CN101382545A

CN101382545A - 一种评价中草药对dna氧化损伤保护作用的方法

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Publication number: CN101382545A
Application number: CNA2008101218516A
Authority: CN
Inventors: 储国海; 周国俊; 黄芳芳; 陈红君; 卢建忠
Original assignee: China Tobacco Zhejiang Industrial Co Ltd
Current assignee: China Tobacco Zhejiang Industrial Co Ltd
Priority date: 2008-10-30
Filing date: 2008-10-30
Publication date: 2009-03-11
Anticipated expiration: 2028-10-30
Also published as: CN101382545B

Abstract

本发明涉及一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法。一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，该方法包括以下的步骤：共价键固定DNA在磁珠微球表面；加入中草药溶液；体外染毒固定化的DNA；磁珠分离氧化组分，保留氧化损伤的DNA；加入8－OH－dG抗体，与氧化损伤产生的8－OH－dG发生免疫反应；加入酶标第二抗体，与上述得到的产物反应；加入发光底物，高灵敏度化学发光法检测DNA损伤产生的8－OH－dG；检测结果与对照组的检测结果进行分析，判断中草药是否具有抑制导致DNA氧化损伤产生8－OH－dG的功能。本发明可以检测评价中草药对DNA氧化损伤的保护作用，并可用来筛选研制高效安全的中草药制剂保护机体DNA免受氧化损伤。

Description

一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法

技术领域

本发明涉及一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法。

背景技术

自由基、活性氧(ROS)、X射线、γ射线、石棉、多环芳烃类物质等物质经过不同途径可攻击DNA，形成共价的DNA加合物，引起DNA碱基错配，DNA单链或双链断裂，导致DNA损伤，最终导致癌变(Poulsen，HE.，Oxidative DNAmodifications，Exp.Toxicol.Pathol.，2005，57，161-169.)。DNA损伤与癌症、阿尔茨海默氏症和正常衰老过程等人类一切变化均有关联，DNA氧化损伤产物是指由ROS损伤DNA而产生的DNA加合物。在现已发现的二十几种DNA氧化损伤产物中，鸟嘌呤由于拥有的分子轨道具有较高的能级，因此最容易被氧化损伤，生成化学性质比较稳定的修饰核苷8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxydeoxyguanosine，8-OH-dG)。在复制过程中，DNA链上8-OH-dG可以与C以外的其它碱基配对形成点突变，被认为是氧化应激因素致癌、致突变的主要机理之一。(徐永俊，徐顺清，DNA氧化损伤生物标志物8-OH-dG的检测及其在医学中的应用，癌变畸变突变，2002，14，50-53)、(王云南，吕嘉春，曾波航等，8-羟基-脱氧鸟苷在肺癌发生和人支气管上皮细胞癌变过程中的作用中的作用，中国综合临床，2004，20，100-103。)。

由于8-OH-dG在体内能稳定存在，一旦形成不再被机体进一步代谢；而且8-OH-dG不能由细胞内外的dG通过非DNA氧化途径形成，组织细胞核DNA及线粒体DNA中8-OH-dG，可反应体内DNA氧化损伤。因此，8-OH-dG可以作为反映内源及外源因素对DNA氧化损伤的灵敏和稳定的生物标记物，能够用来估计癌症等多种疾病发生的危险性。在体内/外实验中，通过检测有害物质处理后的细胞或动物组织的8-OH-dG水平，可以评价这些物质的致癌性。对人体组织的研究也提示，分析人体白细胞、器官组织和尿液等标本的8-OH-dG水平可以评价个体肿瘤发生的危险性和研究与氧自由基有关的疾病。

中草药是我国的传统药物，在我国经过上千年的实践应用，有其天然性、多功能性、无毒副作用、无药残、无抗药性的独特优势，特别是很多中草药提取物在抗氧化、清除自由基保护机体免受伤害等方面具有重要作用。它对许多疾病有良好的疗效，对许多疑难杂症的治疗效果远远好于西药，成为了新的研究热点。中草药对DNA的氧化损伤的保护作用已经引起了研究人员的日益关注，如：潘洪志等人发现番茄红素能抑制肝细胞中DNA的氧化损伤；赵刚等人发现左归丸能下调大脑皮质老化过程中的8-OH-dG；Lee等人发现绿茶能阻断香烟诱发的外周血淋巴细胞姐妹染色单体互换，保护吸烟诱发DNA损伤。但是，刘斌等人发现关木通两种提取液均能直接导致中国仓鼠肺成纤维细胞中的DNA氧化损伤。因此不同的中草药在氧化剂对DNA的损伤作用中是起保护作用还是促进损伤，需要进一步研究。所以开发一种能检测中草药对DNA氧化损伤的保护作用的方法，对开发和利用高效安全的中草药制剂具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是建立一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法。该方法可以检测评价中草药对DNA氧化损伤的保护作用，并可用来筛选研制高效安全的中草药制剂保护机体DNA免受氧化损伤。

