CN107064390A - 一种巧克力中过敏原的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种巧克力中过敏原的检测方法，包括如下步骤：S1)先对巧克力基质中的糖类和酚类进行吸附，达到巧克力中过敏蛋白质的快速纯化；S2)建立多种过敏原同时检测的色谱质谱方法；S3)建立蛋白质数据库，收集不同来源样品的定性定量数据，并获得统计结果；所述步骤S1)在磁性颗粒外键合苯硼酸基基团，实现对糖类和酚类物质的吸附；步骤S2)结合静电场轨道阱高分辨质谱和串联四级杆质谱系统，建立多种过敏原同时检测的色谱质谱方法；所述多种过敏原包括牛奶，大豆，花生，榛子，核桃，杏仁，腰果和开心果。本发明能够对巧克力基质中的过敏原蛋白质进行快速纯化，从而实现高灵敏度，高通量的巧克力中多种过敏原的快速筛选检测。

Description

一种巧克力中过敏原的检测方法

技术领域

本发明涉及一种食品中过敏原的检测方法，尤其涉及一种巧克力中过敏原的检测方法。

背景技术

食品过敏原是指食品中存在的能够选择性地激活人体细胞，诱导产生特异性抗体应答，引起变态反应的抗原性物质。一般来说，食品过敏原为分子量介于10000～70000之间的蛋白或糖蛋白。常见的致敏食品有奶类、豆类、蛋类、谷类、树果类、贝类等。在世界卫生组织报告指出威胁人类健康的因素中，食物过敏排在第4位。在近年来国内外食品有关的警示通报中，过敏原问题数量排名第2，仅次于微生物污染，成为国际普遍关注的行业热点。食品过敏原问题在不同国家和地区有着各不相同的理解和关注程度。国外发达国家对食品过敏原已经有着诸多的报道和研究，甚至有较具体的立法。如欧盟2003/89/EC指令对食品生产和经销者进行监管，欧盟2006/142/EC指令则列出了14种必须明确标注的食品过敏原。美国《2004年食物致敏原标签和消费者保护法》将牛奶、鸡蛋、鱼类、甲壳贝类动物、坚果、小麦、花生和大豆列为需要强制性标识的主要致敏原。

与发达国家相比,我国对食品过敏原的研究和关注水平存在较大差距，食品过敏原问题也是目前我国食品出口企业被外方通报的最主要问题。目前，我国食品中过敏原标识的管理还处于起步阶段，最早与食品中过敏原标识相关的管理标准为2008年北京奥运会期间颁布的《奥运会食品安全食品过敏原标识标注》，并于奥运会结束后废止。2009年，我国为加强食品中过敏原的管理，颁布了推荐性的国家标准GB，T23779-2009《预包装食品中的过敏原成分》，该标准对过敏原进行了定义，并列举了8类推荐性标识的食物过敏原障。2012年，GB7718-2011《预包装食品标签通则》的颁布首次正式将食品中过敏原的标识问题纳入标签管理的范畴，但对于过敏原的标识方式仍未给出具体的规定，消费者对由此引发的过敏反应也没有引起足够的关注。随着国家对食品安全工作的深入开展以及促进进出口食品贸易的发展，完善食品过敏原的标识管理的重要性日益凸显。

食品过敏原的标识管理，只有在具备了完善的监控技术手段后才可能真正实施。目前广泛使用的食品过敏原分析方法主要有酶联免疫法(ELISA)、聚合酶链法(PCR)和质谱法(MS)。ELISA方法一次只能检测一个目标物，效率较低；PCR方法虽可多目标物同步检测，但易出现假阳性，难以适应当今各种复杂食品的检测。质谱(MS)由于可以给出化合物的分子结构信息，在食品检测领域应用越来越普及，已成为目前检测领域国际通用的“金标准”。目前关于蛋白质谱检测已有较多研究，通过采用基于高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳(CE)等分离手段和基质辅助激光解析(MALDI)、电喷雾(ESI)等不同类型的离子化技术进行蛋白检测。检测方法主要分为两类：一是利用高分辨率质谱和解卷积等数据处理技术在蛋白水平进行研究，由于蛋白质谱行为的不规律性，该研究在定量方面存在较大难度；二是将蛋白酶解为肽段后进行定性和定量研究，在肽水平实现蛋白的定性和定量。第二种检测方法通过色谱和质谱技术的融合，目前已经可以实现一次分析中同时检测多个同类型的过敏原，在食品过敏原蛋白研究领域日渐受到重视，是当前过敏原蛋白检测的主流技术。

