CN102830209B - 一种筛选抗糖尿病活性化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种筛选抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，包括：(1)制备键合酶磁珠；(2)利用至少两种键合酶磁珠对中药溶液或天然提取物溶液进行选择性吸附，不同种键合酶磁珠上所键合的靶标蛋白互异，所述的靶标蛋白为麦芽糖酶、蔗糖酶或脂肪酶；(3)分离出所有键合酶磁珠共同吸附的化合物作为样本集；(4)通过针对靶标蛋白的抑制活性实验在样本集中筛选所述的抗糖尿病活性化合物。本发明筛选抗糖尿病活性化合物的方法可以从中药或天然产物提取物中针对多靶点或酶筛选抗糖尿病化合物，并应用于抗糖尿病药物的研制，同时减少了传统方法中初筛时化合物制备分离的步骤，提高了筛选效率、缩短了筛选时间。

Description

一种筛选抗糖尿病活性化合物的方法

技术领域

本发明涉及药物筛选领域，尤其涉及一种筛选抗糖尿病活性化合物的方法。

背景技术

糖尿病是一种慢性代谢紊乱性疾病，糖尿病控制不好会引发多种并发症，可以使人体多组织多器官受损，致残、致死率高。糖尿病已经成为全球性流行病，根据WHO的报告，全世界的糖尿病患者大约有1.6亿，糖尿病在我国总人数已达4000万以上，仅次于印度，居世界第二，危害巨大。

目前，对糖尿病的治疗的主要干预策略是控制饮食、减少摄入性碳水化合物的含量等。I型糖尿病由于胰腺产生胰岛素的细胞已经彻底损坏，只能依靠是依赖胰岛素治疗。II型糖尿病约占糖尿病人数的90％，目前临床治疗II型糖尿病的药物主要包括双胍类药物、噻唑烷二酮类胰岛素增敏剂类药物、糖苷酶抑制剂类药物、血管紧张素转换酶抑制剂类药物等。近年来，研究发现很多中成药及天然产物表现出较好的降糖活性，尤其是通过多靶点、多途径作用来控制血糖含量。从中药及天然产物中筛选发现具有多方面降糖活性的化合物成为研究热点。

传统的筛选方法包括提取、分离、纯化出单体化合物，然后进行活性筛选。如公开号为101437529的中国专利文献报道了一种具有抗病毒活性的类黄酮化合物，该化合物是在鱼腥草的提取物中分离得到，先用甲醇提取鱼腥草的提取物，将提取物减压浓缩并且将其用乙酸乙酯提取得到乙酸乙酯提取物；再将浓缩物于甲醇中溶解，并通过色谱法分离/纯化得到的类黄酮化合物，再对其物理化学性质以及抗病毒活性进行研究分析。这种方法耗时耗力效率低，而且化合物在分离纯化过程中可能降解变性失去活性，或者分离出非目标化合物。

目前，基于亲和选择-质谱的方法在药用植物活性成分筛选中的应用越来越多，该法通过发现混合物中的靶点结合物，然后进行鉴定，可以大大加速筛选的过程。如公开号为101339167的中国专利文献报道了一种基于靶蛋白亲和选择的活性成分或活性成分群的高通量筛选方法，通过将靶蛋白与待测化合物在缓冲液中孵育，孵育得到的混合溶液上样于分子排阻色谱柱或在线固相提取柱，缓冲液洗脱，洗脱液经解离，解离液再经在线固相提取柱分离，最后导入高效液相-质谱系统进行分析，进行化合物结构确证，并对其进行定量分析，计算这些活性成分对于靶蛋白的结合率，以评价其活性。

基于亲和选择-质谱的方法包括亲和超滤法、磁珠法、涡流色谱法、亲和细胞膜色谱法等。然而，现有筛选方法只能对单一靶点或酶进行筛选，目前仍缺乏针对多个靶点或酶的快速筛选方法。

