单克隆抗体(Mab)来显示两种反应。在该结合物温育和第三次洗涤后,通过流式细胞术读取每个颗粒上的信号。通过使用流式细胞仪的两种适合的激光束分别读取信号,获得了IgM和IgG结果。
IgM检测达到了可接受的灵敏度,即使在低浓度下,这代表了HAV感染后相当常见的情况。
另一方面,在这种构型中,IgG检测的灵敏度明显不够,这是由于样品中IgGs的高的天然丰度(包含了所有抗原性特异性)。事实上,抗IgG超顺磁性颗粒非常快速地被样品中存在的对HAV非特异性的IgGs饱和,并且不再捕获足够的抗HAV IgG,特别是在低浓度的抗HAVIgG下。这导致分析灵敏度不足。
在总的抗HAV免疫球蛋白的检测中正是发生了这种情况,在这种检测中存在着临床灵敏度阈值,该阈值对于在免疫接种保护后跟踪的情况中检测抗HAV抗体来说是必需的。根据共识,这种保护性阈值被固定为20mUI/ml,与WHO的抗HAV抗体标准(97/646)相关。低于该值,个体没有受到保护;高于该值,IgG滴度足以确保个体受到保护以对抗病毒。
因此,本发明人设计了另一种分析形式,以解决上面的分析中描述的缺乏“IgG灵敏度”的问题。
完全令人吃惊的是,本发明人显示出下面实施例2描述的组合两种形式的多元系统(参见实验部分实施例2中方案和结果的详细情况,分析形式显示在图2中),能够在单一容器中同时检测低的IgG浓度而不降低IgM检测的灵敏度,此外,使得以完全灵敏和特异的方式区分抗HAV IgM抗体和总的抗HAV免疫球蛋白成为可能。
因此,该用于在单一容器中同时检测样品(血清或血浆)中的抗HAV IgG和IgM的方法[因此该方法是本发明的方法],组合了两种分析形式(根据Duermeyer W.等的“免疫球蛋白捕获”分析形式用于IgMs,根据Maiolini R.等的“双抗原夹心”分析形式用于IgGs):
-第一种使用带有抗人类IgM抗体的超顺磁性颗粒,
-第二种使用带有HAV捕获抗原的超顺磁性颗粒。
在温育(样品IgGs和IgMs的捕获以及第一种免疫复合物的形成)和第一次洗涤后,加入生物素酰化的HAV抗原。在第二次温育后,HAV抗原结合到形成的两种类型的复合物上。
第二次洗涤后,通过加入与荧光染料(藻红蛋白)结合的链亲和素来显示两种反应。在温育和洗涤后,通过流式细胞术读取每个颗粒上的信号。通过使用流式细胞仪的两种适合的激光束分别读取信号,获得了IgM和IgG结果。
本发明,导致了抗HAV IgMs和总Igs的灵敏和差异的检测,是完全令人吃惊的:这是因为在单一容器中按照本发明的方法组合两种形式是有高度风险的,在固定化的HAV抗原与固定化的抗IgM抗体之间存在着对样品中抗HAV IgMs的竞争。换句话说,因为在同一个容器中同时执行上述的两种形式,存在着样品的某些抗HAV IgMs将被精确用于捕获IgGs的带有HAV抗原的超顺磁性颗粒捕获(在图2中用虚线箭头表示),从而不再被检测为IgM的风险。这样的竞争将不可避免地导致IgM响应的检测完全不足(缺少灵敏性),因此使得在初期检测IgMs成为不可能。本领域技术人员将会完全认识到这种风险的大小,因此已经被清楚地被劝阻采用本发明的这种组合(多元系统)。
本发明人同样使用了本发明的多元方法来同时检测针对乙型肝炎病毒衣壳的IgG和IgM抗体(检测HB核心IgG和IgM抗体)。为此,参见实验部分实施例3以及图3中的分析形式。
在此基础上,发明人提出了以多元形式检测IgGs和IgMs的通用方法,可以适用于从诊断的观点来说重要的许多微生物,以检测IgGs和IgMs。
在下面的部分中,提供了对于理解本发明有用的一定数量的定义。
定义
在本发明的文本中,“生物样品”优选包括生物流体,例如血液、血浆、血清、尿液、脑脊液、唾液。优选情况下,样品是血浆或血清。测试样品优选为人类来源的,但是也可以源于需要进行微生物感染检测的动物。
在本发明的文本中,术语“多元检测”是指同时检测针对相同的或几种感染性微生物的至少两种类型的抗体,抗体选自血液中的免疫球蛋白M、G、A、D和E以及总免疫球蛋白。
术语“抗体”是指任何完整的抗体或抗体的含有或由至少一个抗原结合位点组成、允许所述抗体结合到抗原性化合物的至少一个抗原决定簇上的功能性片段。对于抗体片段的例子来说,可以提到的是Fab、Fab′和F(ab’)2片段,以及scFv链(单链可变片段)、dsFv链(双链可变片段)等。这些功能性片段具体来说可以通过遗传工程获得。
术语“抗原性片段”或“抗原”,是指感染性微生物例如甲型肝炎病毒的、能够在被感染的患者或在免疫接种的动物中诱导抗体合成的天然或重组蛋白的全部或一部分。
具体来说,表述“源于微生物的抗原”,不论是用于捕获还是检测,都是指选自所述微生物的裂解物、其已经被半纯化或纯化的天然抗原之一、重组蛋白、其片段和合成的肽的任何抗原。