然而，除了检测方法之外，还需要考虑预处理程序中关键的目标分析物纯化步骤，特别是在分析复杂食品时。食物基质可以对过敏性食物残留物的纯化和测定具有相当大的影响，因为基质组分易于与靶蛋白形成共价键，离子型和氢键或疏水相互作用。巧克力是最具挑战性的食品基质之一。巧克力含有大量的糖，单宁，特别是能与食物蛋白质反应的多酚化合物，从而掩盖了目前被研究的蛋白质。在一些关于巧克力中过敏原检测的研究中，使用固相萃取(SPE)和/或超滤的蛋白质纯化，需要长达60分钟甚至更长时间，这大大降低了分析量。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种巧克力中过敏原的检测方法，能够对巧克力基质中的过敏原蛋白质进行快速纯化，从而实现高灵敏度，高通量的巧克力中多种过敏原的快速筛选检测。

本发明为解决上述技术问题而采用的技术方案是提供一种巧克力中过敏原的检测方法，包括如下步骤：S1)先对巧克力基质中的糖类和酚类进行吸附，达到巧克力中过敏蛋白质的快速纯化；S2)建立多种过敏原同时检测的色谱质谱方法；S3)建立蛋白质数据库，收集不同来源样品的定性定量数据，并获得统计结果。

上述的巧克力中过敏原的检测方法，其中，所述步骤S1)在巧克力磁性颗粒外键合一种苯硼酸基基团，实现对巧克力基质中糖类和酚类物质的吸附。

上述的巧克力中过敏原的检测方法，其中，所述步骤S2)结合静电场轨道阱高分辨质谱和串联四级杆质谱系统，建立多种过敏原同时检测的色谱质谱方法。

上述的巧克力中过敏原的检测方法，其中，所述多种过敏原包括牛奶，大豆，花生，榛子，核桃，杏仁，腰果和开心果。

上述的巧克力中过敏原的检测方法，其中，所述步骤S2)考察色谱柱参数对色谱分离的影响，优化流动相流速、梯度、时间参数对分离效率的影响，选择合适的柱温和试液温度，并针对每种特征肽考察其色谱保留时间的重现性。

上述的巧克力中过敏原的检测方法，其中，所述色谱柱参数包括类型、柱长和内径。

上述的巧克力中过敏原的检测方法，其中，所述步骤S2)对喷针位置、毛细管电压，锥孔电压，各路气体流量和温度以及碰撞能参数进行优化，并采用全扫描方式观测蛋白酶解产物产生多电荷离子的排布与质量数范围。

上述的巧克力中过敏原的检测方法，其中，所述步骤S3)从Uniport过敏原数据库中下载过敏原蛋白的氨基酸序列，形成自己的食品过敏原数据库；对酶解产生的多肽混合物进行扫描，将肽质量指纹图谱法和肽段碎片离子鉴定法相结合进行蛋白质的确证。

上述的巧克力中过敏原的检测方法，其中，所述步骤S3)根据特征肽的选择原则，确定每种过敏原蛋白的特征肽，针对每个蛋白选择1-2个特征肽，建立多肽混合物的MRM方法；然后采用基质加标方法，考察方法的线性范围、灵敏度、重现性、回收率等指标；对于含油酯较高的食品基质，采用正己烷去除，降低其对分析结果的影响。

上述的巧克力中过敏原的检测方法，其中，所述步骤S3)还包括收集各种不同品牌的巧克力，采用优化后的前处理和色谱质谱方法，进行致敏蛋白的定性鉴定和快速筛查工作。

本发明对比现有技术有如下的有益效果：本发明提供的巧克力中过敏原的检测方法，能够对巧克力基质中的过敏原蛋白质进行快速纯化，从而实现高灵敏度，高通量的巧克力中多种过敏原的快速筛选检测。

附图说明

图1为本发明的巧克力中过敏原的检测流程示意图；

图2为本发明蛋白质纯化前后MRM离子对HPLC-MSMS响应信号对比示意图；

图3为本发明过敏原蛋白特征肽段在MRM模式下的提取离子流色谱图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的描述。