发明内容

本发明提供了一种筛选抗糖尿病活性化合物的方法，克服了现有技术中只能针对单一靶点或酶的活性化合物进行筛选的问题。

一种筛选抗糖尿病活性化合物的方法，包括：

制备键合酶磁珠；

利用至少两种键合酶磁珠对中药溶液或天然提取物溶液进行选择性吸附，不同种键合酶磁珠上所键合的靶标蛋白互异，所述的靶标蛋白为麦芽糖酶、蔗糖酶或脂肪酶；

分离出所有键合酶磁珠共同吸附的化合物作为样本集；

通过针对靶标蛋白的抑制活性实验在样本集中筛选所述的抗糖尿病活性化合物。

本发明在磁珠上键合的酶为麦芽糖酶、蔗糖酶或脂肪酶，也可以键合其它糖苷链水解酶，如淀粉酶，异构麦芽糖酶，乳糖酶等。糖苷链水解酶可以分解糖类释放葡萄糖，葡萄糖被小肠上皮吸收后进入血液，成为血糖。磁珠由于可吸附具有糖苷链水解酶抑制活性的化合物，这些糖苷链水解酶抑制剂通过可逆性抑制或竞争性抑制糖苷酶，延迟多糖、双糖转化为葡萄糖，减缓餐后血糖的升高，此外还可以刺激胰岛素的分泌，降低血糖浓度，在治疗糖尿病、减肥等药物开发方面具有光明的前景。

将不同的靶标蛋白即受体(如麦芽糖酶、蔗糖酶或脂肪酶等)所键合的磁珠，分别被放入循环反应通道内的不同反应区内，中药溶液或天然提取物溶液被置于循环反应通道内，与键合酶磁珠在一定温度下孵育一段时间之后，通过流动清洗将未结合的化合物和靶标蛋白-配体复合物进行分离，加有机试剂使配体从靶标蛋白-配体复合物中解离出来，用液相色谱质谱联用进行分析，最后用传统的活性测定方法对这些配体的活性进行验证。

所述选择性吸附时，将中药溶液或天然提取物溶液置入一循环反应通道内，该循环反应通道内具有多个反应区，键合有不同靶标蛋白的键合酶磁珠处于各自对应的反应区内。这样，可以通过动力装置如蠕动泵将中药溶液或天然提取物溶液泵入循环反应通道内，并循环孵育，可以使多种键合酶磁珠同时完成吸附，

制备键合酶磁珠是本发明实施过程中的关键，所述制备键合酶磁珠的过程为：将磁珠清洗干净，加入活化试剂活化磁珠表面，再次清洗，加入溶解的靶标蛋白，孵育，移去上清液，经缓冲液冲洗后再加入溶解了牛血清白蛋白的PBS溶液，移去上清液得到键合酶磁珠得到键合酶磁珠。

为了避免杂质的干扰，在制备键合酶磁珠之前要先将磁珠清洗干净，所述磁珠的清洗试剂为2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液，浓度为10～50mmol/L，pH为4～8；更优选为，浓度为25mmol/L，pH为6；清洗试剂的加入量没有特殊要求，可根据磁珠的量进行调整，清洗时间一般为10min左右，清洗两次即可。

清洗后的磁珠要活化后才能够结合靶标蛋白，将磁珠与活化试剂室温孵育30min左右，移去上清液，用所述的2-(N-吗啡啉)乙磺酸溶液清洗；所述的活化试剂为1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，溶液浓度分别为10～80mg/mL，10～80mg/mL。1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液的溶剂为2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液。

键合时，先将靶标蛋白溶解，所述靶标蛋白由25mmol/L、pH为6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液溶解，靶标蛋白的浓度为0.5～2mg/mL。溶解后将其与活化好的磁珠震荡混匀，孵育，所述孵育的时间为1～5h，温度为0～25℃；更优选为，孵育的时间为2h，温度为4℃。移去上清液，可用PBS缓冲液清洗掉键合酶磁珠上未结合的化合物，再加入质量分数为0.1～0.5％的牛血清白蛋白的PBS溶液覆盖磁珠上未结合的活性位点，震荡混匀，弃去上清液。

