DE69812329T2

DE69812329T2 - Multiplex-zufluss-immunotest mit magnetischen teilchen als festphase

Info

Publication number: DE69812329T2
Application number: DE69812329T
Authority: DE
Inventors: I. Michael WATKINS; B. Richard EDWARDS
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1997-11-18
Filing date: 1998-10-27
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2018-10-28
Also published as: US7205160B2; US20050260686A1; JP2000516345A; US20010008217A1; US6960478B2; CA2260991C; AU1203199A; DE69812329D1; US20060269962A1; US6872578B2; WO1999026067A1; US20040126904A1; US6280618B2; US20010054580A1; US7465538B2; US20060275820A1; EP1248110A2; EP0965044B1; EP0965044A1; US7569399B2

Description

Diese Erfindung liegt im Gebiet klinischer Analysen, die biologische Bedingungen anzeigen, und ist von Interesse in der Technik von Bindungsanalysen für Analyten in biologischen Fluids für Diagnose- und Kontrollzwecke oder andere klinische Funktionen.
Seit der ersten Offenbarung von Radioimmunanalysen 1961 ist eine große Vielfalt von in vitro Analysen entwickelt worden, die Bindungen vom Affinitätstyp verwenden. Variationen umfassen den Typ von Bindung (zum Beispiel spezifisch gegenüber nichtspezifisch, und immunologisch gegenüber nichtimmunologisch), den Typ von Detektion (einschließlich der Verwendung von Markierungen so wie Enzymmarkierungen, radioaktiven Markierungen, Fluoreszenzmarkierungen, und Chemilumineszenzmarkierungen), Detektionsverfahren, ob Bindung erfolgt ist oder nicht (einschließlich Verfahren, in denen gebundene Spezies von ungebundenen Spezies getrennt werden und Verfahren, die keine solche Trennung einschließen), und verschiedene andere Aspekte des Analyseablaufs. Die Technik wird momentan für die Detektion und Quantitätsbestimmung zahlloser Spezies verwendet, und dient als ein analytisches Werkzeug in der Detektion und Kontrolle vieler physiologischer Bedingungen und Funktionen und der Diagnose und Behandlung vieler Krankheiten.
Verbesserungen in der Wirksamkeit und Reproduzierbarkeit dieser Analysen sind durch verschiedene Entwicklungen vorgenommen worden, die verbesserte Markierungen, Detektionsverfahren, Automatisierung und Systeme für Multiplexanalysen einschließen. Jede Verfahrensweise erfordert jedoch eine Abfolge von Schritten, und ein jegliches Mittel zum Verkürzen der Abfolge, die die Anzahl von Analysen vergrößert, die innerhalb einer gegebenen Zeitspanne durchgeführt werden können, oder die Reproduzierbarkeit und Vielseitigkeit der Analyse verbessern, werden vorteilhaft für den Zweck der Analyse sein.
Viele Bindungsanalysen sind heterogene Analysen, welche teilweise auf der übertragung von Analyt aus einer flüssigen Probe zu einer festen Phase durch die Bindung des Analyten während der Analyse an die Oberfläche der festen Phase beruhen. In einigen Stufen der Analyse, deren Reihenfolge abhängig von dem Analyseprotokoll variiert, werden die feste Phase und die flüssige Phase getrennt, und die zu der Detektion und/oder Quantitätsbestimmung des Analyten führende Bestimmung wird auf einer der beiden getrennten Phasen durchgeführt. Ein Typ von Festphase, der verwendet wurde, sind magnetische Partikeln, die die kombinierten Vorteile eines großen Oberflächenbereichs und die Fähigkeit bieten, zeitweilig an der Wand des Analyseaufnahmebehälters durch Auferlegung eines Magnetfelds immobilisiert zu werden, während die flüssige Phase aufgesaugt wird, die feste Phase gewaschen wird oder beides. Beschreibungen solcher Partikel und ihrer Verwendung sind zu finden in Forrest et al, US-Patent Nr. 4,141,687 (Technicon Instruments Corporation, 27. Februar, 1979); Ithakissios, US-Patent Nr. 4,115,534 (Minnesota Mining and Manufacturing Company, 19. September, 1978), Vlieger, A. M. et al., Analytical Biochemistry 205: 1–7 (1992); Dudley, Journal of Clinical Immunoassays 14: 77–82 (1991); und Smart, Journal of Clinical Immunoassays 15: 246-251 (1992). Solche magnetischen Verfahren sollten jedoch nicht mit der Verwendung magnetischer Partikeln in chromatographischen Techniken so wie denen verwechselt werden, die in WO 90/07380 als Hochfeld-Magnetscheidung bezeichnet wird.
Weitere mögliche Relevanz für diese Erfindung hat der Stand der Technik, der sich auf die Verwendung von Flusszytometrie für die Detektion und Analyse von Partikeln und Spezies bezieht, die an die Partikeln gebunden werden. Flusszytometrie ist offenbart worden zur Verwendung in der Detektion und Trennung von Antigenen und Antikörpern durch Coulter Electronis, Inc., GB-Patent Nr. 1,561,042 (veröffentlicht am 13. Februar 1980); und für Mengenbestimmungen von PCR- (Polymerasekettenreaktion) Produkten durch Vlieger, A. M, et al., Analytical Biochemistry 205: 1–7 (1992). Flusszytometrie ist auf die Analyse biologischer Proben begrenzt gewesen. Die Empfindlichkeit dieser Analyseformate, die keine Trennung von freien von gebundenen Spezies erfordern (d. h. Sandwich- und kompetitive Analysen), wird nachteilig durch das verstärkte Hintergrundsignalrauschen beeinflusst, das durch die ungebundene Markierung verursacht wird. Antigen-Einfangantikörperanalysen erfordern die Entfernung von nichtspezifischem Immunglobulin vor der Zugabe des klassenspezifisch markieren Anti-Ig. Teilchenmaterial enthaltende Proben (wie z. B. Stuhlproben) erfordern die Entfernung dieser Abriebteilchen, die ansonsten die Flusszytometriemessung stören würden. Traditionelle Trenntechniken, so wie Infiltrierung oder Zentrifugierung, würden beim Entfernen ungebundener Markierungen oder nichtspezifischer Ig erfolgreich sein, würden jedoch versagen, störendes Teilchenmaterial von der Patientenprobe zu entfernen. Außerdem sind diese traditionellen Trenntechniken schwierig und/oder teuer zu automatisieren. Die Verwendung von magnetischen Partikeln und Magnetismus ist ein gut bekanntes Verfahren und es wurde gezeigt, dass es sowohl effizient als auch kostenwirksam in einem automatisierten Diagnosesystem ist.