为了实现上述目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，该方法包括以下的步骤：

①共价键固定DNA在磁珠微球表面；

②加入中草药溶液；

③体外染毒固定化的DNA；

④磁珠分离氧化组分，保留氧化损伤的DNA；

⑤加入8-OH-dG抗体，与氧化损伤产生的8-OH-dG发生免疫反应；

⑥加入酶标第二抗体，与上述得到的产物反应；

⑦加入发光底物，高灵敏度化学发光法检测DNA损伤产生的8-OH-dG；

⑧检测结果与对照组的检测结果进行分析，判断中草药是否具有抑制导致

DNA氧化损伤产生8-OH-dG的功能。

作为优选，上述的步骤③体外染毒固定化的DNA采用Fenton型产羟自由基系统、X射线、γ射线、卷烟烟气、卷烟焦油、卷烟烟气中的多环芳烃、烟草咀嚼残渣、石棉、氧化不饱和脂肪酸、柴油废气颗粒、化学致癌物、黄曲酶毒素B1或N-亚硝基-乙胺。

作为再优选，上述的步骤③体外染毒固定化的DNA采用Fenton型羟基自由基系统，其中Fe²⁺的浓度为0.1～0.5mM，H₂O₂的浓度为0.01～0.6M。

作为再优选，上述的步骤③体外染毒固定化的DNA采用烟气吸收液，烟气吸收液的制备方法为烟气通过滤片后气相部分用磷酸盐缓冲液-吐温溶液吸收；粒相物收集到滤片，然后将收集粒相物的滤片放入磷酸盐缓冲液-吐温溶液中，超声，离心，取上清液后待用。

作为优选，上述的步骤①为取羧基修饰的磁珠用咪唑缓冲液洗涤，磁座分离，吸去上清液；将洗涤后的羧基修饰的磁珠分散在溶有EDC的咪唑溶液中，于恒温振荡器中；反应后，将反应混合物平分于离心管中；然后在离心管中加入DNA，在恒温振荡器中反应；取出用洗涤液和水各洗一次后，每管加入封闭液I，恒温振荡器中反应；取出洗涤。

作为优选，上述的步骤②的中草药溶液的制备方法是先将中草药配成10^-2M的DMSO溶液，再根据需要用磷酸盐缓冲溶液或0.04％的HCl水溶液稀释。

作为优选，上述的8-OH-dG抗体为羊抗8-OH-dG，酶标第二抗体为HRP标记兔抗羊IgG。羊抗8-OH-dG先与磁珠表面DNA氧化损伤产生的标志物8-OH-dG特异性结合，然后磁珠表面结合的羊抗8-OH-dG与HRP标记的兔抗羊IgG特异性结合进行第二步免疫反应，通过HRP催化的鲁米诺与过氧化氢反应产生的发光信号强度表征结合在磁珠表面HRP的量，间接检测与HRP间接相连的DNA氧化损伤产生的标志物8-OH-dG。

作为优选，上述的步骤⑤加入羊抗8-OH-dG的PBS溶液，恒温振荡器中反应；步骤⑥为洗涤液洗涤，再加入HRP标记兔抗羊IgG的PBS溶液，同样于恒温振荡器中反应，洗涤液洗涤。

作为优选，上述的羊抗8-OH-dG的稀释倍数为75000～150000倍。HRP标记兔抗羊IgG的稀释倍数为10000～40000倍。

本发明由于采用了上述的技术方案，可以检测氧化剂对DNA的损伤，并研究了损伤产生8-OH-dG的信号与氧化剂量的关系。该方法可以检测评价中草药对DNA氧化损伤的保护作用，并可用来筛选研制高效安全的中草药制剂保护机体DNA免受氧化损伤。