对键合酶磁珠质量的考察，可采用扫描式电子显微镜对键合酶磁珠的表面扫描成像，一般磁珠表面不粗糙、较光滑的表明磁珠键合情况良好。

键合酶磁珠制备完成后，利用键合有不同靶标蛋白的键合酶磁珠对中药溶液或天然提取物溶液进行选择性吸附，达到初步筛选的目的，而后洗脱分离键合酶磁珠上吸附的化合物，进行所述的活性化合物的筛选。

所述中药溶液或天然提取物溶液的溶剂为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的离子强度为1～300mmol/L，pH为5.0～8.0；更优选为，PBS缓冲液的离子强度为10mmol/L，pH为6.8。

所述选择性吸附时，将中药溶液或天然提取物溶液置入一循环反应通道内，该循环反应通道内具有多个反应区，键合有不同靶标蛋白的键合酶磁珠处于各自对应的反应区内。这样，可以通过动力装置如蠕动泵将中药溶液或天然提取物溶液泵入循环反应通道内，并循环孵育，可以使多种键合酶磁珠同时完成吸附，蠕动泵保持转速为20～60r/min，优选为40r/min。

反应区内设有磁铁以固定键合酶磁珠，防止键合酶磁珠被流动的中药溶液或天然提取物溶液冲走，而导致不同种键合酶磁珠相互混杂。在所述的选择性吸附中，反应区内的键合酶磁珠浸没在反应通道内的中药溶液或天然提取物溶液中进行孵育，所述孵育的时间为10～60min，温度为20～50℃；更优选为，孵育的时间为45min，温度为37℃。

乙腈的水溶液可以将吸附在键合酶磁珠表面的化合物洗脱下来，其中乙腈的体积百分比浓度为10％，然后对洗脱液进行液相色谱质谱联用分析，以所有键合酶磁珠共同吸附的化合物作为样本集。

对于样本集中各化合物的获取，可以采用常规柱色谱分离技术分离获取样本集，再采用液相色谱分离、纯化样本集中各化合物或购置相对应的化合物，通过对靶标蛋白的抑制活性实验在样本集中筛选所述的抗糖尿病活性化合物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

(1)本发明可以从中药或天然产物提取物中针对多靶点或酶筛选抗糖尿病化合物，并应用于抗糖尿病药物的研制。

(2)本发明对筛选抗糖尿病活性化合物的方法的条件进行了优化，快速、准确、重现性好。

(3)本发明通过键合酶磁珠的选择性吸附达到初筛的目的，减少了传统方法中初筛时化合物制备分离的步骤，提高了筛选效率、缩短了筛选时间。

附图说明

图1为三叶糖脂清提取物溶液中磁珠洗脱液分析谱图。

具体实施方式

下面将结合附图和实施例进一步阐释本发明，该实施例仅用于说明本发明而非对本发明的限制。

实施例所用仪器：AgiLent 100型液相色谱(AgiLent公司)；FinniganLCQ Deca XPpLus液质联用仪器(Finnigan公司)。

一、基于多种键合酶磁珠的活性化合物筛选系统

1.试剂及溶液配制：

麦芽糖酶、蔗糖酶、猪胰腺脂肪酶(Simga公司)；羧基磁珠Dynabeads&reg MyOne CarboxyLic Acid，规格：10mg/mL(invitrogen公司)；1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC，sigma公司)；2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES，sigma公司)；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS，sigma公司)。

25mmol/L的MES的水溶液配制：称取MES适量，加水溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至6，制成浓度为25mmol/L的MES溶液。

50mg/mL EDC溶液配制：称取EDC适量，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为50mg/mL的EDC溶液。临用时新鲜配制。