术语“捕获抗原”是指与固相连接的抗原性片段,它能够被针对微生物的抗体例如抗HAV抗体所识别,并允许与后者亲和性结合。
术语“捕获抗体”是指与固相连接的抗体或抗体的一部分,它能够通过亲和性结合留住生物样品中存在的抗原性化合物的至少一个抗原性决定簇。
抗IgM捕获抗体和捕获抗原可以通过任何适合的技术连接到颗粒上。它们可以通过直接共价,或非共价的、特别是通过亲和性连接。直接共价连接可以通过活化颗粒上存在的羧基,经例如羟基琥珀酰亚胺或碳二亚胺引入键合来进行。
术语“检测抗原”是指标记的抗原,它使得通过免疫捕获方法检测IgM抗体,或通过常规的抗原-抗体-抗原夹心方法、也被称为“双抗原夹心”方法(Maiolini等,(1978))检测IgG抗体,成为可能。检测抗原与捕获抗原可以是相同的,也可以是不同的。
术语“标记的”是指直接标记(利用荧光染料,发光化合物等)和间接标记(例如利用本身被直接标记的抗体或抗原,或使用标记的“亲和对”试剂,例如但不是排他性的标记的亲和素-生物素对等)。
可用于本发明的情况中的单克隆抗体或多克隆抗体的生产,是常规技术的结果。
单克隆抗体可以按照和Milstein描述的淋巴细胞融合和杂交瘤培养的常规方法(Nature,256,p.495-497(1975))来获得。其它用于制备单克隆抗体的方法也是已知的(Harlow等主编《抗体实验指南》,Antibodies A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory(1988))。可以通过免疫哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔或甚至人类等)并通过产生杂交瘤的淋巴细胞融合技术(和Milstein,1975,同上),来制备单克隆抗体。
还存在着这种常规技术的可替代技术。例如,可以通过表达从杂交瘤克隆的核酸来生产单克隆抗体。抗体也可以通过噬菌体展示技术,通过将抗体cDNAs导入载体、典型为丝状噬菌体(例如用于大肠杆菌的Fuse5,Scott等,(Science,249,pp.386-390(1990)))来生产。后者构成了文库,并在其表面上显示scFv片段。构建这些抗体文库的方案描述在Marks等(1991)(J.Mol.Biol.,222,pp.581-597,(1991))中。
多克隆抗体可以按照常用的方案,从用本性为肽的抗原免疫的动物的血清获得。
一般来说,多肽、特别是重组多肽,或寡肽,可以用作例如免疫原。根据常规的方案,按照Benoit等描述的步骤[PNAS USA,79,pp.917-921(1982)],将兔用相当于1mg的肽免疫原进行免疫。
以4周的间期给动物注射200μg抗原,并在10到14天后取血。在第三次注射后,评估抗血清与使用氯胺-T方法制备的碘放射性标记的抗原性肽的结合能力。然后将它通过层析在含有羧甲基纤维素(CMC)的离子交换柱上纯化。然后将通过洗脱收集的抗体分子,通过本领域技术人员熟知的方法,例如使用DEAE Sephadex调整到所需浓度,以获得IgG级份。
术语“颗粒”是指任何颗粒,优选形状为接近球形的(因此它们一般被称为珠子),其尺寸可以为直径在0.3μm到100μm之间,优选在0.5μm到40μm之间。这样的颗粒由例如Luminex、Merck或Dynal公司制造。
颗粒优选由对生物样品的成分惰性的聚合物构成;它们是固态的,在样品中不溶解。使用的聚合物可以是聚酯、聚醚、聚烯烃、聚酰胺、多糖、聚氨基甲酸酯或纤维素。也可以使用粘合剂为颗粒提供完整性和结构。
可以将功能基团与这些聚合物掺和在一起,以便允许连接或结合生物学重要的大分子(蛋白、脂类、糖类、核酸)。这些本领域技术人员已知的功能基团,可以是酰胺官能团(-NH2)或铵官能团(-NH3+或-NR3+)、醇官能团(-OH)、羧酸官能团(-COOH)或异氰酸官能团(-NCO)。最常用于将COOH官能团导入聚烯烃的单体是丙烯酸或甲基丙烯酸。
试剂与颗粒表面的连接可以通过静电吸引、亲和相互作用、疏水相互作用或共价结合来进行。共价结合是优选的。
这里使用的颗粒的区别在于它们带有特异的可检测的物理参数,即用于通过流式细胞术将它们彼此区别开的差异标志物。优选情况下,使用至少两种类型的不同的标记物或参数。例如,颗粒可以用一种或多种各种适合浓度的染料(例如荧光、发光染料等)浸渍,或者用放射性同位素、酶等类型的标记物(Venkatasubbarao S.,“微阵列——现状与展望”,″Microarrays-Status and prospects″Trends inBiotechnology Dec 2004,22(12):630-637;Morgan等,“细胞测量珠阵列:适用于生物学各种领域的多元化分析平台”,″Cytometric bead array:a multiplexed assay platform with applications invarious areas of biology″,Clin.Immunol.(2004)100:252-266)。或者,可以使用各种不同尺寸的颗粒。