附图说明

图1为本发明的原理图。

图2为羊抗8-OH-dG稀释度对检测信号强度的影响图表。

图3为不同Fe²⁺的浓度对化学发光强度的影响图表。

图4为槲皮素和丹参酮对Fenton试剂引起DNA损伤的影响图表。

具体实施方式

实施例1 Fenton试剂导致DNA氧化损伤的测定

一、试剂与仪器：

所有试剂均为分析纯，实验用水为去离子超纯水。pH6.0的咪唑缓冲液；0.1M的PBS，pH＝7.2-7.4；洗涤液为含有0.1％的吐温20的PBS；封闭液I为40mM甘氨酸，1％BSA的咪唑缓冲液；封闭液II为10％BSA的PBS。

N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC)购于Sigma公司；HRP标记兔抗羊IgG购于北京博奥森生物技术有限公司；羊抗8-OH-dG购于abcam公司；HRP化学发光试剂盒购于Milipore公司；羧基修饰的磁性微球(1.5μm，BangsLaboratories，Inc.)；DNA(5’-GCC AAC AGC CAG TGG GAA ACA AAA AAAAAA-NH₂-3’)，由上海英骏生物技术公司合成。氧化剂：FeCl₂水溶液(含有0.04％的HCl防水解)，30％的H₂O₂溶液用前稀释；

BPCL微弱发光测量仪(中国科学院生物物理研究所)；HZ-9211K恒温振荡器(太仓市科教器材厂)。

二、检测的方法：

1、中草药溶液的制备方法

先将中草药配成10^-2M的DMSO溶液，再根据需要用磷酸盐缓冲溶液或0.04％的HCl水溶液稀释，以减低DMSO对DNA的影响。

2、反应体系及方法

将羧基修饰的磁珠用咪唑缓冲液洗涤，磁座分离，吸去上清液，如此重复三次。将其分散在溶有EDC的咪唑溶液中，于37℃的恒温振荡器中。反应20min后，将反应混合物平分于12个离心管中，每管中加入1pmol的DNA，在37℃恒温振荡器中反应60min。取出用洗涤液和水各洗一次后，每管加入100μL封闭液I，于恒温振荡器中反应60min。取出用洗涤液和水各洗涤一次；按实验目的在样品中加入相应的中草药溶液及氧化剂，对照组只加入氧化剂，Fenton试剂氧化60min。氧化后的样品用PBS洗涤三次后，用封闭液II封闭60min，磁座分离，吸出上清液，加入抗8-OH-dG的PBS溶液(含2％BSA)，37℃恒温振荡器中反应60min。洗涤液洗涤，再加入HRP标记兔抗羊IgG的PBS溶液(含2％BSA)，同样于37℃恒温振荡器中反应60min，洗涤液洗涤三次。用HRP化学发光试剂盒于化学发光仪检测，发光信号由相连的工作站显示并记录。

实施例2 羊抗8-OH-dG稀释度的选择

由于实验中所用的羊抗8-OH-dG活性较强，对检测信号影响较大，故需要选择合适的稀释浓度以得到最优化的信噪比，图2显示了不同稀释度对检测信号强度的影响。实验条件为：Fe²⁺浓度为0.288mM，H₂O₂为0.12M，HRP标记兔抗羊IgG的稀释度为1/20000。如图4可知：随着羊抗8-OH-dG稀释度的增大，检测信号呈现先增大后减小的趋势，并在稀释100000倍附近达到最大值。稀释度太大，浓度过大，使对照组的抗体在磁珠上的非特异性吸附的几率增大；稀释浓度过小，浓度过小，使抗体相对氧化产生8-OH-dG量太少，不足以检测。因此，本发明羊抗8-OH-dG的最佳稀释倍数为100000。

实施例3 不同Fe²⁺的浓度对化学发光强度的影响

可以产生羟基自由基的Fenton试剂(即Fe²⁺介导的H₂O₂)是比较经典的DNA损伤氧化剂，其中Fe²⁺的浓度对产生8-OH-dG的量的影响显著，图3显示了不同Fe²⁺的浓度对发光强度的影响，由图可知，随着Fe²⁺的浓度的增大，产生8-OH-dG的量也随之增大，随后出现下降，可能是过量的氧化剂会导致DNA链断裂，从而使产生8-OH-dG的量下降，我们的检测方法对此种影响的研究也显示了与文献相似的结果。实验中I代表HRP标记兔抗羊IgG稀释20000倍，II代表其稀释40000倍；a代表羊抗8-OH-dG稀释100000倍，b代表其稀释250000倍。从图中看出，I+a的结合方法对测定8-OH-dG是最有利的，故后面研究都选用I+a组合。