50mg/mL NHS溶液配制：称取NHS适量，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为50mg/mL的NHS溶液。临用时新鲜配制。

1mg/mL麦芽糖酶、蔗糖酶及猪胰腺脂肪酶(以下称脂肪酶)溶液配制：分别称取麦芽糖酶、蔗糖酶及脂肪酶1mg，快速溶解在冷的25mmol/L的MES溶液中，制成浓度为1mg/mL的麦芽糖酶、蔗糖酶及脂肪酶溶液。临用时新鲜配制。

2.键合酶磁珠的制备

磁珠活化：取300μL磁珠，加入等体积25mmol/L的MES(pH为6)是水溶液清洗两次，每次10min，弃去清洗液，加入50μL新鲜配置50mg/mL EDC溶液和50μL的50mg/mLNHS溶液，混合均匀，在室温下缓慢倾斜旋转孵育30min。孵育后，把管子放于磁铁上4min，移除上清液，使用300μL 25mmol/L MES的水溶液清洗两次。

磁珠键合：在活化磁珠中，分别加入1mg/mL麦芽糖酶、蔗糖酶及脂肪酶溶液60μL，再加入25mmol/L MES溶液40μL，震荡混合均匀，4℃缓慢倾斜旋转孵育2h，孵育后，把管子放于磁铁上4min，移除上清液。加10mmol/L PBS缓冲液300μL冲洗包被的磁珠4次。

3.键合酶磁珠质量考察

将制备的键合酶磁珠分散在10mmol/L PBS缓冲液中，使用扫描式电子显微镜对空白磁珠、麦芽糖酶键合酶磁珠、蔗糖酶键合酶磁珠及脂肪酶键合酶磁珠的表面分别进行扫描成像，检查磁珠键合情况。结果表明，空白磁珠表面非常粗糙，键合酶磁珠表面比较光滑，表明酶已键合于磁珠表面。

4.基于多种键合酶磁珠的活性化合物筛选系统

该系统由连接腔、蠕动泵、永久磁铁、磁珠、化学信息获取和处理软件构成，其中质谱信息由Finnigan液相色谱-质谱联用仪获取。

二、基于多种键合酶磁珠的活性化合物筛选条件的优化

以咖啡酸、阿魏酸、橙皮苷为模型药物，对筛选条件进行优化。各取100μL麦芽糖酶键合的磁珠、蔗糖酶键合的磁珠、甘油三酯酶键合的磁珠分别放入三个连接腔中的连通容器(相当于三个相互连通的反应区)中，配制咖啡酸、阿魏酸、橙皮苷的混合标准溶液40mL(终浓度0.1mg/mL)，用蠕动泵将混合标准溶液泵入连通容器中，循环孵育一定时间，用PBS缓冲液清洗3次，每次的清洗液依次进液相分析，平行操作三份。将清洗液弃去，每个连通容器中加入乙腈的水溶液(其中含乙腈1mL，含水9mL)进行洗脱，洗脱液进行液相分析，平行操作三份。

分别使用不同pH(5.6，6.2，6.8，7.4，8.0)和不同离子强度的(10，50，100，200，300mmol/L)PBS缓冲液溶解咖啡酸、阿魏酸或橙皮苷，将混合液为孵育溶液进行孵育，进行清洗，对清洗液进行液相分析，平行操作三份。不同孵育时间(10，20，30，45，60min)和不同孵育温度(20，25，30，37，40，45℃)下孵育后，进行清洗，对洗脱液进行液相分析，平行操作三份。调控蠕动泵的转速(20，30，40，50，60r/min)，考察流速对配体结合的影响。