在优选实施方案中,可辨别的颗粒发射出发光或荧光信号。可以使用例如来自Luminex的超顺磁性荧光珠。
这些生理化学性质,也可以使在与生物样品反应过程中将这些微粒捕获的级份与没有结合的级份分离开,成为可能。这种分离可以通过尤其是离心、过滤或磁化来进行。通过磁化进行分离是优选的,为此,可以使用含有顺磁性、铁磁性、亚铁磁性和变磁性成分的珠子。顺磁性成分是优选的,例如铁、钴、镍或金属氧化物例如Mn2O3、Cr2O或Fe3O4。磁性成分的含量可以在2%到50%(以重量计)之间,优选在3%到25%之间。
在优选实施方案中,本发明使用了免疫分析方法,该方法将流式细胞术与使用颗粒状、优选为超顺磁性支持物作为固相(在同一个容器中使用几类或几组不同颗粒)相结合。
每组颗粒对于免疫反应来说是特异性的,并且可以通过生理化学性质(尺寸、颗粒尺寸分布、荧光和/或光密度)与其它颗粒区分。超顺磁性颗粒的性质便于洗涤步骤中固相与液相之间的分离,允许分析自动化。但是,所用的珠子不强制是超顺磁性的。对于可以使用的超顺磁性珠子来说,具体可以提到的是在美国专利6,872,578中描述的。根据本发明的方法,最终检测相一般包含:
i)利用能够区分上面提到的两组颗粒的信号的检测器,同时读取每个颗粒上步骤c)的标记的免疫复合物,
ii)分别获得每组颗粒的结果,以及
iii)将这些结果解释为针对所述微生物的总免疫球蛋白(总Igs)和/或免疫球蛋白M的存在或不存在的指示。
优选情况下,按照例如在Luminex的专利申请WO97/14028中的描述,通过流式细胞术对颗粒进行测量。因此,将带有试剂(抗体或抗原)的颗粒亚组暴露于生物样品,每个亚组具有一种或多种分类参数,使得能够将一个亚组的颗粒相对于其它亚组的颗粒区分开。然后将这些暴露于样品的颗粒通入检测区(即细胞计数器),在那里收集与分类参数相关的数据(例如荧光发射强度),优选也收集与试剂和目标被分析物之间形成的复合物的存在或不存在相关的数据。
因此,例如在颗粒发射荧光信号的情况下,在加入被分析的样品和特异性结合物(例如使用荧光标记物标记的)后,使用带有激光读取器的颗粒流式细胞仪(例如LuminexTM类型的装置),测量了每个颗粒上形成的免疫复合物所发射的荧光信号。
对于所有颗粒来说,分别、但同时地记录对每个颗粒特异的荧光。最终获得了每组颗粒的总的独立地和不同的信号。
因此,本发明使得利用简单的、可自动化的方案,获得两个独立的、灵敏的测量成为可能,其中一个测量用于IgMs,另一个用于总免疫球蛋白,它们都针对同样的感染性微生物。
下面将对本发明进行更具体的描述,涉及同时检测针对甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒的IgMs和IgGs(或总Igs),以及同时检测针对造成梅毒的感染性细菌因子梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)的IgMs和IgGs(或总Igs)。
然而,不必多说,本发明广泛适用于所有病毒(HSV,登革热病毒,其它黄病毒例如西尼罗病毒,风疹和流感病毒,VZV,CMV等)、所有细菌(梅毒密螺旋体,博氏疏螺旋体等)和/或所有寄生生物(刚地弓形虫等),其中同样存在着在同样的分析容器中同时检测IgMs和IgGs(或总免疫球蛋白),而不损失任何灵敏度的需求。
在本发明的方法中,样品不需要经过预处理,例如酶反应、消化或修饰,或例如化学反应或修饰等(例如通过区带或蔗糖梯度超离心,凝胶过滤,通过葡萄球菌蛋白A或通过抗γFc抗体IgGs吸附,或用β-巯基乙醇裂解IgMs)。但是,对于已经经过这样的预处理的样品,实施本发明的方法也是可能的。
容器可以是任何固体容器,例如试管、微板的孔或由聚丙烯制成的反应池。
未结合的试剂可以通过本领域技术人员已知的任何技术来除去,例如通过重复的离心步骤进行洗涤,或利用珠子的超顺磁性性质,通过使用磁体来进行。
在本发明的方法的具体实施方案中,微生物从人类病毒、细菌和寄生生物、优选为单细胞寄生生物中选择。在本发明的方法的优选实施方案中,微生物选自人类病毒。在本发明的方法的特别优选实施方案中,微生物选自人类肝炎病毒,例如HAV和HBV病毒。
在优选实施方案中,所述微生物是人类甲型肝炎病毒(HAV),对它来说,有可能获得的总抗HAV免疫球蛋白的检测下限为大约20mIU/ml。
