CN104535762B - 高效筛选dna断链损伤保护性药物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：将一端用荧光素FAM修饰另一端用氨基修饰的DNA通过共价键与磁性微球表面固定，得到固定化DNA；向固定化DNA中加入药物的溶液，得到具有药物的DNA；将具有药物的DNA进行体外染毒，得到染毒DNA；将染毒DNA进行磁性分离，分离掉染毒成分和反应杂质，保留未断链DNA；向未断链DNA中加入酶标FAM抗体，酶标FAM抗体与未断链DNA自由端的FAM发生免疫反应，得到免疫反应后的DNA；向免疫反应后的DNA中加入发光底物后，采用高灵敏度化学发光法检测免疫反应后的DNA，得到检测信号；将检测信号与对照组信号进行对比，判断药物是否保护DNA。采用本发明方法可以降低假阳性出现，十分具有实用价值。

Description

高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法
技术领域
本发明涉及药学方法领域，特别涉及药物筛选，具体是指一种高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法。
背景技术
随着生命科学的迅速发展，人们不仅关注一些常见疾病的治疗，更开始挖掘遗传疾病和衰老的秘密，期待从根本上排除隐患，抵抗衰老。DNA作为携带及传递遗传信息的重要生物分子，其完整性的保持成为生物科学的重点研究领域，各种评价DNA损伤的技术不断进化，寻找高效安全的DNA保护性药物的报道也日益增多。
传统的DNA评价技术如放射元素标记法，高效液相色谱-电化学测量法，气质联用法或高效毛细管电泳法等虽然灵敏度高，但是都存在仪器大型贵重，且需要专业人员护理以及操作过程繁琐的特点；早期被用来定量检测细胞内DNA单链断裂的快速沉降技术、碱性解旋和洗脱技术也因为检测灵敏度低、安全性差和实验周期长等原因难用于高效筛选DNA保护性药物；传统的DNA保护药物的研究往往是在活体或细胞水平上，实验周期较长、对实验设备有较高要求，体外的研究排除杂质对检测的干扰并不简便，因此每项研究一般只能考察少数几种药物的效果。
现有专利中存在一种评价中草药对DNA氧化损伤保护作用的方法，该方法如图1、2所示以鸟嘌呤被氧化后产生的8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-deoxyguanosine,8-OH-dG)为DNA氧化损伤标志物评价药物保护作用，主要包括以下的步骤:1.共价键固定DNA在磁性微球表面；2.加入中草药溶液；体外染毒固定化的DNA；3.磁性分离氧化组分，保留氧化损伤的DNA；4.加入8-OH-dG抗体，与氧化损伤产生的8-OH-dG发生免疫反应；5.加入酶标第二抗体，与上述得到的产物反应；6.加入发光底物，高灵敏度化学发光法检测DNA损伤产生的8-OH-dG；7.检测结果与对照组的检测结果进行分析，若信号较对照组低则认为中草药具有抑制8-OH-dG产生的功能。其工作原理如图1所示：
由于此技术是以DNA的一种碱基损伤作为检测指标的，故存在以下不足：第一点，据文献报道DNA受到氧自由基攻击不仅产生包括8-OH-dG在内的碱基损伤，其链状结构也会发生断裂，即断链损伤。这即意味着在上述技术体系中实际是存在如下图所示的反应情况的，图中所示的两种情况实际产生的8-OH-dG是同样多的，但由于同时发生了DNA断链，而照上述技术第3步，洗涤磁性微球将保留的待检测8-OH-dG与中草药等杂质分离，同时也与已断下来的部分DNA链分离，产生的8-OH-dG不确定是集中在断掉部分还是保留部分，于是即使是DNA上产生同样多的8-OHdG，检测到的信号却可能相差很大，图1中添加的中草药实际没有抑制8-OH-dG的作用，信号却显示比对照组低很多，于是容易产生“假阳性”的结果。第二点，此技术对DNA损伤的检测需要两步免疫反应，不够简便。