分别配制一系列的咖啡酸、阿魏酸、橙皮苷的混合标准溶液40mL(终浓度0.01，0.02，0.04，0.06，0.08，0.1mg/mL)，用蠕动泵将混合标准溶液泵入连通容器中，循环孵育一定时间，用PBS缓冲液清洗3次，每次的清洗液依次进液相分析，平行操作三份。将清洗液弃去，每个连通容器中加入10mL乙腈的水溶液(乙腈的体积百分数为10％)溶液进行洗脱，洗脱液进行液相分析，平行操作三份。结合率＝[DB]/[D]_TOT，其中[D]_TOT为加入标准品的浓度，[DB]为10％乙腈的水溶液洗脱后的洗脱液中标准品的浓度。

清洗次数的考察结果表明，经过三次的清洗，非特异性结合的化合物已经被清洗干净。

研究发现，麦芽糖酶键合的磁珠在不同浓度的PBS缓冲液(pH值7.4)下的zeta电位分别为-17.45mV(10mmol/L)、-13.83mV(100mmol/L)、-13.69mV(300mmol/L)。过高离子浓度的PBS缓冲液中和了麦芽糖酶或蔗糖酶键合的磁珠表面的电荷，导致咖啡酸和阿魏酸的结合效率显着下降，因此PBS缓冲液的离子浓度拟选10mmol/L。

温度对咖啡酸和阿魏酸的结合效率也会产生影响。研究发现，麦芽糖酶键合的磁珠或蔗糖酶键合的磁珠与咖啡酸和阿魏酸在37℃达到最大结合效率。

此外，对孵育时间也进行了优化，研究发现，经过30min的孵育，麦芽糖酶键合的磁珠或蔗糖酶键合的磁珠与咖啡酸和阿魏酸的结合效率达到最大值，继续增加孵育时间，结合效率反而有所下降，这说明孵育30min后，酶表面的结合位点已经达到饱和状态。

另外，考察了蠕动泵的转速对咖啡酸和阿魏酸的结合效率的影响。研究发现，蠕动泵的转速从20r/min提高到40r/min，咖啡酸和阿魏酸的结合效率逐渐升高，进一步增加转速至超过40r/min，结合效率又下降。

综上所述，优化后的条件如下：孵育温度37℃，孵育时间45min，孵育溶剂PBS缓冲液pH为6.8，离子强度为10mM，蠕动泵转速为40r/min。

三、三叶糖脂清中抗糖尿病活性化合物的筛选

称取0.4g的三叶糖脂清提取物，加入40mL PBS缓冲液(pH 6.8，离子强度10mmol/L)，超声10min溶解，作为待筛选溶液。

各取100μL麦芽糖酶键合的磁珠、蔗糖酶键合的磁珠、脂肪酶键合的磁珠，分别放入三个连通容器中，用蠕动泵将待筛选溶液泵入连通容器中，37℃下循环孵育30min，用PBS缓冲液清洗3次，每次的清洗液依次进液相分析。将清洗液弃去，每个连通容器中加入10％乙腈的水溶液(10mL)进行清洗，洗脱液进行液相色谱质谱联用分析。

图1中，(A)部分为麦芽糖酶磁珠洗脱物，洗脱物总共有6个峰，7个化合物，其中峰4包含两个化合物，磁珠洗脱物的多级质谱及紫外最大吸收波长见表1。这7个化合物分别为芍药苷(峰1)、2，3，4，6-四没食子酰葡萄糖(峰2)、1，2，3，4-四没食子酰葡萄糖(峰3)、槲皮素葡萄糖醛酸苷(峰4)、异槲皮苷(峰4)、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖(峰5)、丹酚酸B(峰6)。图1中，(B)部分为蔗糖酶磁珠洗脱物，洗脱物总共有有6个峰，7个化合物，其中峰4包含两个化合物。这7个化合物分别为2，3，4，6-四没食子酰葡萄糖(峰2)、1，2，3，4-四没食子酰葡萄糖(峰3)、槲皮素葡萄糖醛酸苷(峰4)、异槲皮苷(峰4)、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖(峰5)、丹酚酸B(峰6)、未知化合物(峰7)。图1中，(C)部分为脂肪酶磁珠洗脱物，洗脱物总共有有6个峰，7个化合物，其中峰4包含两个化合物。这7个化合物分别为2，3，4，6-四没食子酰葡萄糖(峰2)、1，2，3，4-四没食子酰葡萄糖(峰3)、槲皮素葡萄糖醛酸苷(峰4)、异槲皮苷(峰4)、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖(峰5)、丹酚酸B(峰6)、未知化合物(峰7)。