本发明的主题还包括一组用于实施本发明的方法的试剂。
本发明的主题还包括用于实施本发明的方法的试剂的试剂盒。
在本发明的文本中,同时并组合地检测针对感染性微生物的IgMs和针对该同样感染性微生物的IgG抗体或总Igs的检测类型,被称为“多元检测”,这与“单式检测”相反(其中IgM和IgG或总Ig的检测独立地进行,即不是组合的)。
本发明还涉及并包含了同时检测方法的所有变体形式,这些变体可以通过本身已知的方法获得,或由本领域技术人员在不背离本发明的精神的情况下推演出来。
现在将参考下面的实施例更详细地解释本发明。
下面的图和实施例对本发明进行了说明,但是不对其范围构成限制。
附图说明
图1是显示了通过双免疫捕获形式(现有技术)检测抗HAV IgGs和IgMs的流程图。
图2是显示了本发明的以夹心形式检测总抗HAV Igs和通过免疫捕获检测抗HAVIgMs的方法的流程图。
图3是显示了本发明的以夹心形式检测总抗HBc Igs和通过免疫捕获检测抗HBcIgMs的方法的流程图。
图4是显示了通过IgG单元形式(免疫捕获)和通过总Ig单元夹心形式分析测定的总抗HAV Igs的标准范围的比较图。
图5是显示了通过单元夹心形式和通过多元方式分析测定的总抗HAV Igs的标准范围的比较图。
图6是显示了本发明的以夹心形式检测总抗梅毒密螺旋体Igs和通过免疫捕获检测抗梅毒密螺旋体IgMs的方法的流程图。
实验部分
实施例1:现有技术的方法
该根据现有技术的分析方法的原理显示在图1中。
材料和方法:
材料:
1.分析系统
BioPlex分析仪(Bio-Rad,Marnes la Coquette,法国)按照制造商的说明书使用。该自动化免疫分析装置包含流式细胞仪和Luminex 100TM检测器(Luminex Corp.,奥斯汀,德克萨斯,美国),使用了异质的超顺磁性颗粒组。每组颗粒,由聚苯乙烯和甲基丙烯酸(COOH官能团)构成,粒度为8μm,被制造成具有各种不同的荧光染料(CL1和CL2)百分率,产生了为每组颗粒指定的独特的身份编码,可以被Luminex 100TM检测器(LuminexCorp.,奥斯汀,德克萨斯,美国)的激光检测到。在免疫反应后,珠子一个接一个地通过位于液体基质中心的流动池,以便被两束分离的激光激发并读数。测量在每个珠子通过时进行。
638nm的红色激光激发嵌入在每个颗粒表面上的识别荧光染料(CL1和CL2),复合的信号被解释,以便识别颗粒的被分析物。通过识别颗粒的类别,该激光因此用于鉴定正在进行的分析。
532nm绿色激光激发荧光探针(用藻红蛋白(PE)标记的结合物),发射出的荧光与连接到颗粒上的结合物成正比。因此该激光用于测量固定化在所述颗粒上的被分析物的反应性。
系统软件将结合物的信号转变成相对荧光强度(RFI)值。然后将该信号与分析特异性的标准曲线进行比较,以确定被分析物的浓度。也可以计算出比率,以便将结果定性分类为阳性或阴性。
2.固相:
使用了两种不同组的LuminexTM超顺磁性颗粒(Luminex Corp.,奥斯汀,德克萨斯,美国)。
每组颗粒包被有特异性针对特定分析的配体。每种配体使用异源双功能试剂偶联。
-第1组:以10μg/mg微粒的量固定化的抗人类IgM小鼠单克隆抗体(Hytest,Finland)。
-第2组:以20μg/mg微粒的量固定化的抗人类IgG小鼠单克隆抗体(Fcγ,JacksonImmuno Research,美国)。
3.HAV抗原
HAV抗原来自Viral Antigen(Memphis,田纳西,美国)。
4.荧光染料:
藻红蛋白来自Cyanotech(Hawaii,美国)。
5.结合物:
抗HAV小鼠单克隆抗体(Bio-Rad,Marnes la Coquette,法国)使用本领域技术人员已知的异源双功能试剂与藻红蛋白(PE)相偶联。
6.稀释剂
6.1.用于超顺磁性颗粒的稀释剂:
20mM柠檬酸缓冲溶液,pH 5.6含有:116mM NaCl,5.6mMEDTA,2%Triton,10%绵羊血清,0.5g/l小鼠IgG,0.5%Proclin 300TM(Supelco公司的商标),25%牛奶(100%脱脂),0.13%IgG BS3。
6.2.用于HAV抗原和用于结合物的稀释剂:
50mM磷酸缓冲溶液,pH 7.1,含有:150mM NaCl,0.1%NaN3,1%BSA,2.75%PEG6000,0.1%Tween 20TM(Sigma公司的商标),1%绵羊血清,1g/l小鼠IgG。
6.3.用于步骤1的稀释剂或洗涤溶液:
磷酸盐缓冲液,pH 7.4,含有:150mM NaCl,0.1%Tween 20TM(Sigma公司的商标),0.034%Proclin 300TM(Supelco公司的商标),0.095%NaN3。