所以一种降低假阳性结果的发生率的，简便灵敏高效的筛选DNA断链损伤保护性药物的方法是十分具有实用价值的。
发明内容
本发明的目的是为了克服上述现有技术中的缺点，提供了一种可以降低假阳性结果的发生率的，简便灵敏高效的筛选DNA断链损伤保护性药物的方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将一端用荧光素FAM修饰另一端用氨基修饰的DNA通过共价键与磁性微球表面固定，得到固定化DNA；
步骤(2)：向所述的固定化DNA中加入药物的溶液，得到具有药物的DNA；
步骤(3)：将所述的具有药物的DNA进行体外染毒，得到染毒DNA；
步骤(4)：将所述的染毒DNA进行磁性分离，分离掉染毒成分和反应杂质，保留未断链DNA；
步骤(5)：向所述的未断链DNA中加入酶标FAM抗体，所述的酶标FAM抗体与未断链DNA自由端的FAM发生免疫反应，得到免疫反应后的DNA；
步骤(6)：向所述的免疫反应后的DNA中加入发光底物后，采用高灵敏度化学发光法检测所述的免疫反应后的DNA，得到检测信号；
步骤(7)：将所述的检测信号与对照组信号进行对比，判断所述的药物是否保护DNA。
较佳地，所述的步骤(1)具体包括以下步骤：
步骤(1.1)：将磁性微球采用羧基修饰，取羧基修饰后的磁性微球用咪唑缓冲液磁性分离法洗涤3次后，分散在溶有EDC的咪唑缓冲液中，37℃恒温振荡20min，得到带有磁性微球的溶液；
步骤(1.2)：向所述的带有磁性微球的溶液中加入一端用荧光素FAM修饰另一端用氨基修饰的DNA，继续37℃恒温振荡60min后得到固定化DNA，用洗涤液洗涤三次后使所述的固定化DNA分散在洗涤液中。每个筛选样品占用羧基磁性微球的用量为100ug，FAM-DNA的投料量为1.25-20pmol。
较佳地，所述的药物溶液通过浓度为1mg/ml的药物储备液采用含有0.1％吐温的PBS反应液溶液稀释20倍后得到。
较佳地，所述的体外染毒通过采用Fenton型产羟自由基体系、黄嘌呤/黄嘌呤酶产超氧阴离子体系、次氯酸钠/过氧化氢产单线态氧体系、体外模拟吸烟、石棉、氧化不饱和脂肪酸、PM2.5、化学致癌物或N-亚硝基-乙胺进行。
更佳地，当体外染毒通过采用所述的Fenton型产羟自由基体系时，Fe2+的浓度为0.225～1.8mM,Fe2+/EDTA/H2O2的摩尔比为1:3:60。
更佳地，当体外染毒通过采用体外模拟吸烟时，为将含有所述的具有药物的DNA的气体捕集器与自动吸烟机的烟道串联，所述的自动吸烟机按联邦贸易委员会协议标准吸烟。吸烟主流烟雾即通过气体捕集器扩散入捕集液(即固定化DNA分散液，含有0.5％吐温的PBS)中，使得寿命更短的ROS也被捕获。
较佳地，所述的步骤(4)中，磁性分离掉染毒成分和反应杂质后，在未断链DNA中加入0.02％BSA封闭液封闭，所述的封闭液用PBS配置。
较佳地，所述的酶标FAM抗体为HRP标记的兔抗体。
更佳地，所述的HRP标记的兔抗体的稀释倍数为10000倍。
较佳地，所述的步骤5具体包括以下步骤：
步骤(5.1)：向所述的未断链DNA中加入酶标FAM抗体后在37℃时置于恒温振荡器中反应，反应后使用洗涤液洗涤。恒温振荡器中反应与FAM-DNA特异性结合，通过HRR催化的鲁米诺与过氧化氢反应产生的发光信号强度表征结合在磁性微球表面未断链的FAM-DNA的量，间接检测DNA断链的量。