表1磁珠洗脱物的多级质谱及紫外最大吸收波长

使用传统的麦芽糖酶、蔗糖酶、脂肪酶抑制活性评价方法对结果进行了验证。如表2所示，2，3，4，6-四没食子酰葡萄糖、1，2，3，4-四没食子酰葡萄糖、1，2，3，4，6-五没食子酰葡萄糖为鞣质类化合物，其麦芽糖酶抑制活性比阳性药阿卡波糖好，蔗糖酶抑制活性比阳性药相当，脂肪酶抑制活性与阳性药奥利斯相当。槲皮素葡萄糖醛酸苷和异槲皮苷是黄酮苷类化合物，其麦芽糖酶抑制活性比阳性药好，其蔗糖酶抑制活性与阳性药差不多，也具有一定的甘油三酯酶抑制活性。芍药苷没有麦芽糖酶抑制活性，丹酚酸B没有麦芽糖酶、蔗糖酶、脂肪酶抑制活性。

表2化合物IC₅₀值

——表示没有抑制作用。

Claims (7)

1.一种筛选抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，包括：

(1)制备键合酶磁珠；

(2)利用至少两种键合酶磁珠对中药溶液或天然提取物溶液进行选择性吸附，不同种键合酶磁珠上所键合的靶标蛋白互异，所述的靶标蛋白为麦芽糖酶、蔗糖酶或脂肪酶；

(3)分离出所有键合酶磁珠共同吸附的化合物作为样本集；

(4)通过针对靶标蛋白的抑制活性实验在样本集中筛选所述的抗糖尿病活性化合物；

所述制备键合酶磁珠的过程为：将磁珠清洗干净，加入活化试剂活化磁珠表面，再次清洗，加入溶解的靶标蛋白，孵育，移去上清液，经缓冲液冲洗后再加入溶解了牛血清白蛋白的PBS溶液，移去上清液得到键合酶磁珠；

所述磁珠的清洗试剂为2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液，浓度为10～50mmol/L，pH为4～8；

所述磁珠的活化试剂为1-乙基-3-(3-二甲氨丙基)碳二亚胺盐酸盐溶液和N-羟基琥珀酰亚胺溶液，溶液浓度分别为10～80mg/mL，10～80mg/mL。

2.如权利要求1所述的筛选抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述的中药溶液的溶质为三叶糖脂清提取物。

3.如权利要求1所述的筛选抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述孵育的时间为1～5h，温度为0～25℃。

4.如权利要求1所述的筛选抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述靶标蛋白由25mmol/L、pH为6的2-(N-吗啡啉)乙磺酸的水溶液溶解，靶标蛋白的浓度为0.5～2mg/mL。

5.如权利要求1所述的筛选抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述中药溶液或天然提取物溶液的溶剂为PBS缓冲液，所述PBS缓冲液的离子强度为1～300mmol/L，pH为5.0～8.0。

6.如权利要求1所述的筛选抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，所述选择性吸附时，将中药溶液或天然提取物溶液置入一循环反应通道内，该循环反应通道内具有多个反应区，键合有不同靶标蛋白的键合酶磁珠处于各自对应的反应区内。

7.如权利要求6所述的筛选抗糖尿病活性化合物的方法，其特征在于，在所述的选择性吸附过程中，反应区内的键合酶磁珠浸没在反应通道内的中药溶液或天然提取物溶液中进行孵育，所述孵育的时间为10～60min，温度为20～50℃。