实施例4 中草药对DNA氧化损伤的保护作用研究

分别考察了几种中草药对Fenton试剂引起DNA氧化损伤的影响。以槲皮素和丹参酮为例(如图4)，对照组中没有添加中药，只用Fenton试剂氧化，Fe²⁺浓度为0.288mM，H₂O₂的浓度为0.12M；中药组在加入Fenton之前加入中药，其终浓度均为10^-4M。由图4可以看出，加入槲皮素或丹参酮的DNA反应组，产生的8-OH-dG均比相应未加中药的少，说明这两种中药对Fenton试剂引起的DNA氧化损伤有较好的保护作用。

Claims

1.一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，其特征在于该方法包括以下的步骤：

①共价键固定DNA在磁珠微球表面；

②加入中草药溶液；

③体外染毒固定化的DNA；

④磁珠分离氧化组分，保留氧化损伤的DNA；

⑤加入8-OH-dG抗体，与氧化损伤产生的8-OH-dG发生免疫反应；

⑥加入酶标第二抗体，与上述得到的产物反应；

⑧检测结果与对照组的检测结果进行分析，判断中草药是否具有抑制DNA氧化损伤产生8-OH-dG的功能。

2.根据权利要求1所述的一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，其特征在于：步骤③体外染毒固定化的DNA采用Fenton型羟基自由基系统、X射线、γ射线、卷烟烟气、卷烟焦油、卷烟烟气中的多环芳烃、烟草咀嚼残渣、石棉、氧化不饱和脂肪酸、柴油废气颗粒、化学致癌物、黄曲酶毒素B1或N-亚硝基-乙胺。

3.根据权利要求2所述的一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，其特征在于：步骤③体外染毒固定化的DNA采用Fenton型产羟自由基系统，其中Fe²⁺的浓度为0.1～0.5mM，H₂O₂的浓度为0.01～0.6M。

4.根据权利要求2所述的一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，其特征在于：步骤③体外染毒固定化的DNA采用烟气或烟气吸收液，烟气吸收液的制备方法为烟气通过滤片后气相部分用磷酸盐缓冲液-吐温溶液吸收；粒相物收集到滤片，然后将收集粒相物的滤片放入磷酸盐缓冲液-吐温溶液中，超声，离心，取上清液后待用。

5.根据权利要求1～4任意一项权利要求所述的一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，其特征在于：步骤①为取羧基修饰的磁珠用咪唑缓冲液洗涤，磁座分离，吸去上清液；将洗涤后的羧基修饰的磁珠分散在溶有EDC的咪唑溶液中，于恒温振荡器中；反应后，将反应混合物平分于离心管中；然后在离心管中加入DNA，在恒温振荡器中反应；取出用洗涤液和水各洗一次后，每管加入封闭液I，恒温振荡器中反应；取出洗涤。

6.根据权利要求1～5任意一项权利要求所述的一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，其特征在于：步骤②的中草药溶液的制备方法是先将中草药配成10^-2的DMSO溶液，再根据需要用磷酸盐缓冲液或0.04％的HCl水溶液稀释。

7.根据权利要求1～5任意一项权利要求所述的一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，其特征在于：8-OH-dG抗体为羊抗8-OH-dG，酶标第二抗体为HRP标记兔抗羊IgG。

8.根据权利要求7所述的一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，其特征在于：步骤⑤加入羊抗8-OH-dG的PBS溶液，恒温振荡器中反应；步骤⑥为洗涤液洗涤，再加入HRP标记兔抗羊IgG的PBS溶液，同样于恒温振荡器中反应，洗涤液洗涤。

9.根据权利要求8所述的一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，其特征在于：羊抗8-OH-dG的稀释倍数为75000～150000倍。

10.根据权利要求8所述的一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，其特征在于：HRP标记兔抗羊IgG的稀释倍数为10000～40000倍。