采用了本发明的高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，将DNA保护性药物的筛选过程大大简化，并可应用于复杂化合物的筛选，意味着可以从我国丰富的药物来源如中草药、植物提取物等资源中筛选高效安全的药物制剂。技术的实施对环境污染物的遗传毒性评价、新药研发以及遗传疾病的早期诊治提供有力支撑。
附图说明
图1是现有发明的检测流程图。
图2是现有发明的检测原理图。
图3是本发明的实施例的检测原理图。
图4是本发明的实施例的DNA投料量对表征未断链DNA的化学发光强度的影响图表。
图5为本发明的实施例的Fenton试剂的浓度对表征未断链DNA的化学发光强度的影响图表。
图6为本发明的实施例的10种药物筛选例图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，下面结合附图对本发明的具体实施方法作进一步说明。
实施例1 Fenton试剂致DNA断链损伤的检测
1.1试剂与仪器
所有试剂均为分析纯。N-(3-二甲基氨丙基)-N’-乙基-碳二亚胺盐酸盐(EDC)购于Sigma公司；HRP标记的兔抗FAM来自Invitrogen.Molecular probe；HRP CL试剂盒购自Milipore公司；Plus羧基化磁性微球(MB，1.5μm，20mg/mL)购于Polyscience公司；BSA购自华美生物技术公司；DNA(5′-FAM-AAAGGGGAAA-NH2-3′)购自上海生工生物技术有限公司；Fenton试剂：(NH4)2Fe(SO4)2与EDTA每日按1:3摩尔比配成新鲜水溶液原液，用前稀释，30％的H2O2溶液储存于冰箱冷藏层避光，用前稀释。
试验用超纯水由Milli-XQ仪器制备，所有溶液由超纯水配制。0.1M的咪唑缓冲液，pH6.0；0.1M的PBS溶液，pH7.4；洗涤液的为含有0.1％吐温20的PBS，也用于DNA染毒及药物筛选步骤；封闭液为含0.02％BSA的PBS。
CL信号通过计算机控制的化学发光荧光扫描系统(Thermo Electron Corporation)测量；HZ-92llK恒温振荡器(太仓市科教器材厂)
1.2检测的方法
1.固定化DNA的制作
每孔100ug的羧基修饰磁性微球分别用咪唑缓冲液磁性洗涤3次后，加入溶解有1mg EDC的50μL咪唑缓冲液，于37℃摇床中振荡20min保证磁性微球表面的羧基充分活化，加入10pmol氨基修饰的FAM-DNA，37℃反应1h，DNA结合效率通过测量FAM-DNA样品结合前后的荧光强度来计算，DNA固定好后用洗涤液洗涤3次，终端标有荧光探针的固定化DNA(微球表面排布有DNA分子)制作完毕，置于洗涤液，4℃保存。
2.筛选药物的制备
化合物为分析纯；天然化合物为标准物质(纯度>98％)；提取药物为植物的功能组织用75％乙醇提取后真空旋转蒸发后的浸膏。用前先用超纯水将要筛药物配成1mg/mL的水溶液，筛选时按终浓度50ug/mL加入到PBS-0.1％吐温反应液中。
3.DNA染毒及药物筛选步骤
制作好的固定化DNA样品主要分为有Fenton试剂组即阳性对照组和药物添加组；为量化药物对DNA的保护作用，还设置了无Fenton试剂组即阴性对照组；为考察经典自由基清除剂DMSO的影响，实验还设置了0.1％DMSO添加组；各组平行加料，无料添加的用空白溶液补齐至相同反应体积，在37℃摇床中平行反应60min后，洗涤液平行洗涤3次。用封闭液封闭60min，磁性分离上清液，加入HRP标记的兔抗FAM特异性识别保留在磁性微球上的未断链DNA，用HRP CL试剂盒检测，化学发光扫描仪记录信号。