Diese Erfindung beruht auf einer Analyse, die Multiplexen heterogener Bindungsanalysen einer einzigen Fluidprobe durch Flusszytometrie mit der Verwendung fester magnetischer Partikeln als die feste Phase kombiniert, um die Trennung der festen und flüssigen Phase zu vereinfachen. Die magnetischen Partikel haben Größen, die mikroskopisch sind (und werden folglich als "Mikropartikeln" bezeichnet) und die über einen Größenbereich variieren, der ein Aggregat von zwei oder mehr kleineren Größenbereichen darstellt, die hier als "Unterbereiche" bezeichnet werden. Die Unterbereiche sind im wesentlichen getrennt (nichtüberlappend), wobei die mittleren Partikelgrößen benachbarter Unterbereiche ausreichend weit voneinander entfernt sind, um Differenzierung jedes Unterbereichs von den anderen durch Flusszytometrie zu erlauben. Ein Analysereagenz wird an jeden Partikel gebunden, wobei im wesentlichen alle Partikeln innerhalb jedes Unterbereichs das gleiche Analysereagenz tragen und die Analysereagenzien von einem Unterbereich zum nächsten verschieden sind. Die Unterbereiche sind daher nicht nur durch Größe für Zwecke von Flusszytometrie unterscheidbar, sondern auch durch die Analysereagenzien, die an die Partikeln gebunden sind, so dass alle Partikeln in jedem Unterbereich in einer verschiedenen Bindungsanalyse teilnehmen, und dies in einer selektiven Weise in bezug zu den Analysereagenzien tun, die an Partikeln in anderen Unterbereichen gebunden sind.
Die magnetische Beschaffenheit der Partikeln erlaubt die automatische Trennung der festen Phase von der flüssigen Phase an einem Punkt in der Abfolge der Analyse vor der Flusszytometriestufe. Die Trennung kann einem jeglichen einer Vielzahl von Zwecken dienen, einschließlich der Entfernung von Probenabriebteilchen von den Analysekomponenten, der Entfernung von Probenkomponenten, die ansonsten bedeutend zu dem Hintergrundrauschen in der Detektionsstufe beitragen würden, der Entfernung von konkurrierenden Bindungselementen, die nicht der Gegenstand einer der Analysen sind, aber ansonsten die Ergebnisse behindern würden, und der Entfernung gebundener von ungebundenen Spezies wie z. B. Markierungen, Analyten, Analytbindungselemente, und markierungsbindende Elementkonjugate. Die besondere Funktion in einer jeglichen gegebenen Analyse oder Kombination von Analysen wird von der Beschaffenheit der Analyse und dem Analyseprotokoll abhängen.
Diese und andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden deutlicher durch die folgende Beschreibung verstanden werden.
Der hier verwendete Ausdruck "magnetisch reaktionsbereites Material" kennzeichnet ein Material, das auf ein Magnetfeld reagiert. Magnetisch reaktionsbereite Materialien von Interesse in dieser Erfindung umfassen paramagnetische Materialien, ferromagnetische Materialien, ferromagnetische Substanzen und metamagnetische Materialien. Paramagnetische Materialien sind bevorzugt. Beispiele sind Eisen, Nickel und Kobalt, sowie Metalloxide wie z . B . Fe₃O₄, BaFe₁₂O₁₉, CoO, NiO, Mn₂O₃, Cr₂O₃ und CoMnP . Anstatt den gesamten Mikropartikel zu bilden, stellt das magnetisch reaktionsbereite Material vorzugsweise nur eine Komponente des Mikropartikels dar, dessen Rest aus einem Polymermaterial besteht, an dem das magnetisch reaktionsbereite Material angehaftet wird und das chemisch derivatisiert ist, um Befestigung eines Analysereagenz zu erlauben.
Die Menge von magnetisch reaktionsbereitem Material in dem Mikropartikel ist nicht kritisch und kann über einen breiten Bereich variieren, obwohl die Menge die Dichte des Mikropartikels beeinflussen kann, was in Verbindung mit der Partikelgröße die Leichtigkeit beeinträchtigen kann, den Mikropartikel zu Zwecken in Suspension zu halten, maximalen Kontakt zwischen der flüssigen und festen Phase zu erreichen und Flusszytometrie zu vereinfachen. Außerdem wird eine überschüssige Menge von magnetisch reaktionsbereitem Material in den Mikropartikeln Autofluoreszenz auf einer Ebene erzeugen, die ausreichend hoch zum Behindern der Analyseergebnisse ist. Es ist daher bevorzugt, dass die Konzentration von magnetisch reaktionsbereitem Material ausreichend niedrig sein wird, um jegliche aus dem Material ausstrahlende Autofluoreszenz zu minimieren. Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen, liegt das magnetisch reaktionsbereite Material in einem Mikropartikel gemäß dieser Erfindung vorzugsweise in einem Bereich von etwa 1 bis etwa 75 Gewichtsprozent des Partikels insgesamt. Ein stärker bevorzugter Gewichtsprozentbereich ist von etwa 2% bis etwa 50%, ein noch stärker bevorzugter Gewichtsprozentbereich ist von etwa 3% bis etwa 25%, und ein noch stärker bevorzugter Gewichtsprozentbereich ist von etwa 5% bis etwa 15%. Das magnetisch reaktionsbereite Material kann über das Polymer verstreut sein, als eine Beschichtung auf die Polymeroberfläche oder als eine von zwei oder mehr Beschichtungen auf die Oberfläche aufgebracht, oder in irgendeiner anderen Weise eingebaut oder angehaftet werden, die das Material an dem Polymer befestigt.
Die Polymermatrix, die den Rest des Mikropartikels bildet, kann ein jegliches Material darstellen, das zu einem Mikropartikel gebildet werden kann, das, anders als das an dem Mikropartikel angehaftete Analysereagenz, inert zu den Komponenten der biologischen Probe und zu den anderen Analysereagenzien ist, das minimale Autofluoreszenz aufweist, das fest und unlöslich in der Probe und in jeglichen anderen Lösungsmitteln oder Trägern ist, die in der Analyse verwendet werden, und das ein Analysereagenz an dem Mikropartikel anhaften kann. Beispiele geeigneter Polymere sind Polyester, Polyetter, Polyolefine, Polyalkylenoxide, Polyamide, Polyurethane, Polysacharide, Zellulosen und Polyisoprene. Vernetzung ist nützlich in vielen Polymeren, um dem Mikropartikel strukturelle Integrität und Starrheit zu verleihen.
Funktionale Gruppen für Befestigung des Analysereagenz können in die Polymerstruktur durch konventionelle Mittel eingebaut werden, einschließlich der Verwendung von Monomeren, die funktionale Gruppe enthalten, entweder als das einzige Monomer oder als ein Co-Monomer. Beispiele geeigneter funktionaler Gruppen sind Amingruppen (-NH₂), Ammoniumgruppen (-NH₃ ⁺ oder -NR₃ ⁺) , Hydroxylgruppen (-OH), Carboxylsäuregruppen (-COOH) und Isocyanatgruppen (-NCO). Ein nützliches Monomer zum Einführen von Carboxylsäuregruppen in Polyolefine ist zum Beispiel Acrylsäure oder Methacrylsäure.