图1为本发明的巧克力中过敏原的检测流程示意图。

请参见图1，本发明提供的巧克力中过敏原的检测方法，包括如下步骤：

S1)先对巧克力基质中的糖类和酚类进行吸附，达到巧克力中过敏蛋白质的快速纯化；

S2)建立多种过敏原同时检测的色谱质谱方法；

S3)建立蛋白质数据库，收集不同来源样品的定性定量数据，并获得统计结果。

本发明针对目前巧克力食品基质中，过敏原蛋白质纯化耗时长的问题，提供一种新型高效的蛋白质纯化方法，所述步骤S1)在磁性颗粒外键合一种特殊苯硼酸基基团，实现对巧克力基质中糖类和酚类物质的吸附，达到快速纯化的目的。所述S2)结合静电场轨道阱高分辨质谱(Q/Orbitrap)和串联四级杆质谱(QqQ)系统，建立了巧克力中多种蛋白类过敏原包括牛奶，大豆，花生，榛子，核桃，杏仁，腰果和开心果的定性鉴定和精确定量研究。

下面对各步骤做进一步的展开：

S1)过敏原蛋白的纯化。考察苯硼酸基基团固相萃取材料用量与纯化效果的相关关系；考察不同的洗脱溶液对蛋白质纯化和回收率的影响,得到优化的蛋白质提取和纯化条件。

S2)建立多种过敏原同时检测的色谱质谱方法

(1)优化HPLC条件。考察色谱柱参数包括类型、柱长、内径等对色谱分离的影响；优化流动相流速、梯度、时间等参数对分离效率的影响；选择合适的柱温和试液温度；针对每种特征肽考察其色谱保留时间的重现性。

(2)优化ESI-Q/Orbitrap和ESI-QqQ条件。优化喷针位置、毛细管电压，锥孔电压，各路气体流量和温度以及碰撞能参数；采用全扫描方式观测蛋白酶解产物产生多电荷离子的排布与质量数范围。

S3)建立蛋白质数据库和蛋白质定性确证和精准定量方法

(1)从Uniport过敏原数据库中下载过敏原蛋白的氨基酸序列，形成自己的食品过敏原数据库。对酶解产生的多肽混合物进行扫描，利用Pfind搜索软件进行蛋白质的确证。将肽质量指纹图谱法(peptide mass fingerprint,PMF)和肽段碎片离子鉴定法(peptidefragments identification,PFI)相结合，提高蛋白质鉴定的准确度。

(2)利用Skyline软件结合质谱检测结果，根据特征肽的选择原则，确定每种过敏原蛋白的特征肽，针对每个蛋白选择1-2个特征肽，建立多肽混合物的MRM方法。采用基质加标方法，考察方法的线性范围、灵敏度、重现性、回收率等指标。对于含油酯较高的食品基质，拟采用正己烷去除，降低其对分析结果的影响。

(3)收集各种不同品牌的巧克力，采用优化后的前处理和色谱质谱方法，进行致敏蛋白的定性鉴定和快速筛查工作。并收集不同来源样品的定性定量数据，获得统计结果。

本发明提供的巧克力中过敏原的检测方法，能够对巧克力基质中的过敏原蛋白质进行快速纯化，从而实现高灵敏度，高通量的巧克力中多种过敏原的快速筛选检测。具体优点如下：1)巧克力食品中蛋白质纯化时间由目前文献报道的1个小时甚至更长，缩短至5分钟。2)纯化后质谱响应信号有所提高，信噪比提高了约10倍，如图2所示，蛋白质纯化前(图2A)和纯化后(图2B)MRM离子对m/z 452.22+→701.4+的HPLC-MSMS响应信号对比图。MRM色谱图显示去除了其它杂质的干扰，如图3所示。3)回收率在60.1-92.4％，比部分文献报道的50％左右有了很大的提高。

下面给出一个具体实施例。

1、将巧克力样品经均质机打碎并混合均匀，称取1g均匀样品，用20mL 40mM Tris-HCl缓冲液提取，在60℃提取3h。将提取物以4000rpm离心10分钟，并将上清液通过0.45μm乙酸纤维素膜过滤。将上述提取液稀释1000倍，