实施例2 DNA投料量的选择
DNA投料量决定了固定在磁性微球上的DNA的密度以及后续断链反应的几率，故需要考察DNA投料量对于检测信号的影响，以便在节约成本的前提下选择合适的DNA投料量。图2显示了DNA投料量对阴性对照及阳性对照检测信号
强度的影响。实验条件为:Fe2+浓度为0.9Mm，H2O2为54mM，HRP标记兔抗
FAM抗体的稀释度为1/10000。如图2可知：随着DNA投料量逐步加大，阴性对照与阳性对照的信号均逐步增强后趋于饱和两者差值表征的DNA断链程度也呈现相似趋势，本发明选择了10pmol/孔的最佳投料量。
实施例3 Fenton试剂的浓度对化学发光强度的影响
可以产生羟基自由基的Fenton试剂(即Fe2+介导的H2O2反应:)是比较经典的可致DNA断链损伤的染毒体系。本发明采用的Fenton反应体系：(NH4)2Fe(SO4)2/EDTA/H2O2的摩尔比为1:3:60。其中(NH4)2Fe(SO4)2与EDTA一起配置，可显著降低Fe2+在溶液中自氧化的速度，提高与H2O2接触后DNA染毒步骤的反应效率。图3显示了Fenton试剂浓度对染毒后产生的化学发光信号的影响。随着Fenton试剂浓度的增大，固定化DNA断链逐渐增多，导致化学发光酶联免疫反应检测到保留在磁性微球上未断链的DNA的信号逐渐减少，至Fe2+的浓度为0.9mM时趋于饱和，断链趋于最大程度。后续试验采用的Fenton试剂浓度为(NH4)2Fe(SO4)20.9mM，EDTA为2.7mM，H2O2为54mM。
实施例4 DNA断链保护性药物的筛选
平行考察了50种药物对Fenton试剂引起DNA断链损伤的影响，以图4所示的
10种药物为例，与被Fenton试剂染毒的阳性对照组相比，10种药物添加组呈现的DNA未断链的信号明显增强。其中0.1％DMSO的添加组完全保护了DNA断链，使得信号远高于阳性对照而与未添加Fenton试剂的阴性对照信号相平，再次验证了DMSO为优良的自由基清除剂，因此本发明不使用DMSO配置药物溶液以防掩盖待筛药物的作用，带来”假阳性”结果。其余9种药物即使50ug/mL的浓度也显示了良好的对DNA断链损伤的抑制作用。根据信号强度对于DNA的保护作用可以定量为
(CL药物–CL阳性对照)/(CL阴性对照–CL阳性对照)×100％
由此算的图中10种药物添加对DNA断链的保护程度如表1所示
表1
本发明除具有三方面改进：第一，虽然都结合了磁性分离与酶联免疫化学发光技术，但评价的DNA损伤指标不同，现有技术采用的是DNA的一种碱基损伤8-OH-dG,，本发明评价的是DNA的另一项重要损伤-DNA断链；第二，由于DNA染毒过程中两种损伤均会发生，相似技术难于检测断链后脱离磁性微球的那部分DNA上8-OH-dG损伤，这样筛选药物容易出现“假阳性”结果。而对于本发明检测的断链损伤，由于固定化DNA的量是一定的，染毒后可通过直接检测断掉后剩余DNA的信号推知断链信号，故此法用于筛选药物可显著降低“假阳性”结果的发生率；第三，相似技术检测损伤采用两步免疫反应，而本发明只需一步，实际操作还减少了一步封闭反应，每批次筛选时间至少节省2h，显著提高了药物筛选的效率。
采用本发明，能够将DNA保护性药物的筛选过程大大简化，并可应用于复杂化合物的筛选，意味着可以从我国丰富的药物来源如中草药、植物提取物等资源中筛选高效安全的药物制剂。技术的实施对环境污染物的遗传毒性评价、新药研发以及遗传疾病的早期诊治提供有力支撑。