7.反应池
免疫反应在体积为1ml的聚丙烯反应池中进行。
8.标准品
将WHO总抗HAV免疫球蛋白标准品(编码97/646)按照推荐的方法重新溶解在溶液中并稀释,提供下列标准点:0,20,80,160,320和640mIU/ml。
方法:
分析方案:
步骤1:
1.将下列物质相继分配到每个反应池中:
5μl样品或标准品+250μl用于步骤1的稀释剂
10μl免疫反应性颗粒(第1组和第2组颗粒的50∶50混合物)+250μl用于步骤1的稀释剂。
2.均化后,将混合物在37℃温育40分钟。
3.然后进行洗涤步骤:固相与液相的分离通过磁化进行,使用至少300μl洗涤溶液连续洗涤3次。在最后一次洗涤时,将颗粒重新悬浮。
步骤2:
4.将50μl HAV抗原(Ag HAV)溶液分配到每个反应池中。
5.均化后,将混合物在37℃温育15分钟。
6.然后进行洗涤步骤(同上第3点)。
步骤3:
7.将50μl结合物(抗HAV抗体-藻红蛋白,即Mab-PE)分配到每个反应池中。
8.均化后,将混合物在37℃温育15分钟。
9.然后进行洗涤步骤(同上第3点)。
10.通过向每个孔中加入35μl洗涤溶液,利用搅拌将每个孔的颗粒重新悬浮。
11.通过流式细胞仪将每个孔的颗粒悬浮液吸出。
12.使用两种激光光线读取每个反应池的颗粒悬浮液。
13.读数结果由流式细胞仪直接加工,并记录为相对荧光强度单位(RFI单位)。
14.为了解释结果,对于每个标准品点(或样品),计算相对于截止值的比率。对于总抗HAV Igs来说,截止值对应于被当作保护性截止值的20mIU/ml的标准品点的RFI值。
因此,样品的比率以下列方式计算:
其比率大于1的样品被宣布为阳性,比率小于1的样品被宣布为阴性。
*所有人类样品的分析进行双份(作为两个平行测定),使用的RFI结果来自于两个平行测定的平均值。
在标准范围内进行分析的结果
通过免疫捕获检测IgMs没有出现任何问题。
对于抗HAV IgG免疫捕获形式进行了特别的注意,以便获得20mIU/ml的分析灵敏度。
但是,在进行的分析中,用于检测抗HAV IgGs的免疫捕获形式显示出明显缺乏灵敏度(参见表1和图1)。
这是因为对0到80mIU/ml之间的标准品计算的比率彼此之间没有显著差别,它们与可靠地选择的20mIU/ml标准品的比率(比率=1.0)极为接近。只有对于160到640mIU/ml之间的标准品来说,比率才开始增加,因此反映了总Ig的检测。
表1:总的抗HAV Ig标准品范围的分析测定
这种灵敏度的缺乏是由于这样的事实,即使用的固相(抗人类IgG颗粒)使得特异性捕获针对被分析物的IgGs成为不可能。因此,固相被血清中所有其它IgGs所饱和。
这种现象在对IgMs进行的免疫捕获形式中没有看到,因为在急性感染过程中,同时具有几种感染,并在血清中具有针对多种不同感染性因子的IgMs,是非常罕见的。
因此,这种免疫捕获形式对于IgM检测来说被保留了,但是对于IgG检测来说被舍弃了,而代以夹心形式。后一种形式获得的结果将下下面描述。
实施例2:应用于抗HAV总Igs和IgMs检测的本发明的检测方法
本发明的多元检测方法在下面和图2中进行描述。
材料和方法:
材料:
除了下面指出的例外之外,材料基本上与实施例1中使用的相同。
1.分析系统:参见实施例1的描述。
2.固相:
使用了两种不同组的LuminexTM超顺磁性颗粒(Luminex Corp.,奥斯汀,德克萨斯,美国):
-第1组:以10μg/mg微粒的量固定化的抗人类IgM小鼠单克隆抗体(Hytest,Finland);
-第2组:以2.5μg/mg微粒的量固定化的HAV抗原(Viral Ag,Memphis,田纳西,美国)。
3.结合物1:
HAV抗原(Viral Ag,Memphis,田纳西,美国)用生物素(Pierce,罗克福德,伊利诺伊州,美国)标记。
4.结合物2:
链亲和素(缩写为“Strepta”,Roche Mannheim,德国)与来自Cyanotech(夏威夷,美国)的藻红蛋白(缩写为“PE”)相偶联。
5.稀释剂:
用于珠子和用于结合物1和2的稀释剂,用于步骤1的稀释剂和洗涤溶液与实施例1中的相同。
6.标准品:
WHO总抗HAV免疫球蛋白标准品(编码97/646)与实施例1中使用的相同。
7.样品:
被分析的人类样品是对抗HAV总免疫球蛋白和/或IgMs阳性或阴性的血浆或血清样品。这些样品源于由样本包构成的内样品库,以及来自于下列公司销售的样品:
ABO Pharmaceuticals-7930Arjons Drive,Suite A,圣地亚哥,CA92126,美国,
Teragenix-5440NW 33rd Avenue,Suite 108,Ft.Lauderdale,FL33309,美国,