Befestigung des Analysereagenz an der Mikropartikeloberfläche kann durch elektrostatische Anziehung, spezifische Affinitätswechselwirkung, hydrophobe Wechselwirkung, oder kovalente Bindung erreicht werden. Kovalente Bindung ist bevorzugt. Verbindungsgruppen können als ein Mittel zum Vergrößern der Dichte der reaktionsbereiten Gruppen auf der Mikropartikeloberfläche und Verringern sterischer Behinderung zum Vergrößern des Bereichs und der Empfindlichkeit, oder als ein Mittel zum Hinzufügen spezieller Typen von reaktionsbereiten Gruppen zu der Mikropartikeloberfläche zum Verbreitern des Typenbereichs von Analysereagenzien verwendet werden, die an die Mikropartikeloberfläche angehaftet werden können.
Beispiele geeigneter Verbindungsgruppen sind Polylysin, Polyasparginsäure, Polyglutaminsäure und Polyarginin.
In einigen Fällen besitzen Partikeln hohe Autofluoreszenz und sind als solche ungeeignet zum Gebrauch in einer Flusszytometrie-Immunanalyse. Durch normale Emulsionspolymerisationstechniken erzeugte Partikeln von einer breiten Vielzahl von Ausgangsmonomeren weisen allgemein geringe Autofluoreszenz auf. Partikeln, deren Oberflächen speziell modifiziert wurden, um Porosität und folglich den Oberflächenbereich zu vergrößern (solche Partikeln werden in der Literatur als "makroporöse Partikeln bezeichnet) weisen hohe Autofluoreszenz auf. Autofluoreszenz steigt in solchen Partikeln mit zunehmender Größe und steigendem Prozentsatz von Divinylbenzolmonomer an.
Unter Berücksichtigung dieser Überlegungen, können die Größenbereiche der Mikropartikeln variieren und bestimmte Größenbereiche sind nicht kritisch für die Erfindung. In den meisten Fällen liegt der aggregierte Größenbereich der Mikropartikeln in dem Bereich eines Partikeldurchmessers von etwa 0,3 Mikrometern bis etwa 100 Mikrometern, und vorzugsweise im Bereich von etwa 0,5 Mikrometern bis etwa 40 Mikrometern. Die Anzahl der Unterbereiche beträgt zwei oder mehr, und wird in den meisten Fällen von zwei bis zwanzig betragen, jeder selektiv in einer einzigen Analyse aktiv und passiv in bezug zu anderen Analysen, die gleichzeitig durchgeführt oder detektiert werden.
Die Breite der Unterbereiche und der Abstand zwischen mittleren Durchmessern benachbarter Unterbereiche werden gewählt, um Differenzierung der Unterbereiche durch Flusszytometrie zuzulassen, und wird den in der Verwendung und in der Ausrüstung von Flusszytometrie versierten Fachleuten einfach deutlich sein. In dieser Beschreibung bezieht sich der Ausdruck "mittlerer Durchmesser" auf einen Zahldurchschnittsdurchmesser. In den meisten Fällen beträgt eine bevorzugte Unterbereichbreite etwa ± 5% CV oder weniger des mittleren Durchmessers, wobei CV der Variationskoeffizient ist und als die Standardabweichung des Partikeldurchmessers geteilt durch den mittleren Partikeldurchmesser mal 100 Prozent definiert ist. Der minimale Abstand zwischen mittleren Durchmessern unter den verschiedenen Unterbereichen kann abhängig von der Mikropartikelgrößenverteilung, der Leichtigkeit, Mikropartikeln nach Größe zum Zweck des Anhaftens unterschiedlicher Analysereagenzien zu trennen, und dem Typ und der Empfindlichkeit der Flusszytometrieausrüstung variieren. In den meisten Fällen werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn die mittleren Durchmesser verschiedener Unterbereiche um wenigstens etwa 6% des mittleren Durchmessers von einem der Unterbereiche, vorzugsweise wenigstens etwa 8% des mittleren Durchmessers von einem der Unterbereiche, und am stärksten bevorzugt wenigstens etwa 10% des mittleren Durchmessers von einem der Unterbereiche beabstandet sind. Ein anderes bevorzugtes Unterbereichsbreitenverhältnis ist das, in dem die Standardabweichung der Partikeldurchmesser innerhalb jedes Unterbereichs weniger als etwa ein Drittel der Trennung der mittleren Durchmesser von benachbarten Unterbereichen beträgt.
Der Typ von an der Mikropartikeloberfläche angelagertem Analysereagenz wird für einen jeglichen einzelnen Unterbereich von Mikropartikeln abhängig sowohl von dem Analyten als auch dem Analysetyp variieren. Das Analysereagenz kann ein Bindemittel mit einer speziellen Affinität für den Analyten, oder ein Bindemittel mit Affinität für einen schmalen Bereich von Spezies sein, der den Analyten einschließt, jedoch andere Analyten ausschließt, deren Analysen durch Kontakt mit anderen Mikropartikelunterbereichen durchgeführt wird, oder eine jegliche Bindespezies allgemein sein, die sich selektiv in der Analyse für einen einzigen Analyten unter Ausschluss der anderen einsetzen wird. Beispiele von Analysereagenzien sind Antikörper, Antigene oder Haptene, und andere Typen von Proteinen mit einer Bindungsspezifität wie z. B. Avidin und Biotin.
Ein anderer Typ von Analysereagenz, das an der Mikropartikeloberfläche für einen jeglichen einzigen Unterbereich von Mikropartikeln angehaftet werden kann, ist der Analyt selbst. In der Analyse wird der anhaftende Analyt mit einem schmalen Bereich von Spezies in der Probe konkurrieren, die auch Analyt enthält. Beispiele dieser Analysereagenzien sind Antikörper, Antigene und Haptene.
Das Signal aufgrund eines speziellen Analyten kann, einzeln oder kombiniert, durch die folgenden Parameter differenziert werden: die Größe des Partikels (wie reflektiert in den niedrigen und hohen Winkelstreumessungen), die Zusammensetzung des Partikels (reflektiert durch Änderungen in der hohen Winkelstreuung), oder die Fluoreszenzwellenlänge der Markierung (in der die verschiedenen Wellenlängen durch dichromatische Filter getrennt und durch Fluoreszenzphotovervielfacher detektiert werden).
Die an den Oberflächen von Mikropartikeln innerhalb eines einzelnen Unterbereichs durchgeführte Analyse kann ein jeglicher Typ einer heterogenen Analyse sein, die ein Ergebnis ergibt, das einen bestimmten Analyten von anderen in der Probe unterscheidet.