Claims (10)

1.一种高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：将一端用荧光素FAM修饰另一端用氨基修饰的DNA通过共价键与磁性微球表面固定，得到固定化DNA；
步骤(2)：向所述的固定化DNA中加入药物的溶液，得到具有药物的DNA；
步骤(3)：将所述的具有药物的DNA进行体外染毒，得到染毒DNA；
步骤(4)：将所述的染毒DNA进行磁性分离，分离掉染毒成分和反应杂质，保留未断链DNA；
步骤(5)：向所述的未断链DNA中加入酶标FAM抗体，所述的酶标FAM抗体与未断链DNA自由端的FAM发生免疫反应，得到免疫反应后的DNA；
步骤(6)：向所述的免疫反应后的DNA中加入发光底物后，采用高灵敏度化学发光法检测所述的免疫反应后的DNA，得到检测信号；
步骤(7)：将所述的检测信号与对照组信号进行对比，判断所述的药物是否保护DNA。
2.根据权利要求1所述的高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，所述的步骤(1)具体包括以下步骤：
步骤(1.1)：将磁性微球采用羧基修饰，取羧基修饰后的磁性微球用咪唑缓冲液磁性分离法洗涤3次后，分散在溶有EDC的咪唑缓冲液中，37℃恒温振荡20min，得到带有磁性微球的溶液；
步骤(1.2)：向所述的带有磁性微球的溶液中加入一端用荧光素FAM修饰另一端用氨基修饰的DNA，继续37℃恒温振荡60min后得到固定化DNA，用洗涤液洗涤三次后使所述的固定化DNA分散在洗涤液中。
3.根据权利要求1所述的高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，所述的药物溶液通过浓度为1mg/ml的药物储备液采用含有0.1％吐温的PBS反应液溶液稀释后得到。
4.根据权利要求1所述的高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，所述的体外染毒通过采用Fenton型产羟自由基体系、黄嘌呤/黄嘌呤酶产超氧阴离子体系、次氯酸钠/过氧化氢产单线态氧体系、体外模拟吸烟、石棉、氧化不饱和脂肪酸、PM2.5、化学致癌物或N-亚硝基-乙胺进行。
5.根据权利要求4所述的高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，当 体外染毒通过采用所述的Fenton型产羟自由基体系时，Fe2+的浓度为0.225～1.8mM,Fe2+/EDTA/H2O2的摩尔比为1:3:60。
6.根据权利要求4所述的高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，当体外染毒通过采用体外模拟吸烟时，为将含有所述的具有药物的DNA的气体捕集器与自动吸烟机的烟道串联，所述的自动吸烟机按联邦贸易委员会协议标准吸烟。
7.根据权利要求1所述的高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中，磁性分离掉染毒成分和反应杂质后，在未断链DNA中加入0.02％BSA封闭液封闭，所述的封闭液用PBS配置。
8.根据权利要求1所述的高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，所述的酶标FAM抗体为HRP标记的兔抗体。
9.根据权利要求8所述的高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，所述的HRP标记的兔抗体的稀释倍数为10000倍。
10.根据权利要求1所述的高效筛选DNA断链损伤保护性药物的方法，其特征在于，所述的步骤（5）具体包括以下步骤：
步骤(5.1)：向所述的未断链DNA中加入酶标FAM抗体后在37℃时置于恒温振荡器中反应，反应后使用洗涤液洗涤。
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Application publication date: 20160817

Assignee: Shanghai Ruifengda Medical Technology Co., Ltd.

Assignor: Shanghai Yangpu Central Hospital

Contract record no.: 2019980000035

Denomination of invention: Method for efficiently screening out DNA chain scission injury protective drugs

Granted publication date: 20160817

License type: Exclusive License

Record date: 20190722