PromedDx-10Commerce Way,Norton,MA 02766,美国,
Zeptometrix Corporation-872Main St.,布法罗,NY 14202,美国,
BBI Diagnostoc-375West Street,West Bridgewater,MA 02379,美国,
Life Sera-780Park North Blvd,Suite 100,Clarkston,GA 30021,美国。
被分析的人类样品可以分组如下:
-30份样品对抗HAV总免疫球蛋白和/或IgMs阴性(双阴性)。
-26份样品对抗HAV总免疫球蛋白阳性,对抗HAV IgM阴性。
-15份样品对抗HAV IgM阳性,对总抗HAV免疫球蛋白阴性。
方法:
分析测试方案:
在下面描述的分析测试中,实施了三种分析测试方案:
本发明的多元方案(即总Ig方案+IgM方案)和两种单元方案(总Ig方案和IgM方案)。这三种方案除了加入所使用的免疫反应性超顺磁性颗粒的步骤之外,是相同的。多元步骤使用了两组珠子,每个单元方案使用单一一组珠子。在IgM单元方案和多元方案中使用的第1组颗粒(带有抗IgM抗体)的量保持相同。同样地,在总Ig单元方案和多元方案中使用的第2组颗粒(带有HAV抗原)的量保持相同。
A.用于检测总抗HAV Igs的单元方案
步骤1:
1.将下列物质相继分配到每个反应池中:
25μl样品或标准品+225μl用于步骤1的稀释剂,
10μl第2组免疫反应性颗粒(HAV抗原)+250μl用于步骤1的稀释剂。
2.均化后,将混合物在37℃温育40分钟。
3.然后进行洗涤步骤:同上实施例1第3点。
步骤2:
4.将50μl结合物1溶液(生物素酰化的HAV抗原,即“Ag HAV生物素”)分配到每个反应池中。
5.均化后,将混合物在37℃温育15分钟。
6.然后进行洗涤步骤:同上第3点。
步骤3:
7.将50μl结合物2(链亲和素-藻红蛋白,即“Strepta-PE”)分配到每个反应池中。
8.均化后,将混合物在37℃温育15分钟。
9.然后进行洗涤步骤:同上第3点。
10.通过向每个反应池中加入35μl洗涤溶液,利用搅拌将每个反应池的颗粒重新悬浮。
11.通过流式细胞仪将每个反应池的颗粒悬浮液吸出。
12.使用两种激光光线读取每个反应池的颗粒悬浮液。
13.读数结果由流式细胞仪直接加工,并记录为相对荧光强度单位(RFI单位)。
14.为了解释结果,对于每个标准品点或样品,计算相对于截止值的比率。对于总抗HAV Igs来说,截止值对应于被当作保护性截止值的20mIU/ml的标准品点的RFI值。
因此,样品的比率以下列方式计算:
其比率大于1的样品被宣布为阳性,比率小于1的样品被宣布为阴性。
*所有人类样品的分析测试进行双份(作为两个平行测定),使用的RFI结果来自于两个平行测定的平均值。
B.用于检测抗HAV IgMs的单元方案
步骤1:
1.将下列物质相继分配到每个反应池中:
25μl样品或标准品+225μl用于步骤1的稀释剂,
10μl第1组免疫反应性颗粒(抗IgM抗体)+250μl用于步骤1的稀释剂。
IgM单元方案的所有其它步骤(2-13)与总Ig单元方案的步骤2-13严格相同。
14.为了计算样品的比率,对于HAV IgM来说,截止值是阴性样品的RFIs的平均值+12个标准偏差。
因此,样品的比率计算如下:
其比率大于1的样品被宣布为阳性,比率小于1的样品被宣布为阴性。
*所有人类样品的分析测试进行双份(作为两个平行测定),使用的RFI结果来自于两个平行测定的平均值。
C.本发明的多元方案(同时检测抗HAV总Igs和IgMs):
步骤1:
1.将下列物质相继分配到每个反应池中:
25μl样品或标准品+225μl用于步骤1的稀释剂,
10μl免疫反应性颗粒(第1组和第2组颗粒的50∶50混合物)+250μl用于步骤1的稀释剂。
多元方案的所有其它步骤(2-14)与总Ig和IgM单元方案的步骤2-14严格相同。
获得的结果:
1.校正范围:
1.1.通过单元夹心法分析的总抗HAV Ig标准品范围:
通过单元夹心法,使用标准品范围(0到640mIU/ml)获得的结果显示,总Ig夹心格式比实施例1的IgG免疫捕获格式灵敏得多(参见表2和图4)。
表2:通过IgG单元免疫捕获格式(实施例1)和通过总Ig单元夹心格式(实施例2)分析测试的总抗HAV Ig标准品范围的比较
1.2.通过多元方案分析测试的总抗HAV Ig标准品范围
根据本发明的多元方案,通过夹心法,使用标准品范围获得的结果,报告在表3和图5中。
表3:通过单元夹心格式和通过多元格式分析测试的总Ig标准品范围的比较