Konkurrenzanalysen, zum Beispiel, können durch Verwendung magnetisch reaktionsbereiter Mikropartikeln durchgeführt werden, an die Moleküle eines Bindungsproteins ( wie z. B. ein Antikörper) gebunden werden, die spezifisch für den Analyten sind. Während der Analyse werden die Probe und eine Menge markierter Analyt, entweder gleichzeitig oder aufeinanderfolgend, mit den Mikropartikeln gemischt. Durch Verwendung einer begrenzten Anzahl von Bindungsstellen auf den Mikropartikeln, verursacht die Analyse Konkurrenz zwischen dem markierten Analyten und dem Analyten in der Probe für die verfügbaren Bindungsstellen. Nach einer geeigneten Inkubationszeitspanne, wird die Mischung aus Flüssigkeit und Feststoff unter den Einfluss eines Magnetfelds gebracht, das die Mikropartikeln veranlasst, an den Wänden des Reaktionsbehälters anzuhaften, und die flüssige Phase wird entfernt. Die Mikropartikeln, die weiterhin an der Behälterwand anhaften, werden dann gewaschen, um jeglichen verbleibenden ungebundenen Analyten und Markierung zu entfernen, und erneut in einer Trägerflüssigkeit für Einführung in ein Flusszytometer suspendiert, wo die Mikropartikeln nach Größe und detektierter Markierung klassifiziert werden. Ein Beispiel eines Analyten, der einfach auf diese Weise detektiert wird, in Vitamin B₁₂. Ein nützliches partikelgebundenes Analysereagenz für diesen Analyten ist B₁₂ Hämogenase, und ein konkurrierender markierungsgebundener Analyt ist B₁₂ kovalent gebunden an Phycoerythrin.
Immunometrische oder Sandwichanalysen, als anderes Beispiel, werden durch Verwendung magnetisch , reaktionsbereiter Mikropartikeln durchgeführt, an die Antikörper an den Analyten gebunden werden. In diesem Fall sind die gebundenen Antikörper im Überschuss in bezug zu dem erwarteten Mengenbereich des Analyten vorhanden, so dass der gesamte Analyt gebunden wird. Die Mikropartikeln werden in Kontakt mit der Probe platziert, und gleichzeitig oder aufeinanderfolgend wird ein zweiter Antikörper dem selben Analyten hinzugefügt, erneut im Überschuss in bezug zu dem Analyten, wobei die ersten und zweiten Antikörper verschiedene Epitope an den Analyten in einer nichtstörenden Weise binden, und der zweite Antikörper an eine erkennbar Markierung konjugiert ist. Nach einer geeigneten Inkubationszeitspanne wird die flüssige Mischung mit den darin suspendieren Mikropartikeln unter den Einfluss eines Magnetfelds gebracht, was die Mikropartikeln veranlasst, an den Wänden des Reaktionsbehälters anzuhaften, und die flüssige Phase wird entfernt. Die Mikropartikeln, die weiterhin an der Behälterwand anhaften, werden dann zum Entfernen von überschüssigen Mengen des zweiten, markierten Antikörpers gewaschen, die nicht an den immobilisierten Analyten gebunden wurden, und die Mikropartikeln werden dann erneut in einer Trägerflüssigkeit für Einführung in ein Flusszytometer suspendiert, wo sie nach Größe und der detektierten Markierung sortiert werden. Ein Beispiel eines Analyten, der einfach auf diese Weise detektiert wird, ist Schilddrüsenstimulierungshormon (TSH). Die Markierung an dem zweiten Antikörper kann erneut Phycoerythrin sein.
Diese Erfindung kann auch auf die Analysen angewendet werden, die nicht gebundene Markierung von ungebundener Markierung trennen, aber nichtsdestoweniger Trennung der festen von der flüssigen Phase an irgendeinem Punkt in der Analyse erfordern. Beispiele sind Analysen zum Identifizieren von Antikörpern für Infektionskrankheiten. Die Analytantikörper binden sich an partikelgebundene Antigene in der Analyse, und ihnen folgen markierte Bindungselemente, die sich an die Analytantikörper binden, welche auf diese Weise an die feste Phase befestigt werden. Die ursprünglich an die feste Phase gebundenen Antigene werden so in einer hohen Dichte behandelt, so dass eine jegliche Markierung, die anschließend an der festen Phase anhaftet, ausreichend konzentriert an der festen Phasenoberfläche vorliegt, um von ungebundener Markierung in der Lösung unterschieden zu werden. Während dies die Notwendigkeit zur Trennung gebundener von ungebundenen Markierungen beseitigt, erfordert es weiterhin die Entfernung anderer Spezies von der Probe, die mit den markierten zweiten Antikörpern konkurrieren würden, welche sich an die Analytenantikörper binden, die an das partikelgebundene Antigen gebunden sind. Die magnetischen Partikeln dienen zu diesem Zweck wie in der in den vorhergehenden Absätzen beschriebenen Analyse, und diese wird durchgeführt, bevor die Markierung hinzugefügt wird.
An anderer Typ serologischer Analyse für Antikörper stellt ein weiteres Beispiel dar, welche durch Verwendung magnetisch reaktionsbereiter Mikropartikeln durchgeführt wird, an die Antikörper an dem Antikörperanalyten gebunden werden. Die Mikropartikeln werden in Kontakt mit der Probe gebracht. Nach einer geeigneten Inkubationszeitspanne, wird die flüssige Mischung mit suspendierten Mikropartikeln unter ein Magnetfeld gesetzt, um die Mikropartikeln an den Reaktionsbehälterwände anhaften zu lassen, und die flüssige Phase wird entfernt. Markiertes Antigen wird dann dem die Mikropartikeln enthaltenden Behälter hinzugefügt, wobei das Antigen das eine ist, auf das die Analytenantikörper gerichtet sind, und das an eine detektierbare Markierung konjugiert ist oder durch andere Bindungspaare befestigt ist, Nach einer geeigneten Inkubationszeitspanne wird diese neue flüssige Mischung in ein Flusszytometer eingebracht, wo die Mikropartikeln nach Größe und detektierter Markierung klassifiziert werden. Ein Beispiel eines für diesen Analysetyp empfänglichen Analyten ist Human-Anti-Röteln IgG. Das partikelgebundene Reagenz ist Röteln-Antigen und der markierte zweite Antikörper ist Anti-Human IgG-Antikörper, der kovalent mit Phycoerythrin verbunden ist.
Die mehreren Analysen, die an einer einzigen Fluidprobe in Übereinstimmung mit dieser Erfindung durchgeführt werden können, können alle vom gleichen Typ sein (d. h. alle konkurrierend, alle immunometrisch, alle serologisch, etc.), oder eine Kombination verschiedener Typen darstellen. Beispiele von Kombinationen von Analysen, die durch dieses Verfahren durchgeführt werden können, sind:

(1)Analysen für Schilddrüsenstimulierungshormone und entweder freies T₄ oder Gesamt-T₄;
(2) Analysen für Vitamin B₁₂ und Folat; und
(3) ToRCH-Analysen, die Serum IgG und Serum IgM Reaktionen auf Toxoplasma gondii; Rötelnvirus, Zytomegalovirus, und Herpes Simplex-Virus der Typen 1 und 2 detektieren.

Verfahren und Geräte für Flusszytometrie sind im technischen Gebiet bekannt, und diejenigen, die bekannt sind, können in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Flusszytometrie besteht allgemein in dem Vorbeigehen einer Suspension der Mikropartikeln als ein Strom an elektrooptischen Sensoren in solcher Weise, dass jedes Mal nur ein Partikel die Sensoren passiert. Wenn jeder Partikel die Sensoren passiert, erzeugt der Partikel ein Signal aufgrund von Lichtstreuung, wobei die Amplitude des Signals mit der Partikelgröße variiert. Die Signale werden durch die Geräte gemäß ihren Amplituden klassifiziert, und die Partikeln dadurch nach Größe unterschieden. Das Vorliegen und die Menge von Markierung auf jedem Partikel wird auch durch seine Fluoreszenz detektiert und mit dem Partikelgrößenunterbereich korreliert, so dass einzelne Analyseergebnisse für jeden Partikelgrößenunterbereich erzielt werden. Beschreibungen von Geräten und Verfahren für Flusszytometrie sind in der Literatur zu finden. Beispiele umfassen McHugh, "Flow Microsphere Immunoassays for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes" [Flussmikrosphären-Immunanalysen für quantitative und simultane Detektion mehrerer löslicher Analyten] Methods in Cell Biology 42, Teil B (Academic Press, 1994); McHugh et al., "Microphere-Based Fluorescence Immunoassays using Flow Cytometry Instrumentation" [Auf Mikrosphäre basierende Fluoreszenz-Immunanalysen unter Verwendung von Flusszytometriegeräten], Clinical Flow Cytometry, Bauer, K. D., et al, Herausgeber (Baltimore, Maryland, USA: William und Williams, 1993), Seiten 535–544; Lindmo et al., "Immunometric Assay Using Mixtures of Two Particle Types of Different Affinity" [Immunometrische Analyse unter Verwendung von Mischungen von zwei Partikeltypen unterschiedlicher Affinität], J. Immunol. Meth. 126: 183-189 (1990); McHugh, "Flow Cytometry and the Application of Microsphere-Based Fluorescence Immunoassays", [Flusszytometrie und die Anwendung von auf Mikrosphäre basierenden Fluoreszenz-Immunanalysen], Immunochemica 5: 116 (1991); Horan et al., "Fluid Phase Particle Fluorescence Analysis: Rheumatoid Factor Specificity Evaluated by Laser Flow Cytophotometry" [Flüssigphasen-Partikelfluoreszenzanalyse: Rheumafactorspezifität bewertet durch Laserflussphotometrie] Immunoassys in the Clinical Laboratory, 185–189 (Liss 1979); Wilson et al. "A New Microsphere-Based Immunofluorescence Assay Using Flow Cytometry" [Eine neue auf Mikrosphäre basierende Immunfluoreszenzanalyse unter Verwendung von Flusszytometrie] J. Immunol. Meth. 107: 225–230 (1988); Fulwyler et al. "Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes" [Flussmikrosphären-Immunanalyse für die quantitative und simultane Detektion mehrerer löslicher Analyten] Meth. Cell Biol. 33: 613–629 (1990); Coulter Electronics Inc., GB-Patent Nr. 1,561,042 (veröffentlicht am 13. Februar 1980); und Steinkamp et al. Review of Scientific Instruments 44(9): 1301–1310 (1973).
In ähnlicher Weise sind Verfahren und Geräte zum Anlegen und Entfernen eines Magnetfelds als Teil einer automatisierten Analyse den Fachleuten in diesem Gebiet bekannt und in der Literatur aufgezeichnet. Beispiele von Literaturaufzeichnungen sind das Patent von Forrest et al., das Patent von Ithakissios, das Papier von Vlieger et al., das Papier von Dudley und das Papier von Smart, auf die alle oben verwiesen wurde.
Diese Erfindung ist auf die Analyse biologischer Fluids, insbesondere physiologischer Fluids so wie Vollblut-, Serum-, Urin-, Rückenmarkflüssigkeits-, Speichel- und Stuhlproben anwendbar.
Die folgenden Beispiele werden absolut nur zu Darstellungszwecken angeboten.
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel zeigt die Anhaftung von Virusantigen (Rubella (RUB), Zytomegalievirus (CMV) und Herpes Simplex Virus 2 (HSV2) an magnetische Kügelchen.
Drei Typen magnetischer Kügelchen wurden verwendet: SPHERO^TM magnetische Carboxyl-Partikeln von Spherotech, Inc. Libertyville, Illinois, USA - Poly(styrol-/Acrylsäurepartikeln), mit einem Durchmesser von 4,35 Mikrometern (μm), einer Dichte von 1,17 g/cm³, die 12% (Gewichtsprozent) Magnetit enthielten.
SPHERO^TM magnetische Carboxyl-Partikeln von Spherotech, Inc. Libertyville, Illinois, USA – Poly(styrol-/Acrylsäurepartikeln), mit einem Durchmesser von 3,18 Mikrometern (μm), einer Dichte von 1,17 g/cm³, die 12% (Gewichtsprozent) Magnetit enthielten.
SINTEF Applied Chemistry, Trondheim, Norwegen – Poly(styrol/divinylbenzol)-Partikeln, mit einem Durchmesser von 10 μm, einer Dichte von 1,23 g/cm³, die 17,9 (Gewichtsprozent) Magnetit/Maghemit enthielten.
In Tabelle 1 sind die Mengen jedes der in dieser Zubereitung verwendeten Materialien aufgelistet:
Tabelle 1 Verwendete Mengen
Die Kügelchen wurden in jedem Fall in Teströhrchen gegeben und mehrere Male mit 100 mM Phosphatpuffer, pH 6,8, gewaschen. Die gewaschenen Kügelchen wurden dann in dem in Tabelle I aufgeführten Volumen von Phosphatpuffer suspendiert und eine jeweilige Antigenlösung wurde (CMV-Antigen von Chemicon International Incorporated, Temecula, Kalifornien, USA; HSV2-Antigen von Ross Southern Labs, Salt Lake City, Utah, USA; und RUB-Antigen von Viral Antigens, Memphis, Tennessee, USA) in der in der Tabelle aufgeführten Menge hinzugefügt. Die Teströhrchen wurden dann über Nacht bei Raumtemperatur in einer aufrechtstehenden Weise rotiert. Die Röhrchen wurden dann auf einen Magnetabscheider gegeben und der Überstand wurde abgesaugt und entsorgt. Die resultierenden Kügelchen wurden mit einem Waschpuffer gewaschen, der aus 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, 0,01, Tween 20,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Natriumazid, 150 mM Natriumchlorid bestand, dann erneut Magnetabscheidung ausgesetzt, und in einem Speicherpuffer suspendiert, der aus 50 mM Phosphatpuffer, pH 7,4, 5% Glycerol, 1% Rinderserumalbumin, 0,1% Natriumazid, 150 mM Natriumchlorid bestand.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung der CMV-beschichteten magnetischen Kügelchen von Beispiel 1 in einer Flusszytometrie-Immunanalyse.
Vorgehensweise:

1. 100 μL CMV IgG positive und negative Kontrollproben für Immunanalyse von Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, Kalifornien, USA, verdünnt 1 : 10 in Waschpuffer) wurden in 12 × 75 mm Polypropylen-Teströhrchen gegeben.
2. Jedem Röhrchen wurden 100 μL der CMV-beschichteten Partikeln (in Beispiel 1 beschrieben) hinzugefügt, die 1 : 1000 in Waschpuffer verdünnt waren.
3. Die Röhrchen wurden bei Umgebungstemperatur 30 Minuten lang verwirbelt.
4. Nach Verwirbelung wurden 800 μL Waschpuffer jedem Röhrchen hinzugefügt.
5. Die Röhrchen wurden 3 Minuten lang in einen Magnetabscheider gelegt und die flüssige Phase wurde entfernt.
6. Schritte 4 und 5 wurden wiederholt, jedoch mit 1000 μL Waschpuffer.
7. 200 μL einer 1 : 100 Verdünnung von Anti-Human IgG-Phycoerythrin-Konjugat (Chemicon International Inc. Temecula, Kalifornien, USA) werden hinzugefügt.
8. Die Röhrchen werden bei Umgebungstemperatur 30 Minuten lang verwirbelt.
9. Nach dieser Zeit werden die Proben in das Flusszytometer (Bryte HS, Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, California, USA) injiziert, das mit einer Xenon-Lichtbogenlampe ausgestattet ist.