2、取1mL稀释后的提取液于1.5mL离心管中，加入0.1g键合了苯硼酸基的磁性颗粒，混合2min。

3、利用磁性吸附作用，聚集吸附了巧克力中糖和多酚物质的磁性颗粒，将纯化后的蛋白质溶液移入另一1.5mL离心管中。

4、300μL乙酸铵水溶液(pH＝6.5)加入含有磁性颗粒的离心管中，进一步洗脱颗粒上可能吸附的蛋白类物质。

5、合并洗脱液，进行下一步的酶解。

6、酶解后的样品在HPLC-Q/Orbitrap上以数据依赖采集(data-dependentacquisition，DDA)方式获得的全扫描质谱图进行蛋白质定性确证。

7、酶解后的样品在HPLC-QqQ上以MRM方式进行蛋白质定量检测。

考虑到巧克力基质的复杂性，本发明引入快速固相萃取步骤进行样品净化，并证明其在巧克力样品中的应用用于多变应原测定。在所研究的巧克力基质的灵敏度，线性，重复性和回收率方面进行了该方法的验证。然后将该方法用于市售巧克力中的八种变应原成分(牛奶，大豆，花生，榛子，核桃，杏仁，腰果和开心果)的分析。目的是形成自主研发的快速、高通量的食品过敏原筛查系统和方法技术体系,推动我国食品过敏原标识管理的完善发展。预期研究结果可转化为行业标准，应用于进出口食品的过敏原监测，对于确保我国食品安全，破除国际食品技术贸易壁垒具有重要意义。

虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作些许的修改和完善，因此本发明的保护范围当以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种巧克力中过敏原的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1)先对巧克力基质中的糖类和酚类进行吸附，达到巧克力中过敏蛋白质的快速纯化；

S2)建立多种过敏原同时检测的色谱质谱方法；

S3)建立蛋白质数据库，收集不同来源样品的定性定量数据，并获得统计结果。

2.如权利要求1所述的巧克力中过敏原的检测方法，其特征在于，所述步骤S1)在巧克力磁性颗粒外键合一种苯硼酸基基团，实现对巧克力基质中糖类和酚类物质的吸附。

3.如权利要求1所述的巧克力中过敏原的检测方法，其特征在于，所述步骤S2)结合静电场轨道阱高分辨质谱和串联四级杆质谱系统，建立多种过敏原同时检测的色谱质谱方法。

4.如权利要求3所述的巧克力中过敏原的检测方法，其特征在于，所述多种过敏原包括牛奶，大豆，花生，榛子，核桃，杏仁，腰果和开心果。

5.如权利要求3所述的巧克力中过敏原的检测方法，其特征在于，所述步骤S2)考察色谱柱参数对色谱分离的影响，优化流动相流速、梯度、时间参数对分离效率的影响，选择合适的柱温和试液温度，并针对每种特征肽考察其色谱保留时间的重现性。

6.如权利要求5所述的巧克力中过敏原的检测方法，其特征在于，所述色谱柱参数包括类型、柱长和内径。

7.如权利要求3所述的巧克力中过敏原的检测方法，其特征在于，所述步骤S2)对喷针位置、毛细管电压，锥孔电压，各路气体流量和温度以及碰撞能参数进行优化，并采用全扫描方式观测蛋白酶解产物产生多电荷离子的排布与质量数范围。

8.如权利要求1所述的巧克力中过敏原的检测方法，其特征在于，所述步骤S3)从Uniport过敏原数据库中下载过敏原蛋白的氨基酸序列，形成自己的食品过敏原数据库；对酶解产生的多肽混合物进行扫描，将肽质量指纹图谱法和肽段碎片离子鉴定法相结合进行蛋白质的确证。

9.如权利要求8所述的巧克力中过敏原的检测方法，其特征在于，所述步骤S3)根据特征肽的选择原则，确定每种过敏原蛋白的特征肽，针对每个蛋白选择1-2个特征肽，建立多肽混合物的MRM方法；然后采用基质加标方法，考察方法的线性范围、灵敏度、重现性、回收率等指标；对于含油酯较高的食品基质，采用正己烷去除，降低其对分析结果的影响。

10.如权利要求1所述的巧克力中过敏原的检测方法，其特征在于，所述步骤S3)还包括收集各种不同品牌的巧克力，采用优化后的前处理和色谱质谱方法，进行致敏蛋白的定性鉴定和快速筛查工作。