注意到多元总Ig夹心格式的灵敏度,相对于通过单元夹心格式获得的灵敏度来说,保持不变。
2.样品
2.1.通过单元夹心和通过多元夹心分析样品的总抗HAV Igs:
使用人类样品获得的总抗HAV Igs的结果报告在表4中。
表4:通过单元夹心格式和通过本发明的多元格式分析测试样品的总抗HAV Igs的比较
在总抗HAV Ig夹心分析测试中,在阴性样品(n=30)和阳性样品(n=26)之间注意到了非常好的区分,不论它是通过单元格式还是通过本发明的多元格式进行的。
因此,这些结果显示,在本发明的多元方法中,总抗HAV Igs的检测的灵敏度没有降低。
通过本发明的方法,事实上所有阳性样品都被发现是阳性的,因此这也使获得良好的临床灵敏度成为可能。
2.2.通过单元和多元免疫捕获格式分析测试样品的抗HAV IgM:
使用人类样品获得的抗HAV IgM的结果报告在表5中。
表5:通过单元免疫捕获格式和本发明的多元免疫捕获格式分析测试样品的抗HAVIgM的比较
在通过免疫捕获进行的抗HAV IgM分析测试中,在抗HAV IgM阴性样品(n=30+26)和抗HAV IgM阳性样品(n=15)之间注意到了非常好的区分,不论它是通过单元格式还是通过本发明的多元格式进行的。
因此,这些结果显示,在本发明的多元方法中,通过免疫捕获检测IgMs的灵敏度没有被与夹心分析测试的组合所降低。
通过本发明的方法,事实上所有阳性样品都被发现是阳性的,因此这也使获得良好的临床灵敏度成为可能。
实施例3:应用于抗HBc总Igs和IgMs检测的本发明的检测方法
本发明的多元检测方法也用于分析测试抗HBc总Igs和IgMs。这种方法显示在图3中并在下面描述。
材料和方法:
材料:
除了颗粒、生物素酰化的结合物1和测试的样品之外,使用的材料与实施例2中的等价。
1.固相:
使用了两种不同组的LuminexTM超顺磁性颗粒(Luminex Corp.,Austin,德克萨斯,美国)。
-第1组:以10μg/mg微粒的量固定化的抗人类IgM山羊多克隆抗体(Bio-Rad,Marnes la Coquette);
-第2组:以10μg/mg微粒的量固定化的重组HB抗原(Virogen,Watertown,MA,美国)。
2.结合物1:
重组HBc抗原(Biokit,Barcelona,西班牙)用生物素(Pierce,Rockford,IL,美国)标记。
3.样品:
被分析的人类样品是对总抗HBc免疫球蛋白和/或抗HBc IgM阳性或阴性的血浆或血清样品。这些样品来自于内样品库,以及来自于下列公司销售的样品:
ABO Pharmaceuticals-7930Arjons Drive,Suite A,圣地亚哥,CA92126,美国,
PromedDx-10Commerce Way,Norton,MA 02766,美国,
Zeptometrix Corporation-872Main St.,布法罗,NY 14202,美国。
被分析的人类样品可以分组如下:
-10份样品对总抗HBc免疫球蛋白和抗HBc IgM阴性(双阴性)。
-10份样品对总抗HBc免疫球蛋白阳性,对抗HBc IgM阴性。
-10份样品对抗HBc IgM阳性,对总抗HBc免疫球蛋白阴性。
方法:
分析测试方案:
使用的方案与上面在实施例2中描述的方案A、B和C相同,除了在步骤1中使用的样品体积之外,该样品是5μl+250μl用于步骤1的稀释剂。
其它步骤相同,包括解释步骤。对于总抗HBc Igs和抗HBc IgMs分析测试来说,截止值是阴性样品的RFIs的平均值+12个标准偏差。
因此,样品相对于截止值的比率计算如下:
其比率大于1的样品被宣布为阳性,比率小于1的样品被宣布为阴性。
*所有人类样品的分析测试进行双份(作为两个平行测定),使用的RFI结果来自于两个平行测定的平均值。
获得的结果:
表6:通过单元夹心格式和通过本发明的多元格式分析测试的样品的总抗HBc Igs的比较
在总抗HBc Ig夹心分析测试中,在阴性样品(n=10)和阳性样品(n=20)之间注意到了非常好的区分,不论它是通过单元格式还是通过本发明的多元格式进行的。
因此,这些结果显示,在本发明的多元方法中,总抗HBc Igs的检测灵敏度没有降低。
通过本发明的方法,事实上所有阳性样品都被发现是阳性的,因此这也使获得良好的临床灵敏度成为可能。
表7:通过单元免疫捕获格式和通过本发明的多元免疫捕获格式分析测试的样品的抗HBc IgM的比较
在抗HBc IgM免疫捕获分析测试中,在抗HBc IgM阴性样品(n=10+10)和抗HBcIgM阳性样品(n=10)之间注意到了非常好的区分,不论它是通过单元格式还是通过本发明的多元格式进行的。
因此,这些结果显示,在本发明的多元方法中,通过免疫捕获检测IgMs的灵敏度没有被与夹心分析测试的组合所降低。