Ergebnisse:
Positive und negative CMV-Kontrollproben zeigten fluoreszierende Spitzen, die 898 bzw. 60 relativen linearen Fluoreszenzeinheiten entsprachen. Wie erwartet, gab die positive Kontrollprobe ein beträchtlich erhöhtes Signal in bezug zu der negativen Kontrollprobe ab.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel stellt die Verwendung der CMV-, HSV2- und RUB-beschichteten magnetischen Partikeln von Beispiel 1 in einer simultanen Flusszytometrie-Immunanalyse mehrerer Analyten dar.
Vorgehensweise:

1. 100 μL Patientenproben (1 : 10 in Waschpuffer verdünnt) von bekanntem CMV-, HSV2- und RUB-Antikörperstatus wurden zu 12 × 75 mm Polypropylenteströhrchen hinzugegeben.
2. Jedem Röhrchen wurden 100 μL einer Mischung aus CMV-, HSV2- und RUB-antigenbeschichteten Partikeln hinzugefügt (beschrieben in Beispiel 1), verdünnt in Waschpuffer.
3. Die Röhrchen wurden bei Umgebungstemperatur 15 Minuten lang verwirbelt.
4. Nach Verwirbelung wurden 800 μL Waschpuffer jedem Röhrchen hinzugefügt.
5. Die Röhrchen wurden 5 Minuten lang in einen Magnetabscheider gestellt und die flüssige Phase wurde entfernt.
6. Schritte 4 und 5 wurden wiederholt, jedoch mit 1000 μL Waschpuffer 7. 200 μL einer 1 : 300 Verdünnung von Anti-Human IgG-Phycoerythrin-Konjugat (Chemicon International Inc., Temecula, Kalifornien, USA) werden hinzugefügt.
8. Die Röhrchen werden bei Umgebungstemperatur 15 Minuten lang verwirbelt.
9. Nach dieser Zeit werden die Proben in das Flusszytometer (Bryte HS, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, USA) injiziert, das mit einer Xenon-Lichtbogenlampe ausgestattet ist.

Ergebnisse:
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengefasst:
TABELLE II Testergebnisse
Die Daten in Tabelle II zeigen, dass positive Proben Fluoreszenz in bezug zu negativen Proben wesentlich vergrößert haben.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel zeigt die kovalente Anhaftung von Röteln (RUB)-Antigen an magnetische Kügelchen.
Die magnetischen Partikeln waren magnetische SPHERO^TM Carboxyl-Partikeln von Spherotech, Inc., Libertyville, Illinois, USA -Poly(styrol/Alkylensäurepartikeln), 25 mg/ml, Durchmesser 7,1 Mikrometer, Dichte 1,165 g/cm³, und enthielten 12 Gewichtsprozent Magnetit.
1,13 ml Kügelchen wurden in ein Teströhrchen gegeben und mehrere Male mit 50 mM 2-(N-morpholino)Ethansulfonsäure (MES)-Puffer, pH 5,5 gewaschen. Die gewaschenen Kügelchen wurden dann in 1,25 ml 2 mg/ml Polylysin (MW 18.000) in 50 mM MES-Puffer, pH 5,5 suspendiert. Der resultierenden Lösung wurden 125 μl aus 20 mg/ml 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) in Wasser hinzugefügt. Die Lösung wurde bei Umgebungstemperatur 18 Stunden lang auf ein aufrechtstehendes Rotiergerät gegeben. Nach dieser Zeit wurde die Lösung von den Partikeln getrennt und entsorgt. Die Partikeln wurden dann mehrere Male mit 0,2 M Boratpuffer, pH 8,5, gewaschen. Die Partikeln wurden erneut in 2,5 ml Boratpuffer, pH 8,5, suspendiert. Dieser Lösung wurden 50 mg Bernsteinsäureanhydrid hinzugefügt. Die Lösung wurde dann 4 Stunden lang bei Umgebungstemperatur auf ein aufrechtstehendes Rotiergerät gegeben. Nach dieser Zeit wurde die Lösung von den Partikeln getrennt und entsorgt. Die Partikeln wurden dann mehrere Male mit 50 mM MES, pH 5,5 gewaschen. Die Partikeln wurden zweimal mit 0,1 M Carbonatpuffer, pH 9,6, und dann dreimal mit 20 mM Phosphatpuffer, pH 4,5 gewaschen. Die Partikeln wurden schließlich in 1 ml 20 mM Phosphatpuffer, pH 4,5, suspendiert. Dieser Lösung wurde 1 ml von 20 mg/ml EDC in 10 mM Phosphatpuffer, pH 4,5, hinzugefügt. Die Lösung wurde dann bei Umgebungstemperatur 4 Stunden lang auf ein aufrechtstehendes Rotiergerät gegeben. Nach dieser Zeit wurde die Lösung von den Partikeln getrennt und entsorgt. Die Partikeln wurden dreimal mit 20 mM Phosphatpuffer, pH 4,5, gewaschen. Danach wurden die Kügelchen in 2 ml 0,2 M Boratpuffer, pH 8,5, suspendiert. Hierzu wurden 0,5 ml von 0,2 mg/ml Rötelnantigen von Viral Antigens Incorporated, Memphis, Tennessee, USA, in 0,2 M Boratpuffer, pH 8,5, 2 mg/ml 3-[(3-Cholamidpropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS), 0,1% Natriumazid hinzugefügt. Die Teströhrchen wurden dann in aufrechtstehender Weise über Nacht bei Raumtemperatur rotiert. Am nächsten Tag wurden 100 μl von 0,25 M Hydroxylamin in 0,2 M Boratpuffer, pH 8,5, eingeführt. Die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur eine Stunde lang auf ein Rotiergerät mit vertikaler Halterung gegeben. Nach dieser Zeit wurde die Lösung von den Partikeln getrennt und entsorgt. Die Partikeln wurden dreimal mit Waschpuffer (siehe Beispiel 1) gewaschen. Die resultierenden Kügelchen wurden in 2,5 ml Waschpuffer aufgenommen und 1 Stunde bei Raumtemperatur auf ein aufrechtstehendes Rotiergerät gegeben. Nach dieser Zeit wurde die Lösung von den Partikeln getrennt und entsorgt. Die Partikeln wurden dreimal mit Speicherpuffer (siehe Beispiel 1) gewaschen. Schließlich wurden die Partikeln in 1 ml Speicherpuffer suspendiert und auf 4°C gesetzt.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel stellt die Verwendung von magnetischen Partikeln mit kovalent anhaftendem Rötelantigen von Beispiel 4 in einer quantitativen Flusszytometrie-Immunanalyse dar.
Verfahrensweise:

1. 100 μl von RUB IgG Immunanalysestandards, stark positiv, niedrig positiv und negative Kontrollproben von Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Inc. Hercules, Kalifornien 1 : 30 in Waschpuffer verdünnt) wurden 12 × 75 mm Polypropylenteströhrchen hinzugefügt.
2. Jedem Röhrchen wurden 100 μl von RUBantigenbeschichteten Partikeln (oben beschrieben) hinzugefügt, 1 : 200 verdünnt in Waschpuffer.
3. Die Röhrchen wurden bei Umgebungstemperatur 15 Minuten verwirbelt.
4. Nach Verwirbelung wurden 750 μl Waschpuffer jedem Röhrchen hinzugefügt.
5. Die Röhrchen wurden 1 Minute lang in einen Magnetabscheider gestellt und die flüssige Phase wurde entfernt.
6. Die Schritte 4 und 5 werden zwei weitere Male wiederholt, jedoch mit 1000 μl Waschpuffer.
7. 200 μl einer 1 : 300 Verdünnung von Anti-Human IgG-Phycoerythrin-Konjugat (Chemicon International Inc., Temecula, Kalifornien, USA) werden hinzugefügt.
8. Die Röhrchen werden bei Umgebungstemperatur 15 Minuten langverwirbelt.
9. Die Proben werden dann in das Flusszytometer (Bryte HS, Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, California, USA) injiziert, das mit einer Xenon-Quecksilberlichtbogenlampe ausgestattet ist.

Ergebnisse:
Tabelle III enthält Daten, die durch Befolgung des obigen Protokolls erhalten wurden. Die Standards wurden in eine logistische Gleichung mit 4 Parametern eingesetzt. Die Konzentrationen aller Proben wurden von dieser Kurve berechnet. Die Werte für die Kontrollproben sind ähnlich den Werten, die durch die ELISA-Technik von Bio-Rad zugeordnet werden.
TABELLE III Testergebnisse

Claims

Verfahren zum individuellen Detektieren einer Mehrzahl von Analyten in einer einzelnen biologischen Fluidprobe durch Analysen, die das Binden von Spezies in der einzelnen biologischen Fluidprobe an eine feste Phase, die in Kontakt mit einem flüssigen Medium steht, in dem die feste Phase nicht lösbar ist, und die Trennung der festen Phase von dem flüssigen Medium umfassen, wobei das Verfahren umfasst: Verwenden einer Mehrzahl von Mikropartikeln aus magnetisch reaktionsbereitem Material als die feste Phase, an die jeweils ein Analysereagenz gekoppelt ist, das selektiv in einer Analyse für einen der Mehrzahl von Analyten aktiv ist, wobei die Mikropartikeln hinsichtlich ihrer Größe über einen Bereich variieren, der ein Aggregat einer Mehrzahl von Unterbereichen ist, und jeder Unterbereich von anderen Unterbereichen des Aggregats durch Flusszytometrie und durch das Analysereagenz unterscheidbar ist, das an die Mikropartikeln des Unterbereichs gekoppelt ist; magnetisches Trennen der Mikropartikeln in allen der Unterbereiche von dem flüssigen Medium in einem einzigen Schritt; und Definieren des flüssigen Mediums als ein erstes flüssiges Medium, Suspendieren der von diesem getrennten Mikropartikeln in einem zweiten flüssigen Medium, Analysieren der Mikropartikeln in dem zweiten flüssigen Medium in einem einzigen Schritt durch Flusszytometrie in Übereinstimmung mit der Mehrzahl von Analysen, wodurch individuelle Detektierung der Mehrzahl von Analyten in der einzelnen biologischen Fluidprobe erzielt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem eines der an die feste Phase gekoppelten Analysereagenzien ein Bindungsprotein ist, das spezifisch für einen der Analyten ist, wobei das Verfahren umfasst, zu dem ersten flüssigen Medium eine detektierbare Markierung hinzuzufügen, die sich an die feste Phase bindet, und die magnetische Trennung umfasst, die detektierbare Markierung, die an die feste Phase gebunden ist, von einer nicht gebundenen detektierbaren Markierung zu trennen, die in dem ersten flüssigen Medium suspendiert ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die detektierbare Markierung dem ersten flüssigen Medium als ein Konjugat mit einer zusätzlichen Menge des einen Analyten hinzugefügt wird, wodurch das Konjugat und der eine Analyt in der Probe veranlasst werden, in Konkurrenz für das Bindungsprotein in einer Konkurrenzanalyse zu treten.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die detektierbare Markierung dem ersten flüssigen Medium als ein Konjugat mit einer zusätzlichen Menge des einen Analyten nach einer ersten Inkubationszeitspanne hinzugefügt wird, wodurch das Konjugat in einer Sequenzanalyse veranlasst wird, mit denjenigen Stellen des Bindungsproteins, die nicht durch den einen Analyten in der Probe besetzt sind, zu reagieren.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem das Bindungsprotein als ein erstes Bindungsprotein definiert ist, und die detektierbare Markierung dem ersten flüssigen Medium als ein Konjugat mit einem zweiten Bindungsprotein hinzugefügt wird, das auch spezifisch für den einen Analyten ist, was den einen Analyten veranlasst, sich in einer Sandwichanalyse sowohl an das erste Bindungsprotein als auch das Konjugat zu binden.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der eine Analyt ein Antigen ist, das erste Bindungsprotein ein erster Antikörper zu dem Antigen ist, und das zweite Bindungsprotein ein zweiter Antikörper zu dem Antigen ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der eine Analyt ein erster Antikörper ist, das erste Bindungsprotein ein Antigen ist, und das zweite Bindungsprotein ein zweiter Antikörper mit Bindungsaffinität für den ersten Antikörper ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem eines der Analysereagenzien ein Bindungsprotein ist, das an die feste Phase gebunden und spezifisch für einen der Analyten und für andere Komponenten in dem ersten flüssigen Medium ist, und die magnetische Trennung umfasst, die Mikropartikeln mit dem einen daran gebundenen Analyten von den anderen Komponenten in dem ersten flüssigen Medium zu trennen, bevor die Mikropartikeln mit einem zweiten flüssigen Medium in Kontakt gebracht werden, das eine detektierbare Markierung enthält, welche sich spezifisch an den einen Analyten bindet.