通过本发明的方法,事实上所有阳性样品都被发现是阳性的,因此这也使获得良好的临床灵敏度成为可能。
实施例4:应用于抗梅毒总Igs和IgMs的检测的本发明的检测方法
本发明的多元检测方法也用于分析测试总的抗梅毒密螺旋体Igs和抗梅毒密螺旋体IgMs,梅毒密螺旋体是造成梅毒的感染性细菌因子。该方法显示在图6中,并描述如下。
材料和方法:
材料:
除了颗粒、生物素酰化的结合物1和测试样品之外,使用的材料与实施例2和3中的相当。
1.固相:
使用了两种不同组的LuminexTM超顺磁性颗粒(Luminex Corp.,Austin,德克萨斯,美国)。
-第1组:以2.5μg/mg微粒的量固定化的抗人类IgM小鼠单克隆抗体(Hytest,Finland);
-第2组:分别以5μg/mg和1.25μg/mg微粒的量固定化的梅毒密螺旋体的重组抗原TpN17和TpN47(New Market Laboratories Ltd,Kentford,英格兰)。
2.结合物1:
重组抗原TpN 17和TpN47(New Market Laboratories Ltd,Kentford,英格兰)用生物素(Pierce,Rockford,IL,美国)标记。
3.样品:
被分析的人类样品是对总抗梅毒密螺旋体免疫球蛋白和/或抗梅毒密螺旋体IgMs阳性或阴性的血浆或血清样品。
这些样品来自于内样品库:
Etablissementdu Sang(EFS)[法国血库]-83rue des Alpes,94150Rungis,法国,
或来自于下列公司销售的样品:
PromedDx-10Commerce Way,Norton,MA 02766,美国,
SeraCare Life Science-375West Street,West Bridgewater,MA02379,美国。
被分析的人类样品可以分组如下:
-35份样品对总抗梅毒密螺旋体免疫球蛋白和/或抗梅毒密螺旋体IgMs阴性(双阴性)。
-3份样品对总抗梅毒密螺旋体免疫球蛋白阳性,对抗梅毒密螺旋体IgM阴性(样品1、2、3)。
-4份样品对抗梅毒密螺旋体IgM阳性,对总抗梅毒密螺旋体免疫球蛋白阴性(样品4、5、6、7)。
方法:
分析测试方案:
使用的方案与上面描述的实施例2中的方案A、B和C相同,例外之处为步骤1中的体积,是100μl样品和100μl珠子,以及在步骤2中,是100μl结合物1(生物素酰化的梅毒密螺旋体抗原)溶液。
其它步骤相同,包括解释步骤。
结果的解释::
为了分析测试总抗梅毒密螺旋体Igs和抗梅毒密螺旋体IgMs,截止值是阴性样品的RFIs的平均值除以0.3。
因此,样品相对于截止值的比率计算如下:
其比率大于或等于1的样品被宣布为阳性,比率小于1的样品被宣布为阴性。
*所有人类样品的分析测试进行三份,使用的RFI结果来自于三个平行测定的平均值。
获得的结果:
表8:通过单元夹心格式和通过本发明的多元格式分析测试的样品的总抗梅毒密螺旋体Igs的比较
在总抗梅毒密螺旋体Ig夹心分析测试中,在阴性样品(n=35)和阳性样品(n=3)之间注意到了非常好的区分,不论它是通过单元格式还是通过本发明的多元格式进行的。
因此,这些结果显示,在本发明的多元方法中,总抗梅毒密螺旋体Igs的检测灵敏度没有降低。
通过本发明的方法,事实上所有阳性样品都被发现是阳性的,因此这也使获得良好的临床灵敏度成为可能。
表9:通过单元免疫捕获格式和通过本发明的多元免疫捕获格式分析测试的样品的抗梅毒密螺旋体IgM的比较
在通过免疫捕获进行的抗梅毒密螺旋体IgM分析测试中,在抗梅毒密螺旋体IgM阴性样品(n=35+3)和抗梅毒密螺旋体IgM阳性样品(n=3)之间注意到了非常好的区分,不论它是通过单元格式还是通过本发明的多元格式进行的。
因此,这些结果显示,在本发明的多元方法中,通过免疫捕获检测IgMs的灵敏度没有被与夹心分析测试的组合所降低。
通过本发明的方法,事实上所有阳性样品都被发现是阳性的,因此这也使获得良好的临床灵敏度成为可能。
总之,在实施例2、3和4中,使用本发明的组合了通过免疫捕获检测IgM和通过夹心检测总Ig的多元方法获得的结果,清楚地显示,本发明的方法允许灵敏地检测和区分针对同样微生物的总Ig类型抗体或IgGs与IgMs。本领域技术人员将可以容易地从中得出结论,本发明的IgGs和IgMs多元检测方法,事实上是一种广范围的方法,可以适用于许多种从诊断的观点来看检测其总Igs和IgMs是重要的微生物。
此外,本发明的方法可以通过使用自动化装置,例如来自Bio-Rad的BioPlex2200,容易地进行自动化,这使得分析测试方案可以在单一容器中同时快速地进行,并可以在单一步骤中读取信号。