CN109557193B - 一种芝麻主要过敏原的质谱定性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及芝麻7种过敏原蛋白(Ses i 1~Ses i 7)的LC‑MS/MS‑MRM定性检测方法。该方法通过含7M尿素+2M硫脲的+4%CHAPS水溶液提取芝麻中的过敏原蛋白质,经胰蛋白酶4 h酶切,肽段脱盐后用纳升液相色谱高分辨串联质谱(NanoLC‑Q‑TOF)分析,利用Proteinpilot 5.0软件对高分辨质谱获得的数据进行搜库鉴定,选取响应高、无漏切、无可变修饰、长度<25个氨基酸的肽段在NCBI上进行Blast比对,并在15种阴性样品进行特异性验证,挖掘得到共计12条芝麻各过敏原蛋白的特征肽段。同时采用SKYLINE软件对芝麻过敏原特征肽段构建MRM离子对,每条肽段6个,提高检测的灵敏度和准确度。能够高通量、简单、快速、准确且灵敏地检测芝麻各过敏原成分,对于保护消费者安全、促进食品进出口贸易、实施食品过敏原标识方法具有重大意义。
Description
技术领域
本发明涉及基于质谱技术在过敏原检测领域的应用,具体的说,涉及一种LC-MS/MS-MRM靶向检测芝麻过敏原蛋白的方法。
背景技术
芝麻(Sesamum indicum)又名脂麻、胡麻,在热带和亚热带广泛种植,据海关数据统计,2016年全球芝麻实际生产量约为450.90万吨。我国是芝麻生产、消费大国,2015年出口3.15万吨,进口80.59万吨,2016年产量63.00万吨。芝麻油和芝麻酱是深受百姓喜爱的调味品,芝麻籽因其受热能产生浓香,被用作调味料广泛添加于糕点、菜肴和饮品中。同时,芝麻也是常见的食物过敏原之一,芝麻过敏患者在接触芝麻及制品后会出现包括皮肤和粘膜反应、呼吸反应、胃肠道反应在内的全身性反应,甚至可能休克或死亡。
流行病学调查发现,美国约有50万消费者对芝麻及其制品过敏。各国儿童对芝麻及其制品过敏的比例为0.1-0.8%,其中美国和加拿大0.1%,澳大利亚0.8%,以色列0.2%。在以色列,芝麻是仅次于牛奶和鸡蛋的第三大常见食物过敏原。欧洲各国(意大利、法国、英国、丹麦、瑞典、瑞士等)及亚洲(日本)等国家都有芝麻过敏的相关报道近年来,随着芝麻过敏发病率的升高,芝麻过敏已引起全球更多国家重视。
由于芝麻及其制品在食品中使用广泛,芝麻过敏患者生活中接触芝麻过敏原的机会也大大增加。各国开展了对芝麻阈值的相关研究,发现芝麻过敏原的引发剂量(Eliciting dose,ED)ED05在芝麻蛋白的1.2到4.0mg之间,ED10在4.2和6.2mg之间。过敏原的正确标识是预防过敏患者误食相关食品的唯一有效途径。欧盟、加拿大、澳大利亚和新西兰等国要求含有芝麻成分的食品必须进行标识,2014年日本也建议生产商对含芝麻制品进行过敏原标识。过去十年,在澳大利亚因过敏原错误标识而召回的食品中,芝麻及其制品占3%(澳新食品标准局:http://www.foodstandards.gov.au)。食品在各生产环节(加工、储存、运输、销售)都有可能被芝麻过敏原污染(无意污染)。
截止2017年,经国际免疫联合委员会过敏原命名小组(IUIS)确认的芝麻主要过敏原包括2种2S白蛋白Ses i 1(9-14kDa)和Ses i 2(7kDa),7S类豌豆球蛋白Sesi 3(45kDa),2种油脂蛋白Ses i 4(17kDa)和Ses i 5(15kDa),2种11S球蛋白Ses i 6(52.2kDa)和Ses i7(56.6kDa)。其中2S白蛋白和11S球蛋白是主要的过敏原蛋白。
对于芝麻过敏原,目前的的主要检测方法是PCR法和ELSIA法。PCR的方法具有较高的灵敏度,但是同一批的样品提取的核酸会经常出现假阴性或假阳性,并且检测的对象是DNA,而不是过敏原蛋白质。ELISA方法的特异性取决于抗原的制备,这限制了其应用范围,并且容易存在交叉反应或者产生假阴性结果;虽有快速试剂盒,但是各种商业化的ELISA试剂盒只能用于定性和半定量,并不能准确地检测芝麻过敏原,特别是痕量蛋白。并且食品加工工艺,如加热过程会破坏蛋白质结构使蛋白质变性,导致ELISA等免疫学方法检测结果出现假阴性。因此,建立一个既能直接检测致敏蛋白又能检测变性蛋白的检测方法用于食品中的芝麻过敏原的定量测定无疑是非常必要的。
针对上述问题,质谱法结合蛋白质组学无疑是一个在未来具有广阔的应用前景。质谱法既克服了免疫学方法存在的通量低和交叉干扰的弊端,也克服了PCR技术不能直接检测致敏蛋白质的缺点,能够对蛋白质和多肽进行明确鉴定和定量,并且可以同时检测多种过敏原蛋白。目标过敏原的定量检测主要采用MRM(多反应监测模式)方式,MRM的显著优点是具有较高灵敏度和特异性,能够在复杂的样品中对微量靶蛋白质进行精确测定。
发明内容
针对现有检测技术的不足,本发明的目的在于提供一种芝麻各过敏原蛋白(Ses i1~Ses i 7)的特征肽段。
本发明的另一目的是提供一种基于高分辨质谱的芝麻各过敏原蛋白(Ses i 1~Ses i 7)特征肽段的挖掘方法。
本发明的再一目的是提供一种基于LC-MS/MS-MRM芝麻各过敏原蛋白的定性检测方法。
本发明的又一目的是提供芝麻各过敏原蛋白特异肽段在准确检测芝麻过敏原蛋白成分中的应用。
为实现上述目的,本发明是通过以下技术方案实现的:
一种芝麻各过敏原蛋白(Ses i 1~Ses i 7)特征肽段的挖掘方法,包括以下步骤:
(1)芝麻样品磨粉、脱脂处理后,分别采用50mM碳酸氢铵、7M尿素+2M硫脲、7M尿素+2M硫脲+4%CHAPS超声提取30min~2h、酚抽提法进行芝麻总蛋白的提取。测定蛋白浓度后取200μg,37℃水浴中经二硫苏糖醇(DTT)还原1h、室温避光经碘乙酰胺(IAA)烷基化处理15min,并于10KDa超滤膜上37℃水浴中酶切处理2h~12h,离心收集酶切肽段,净化处理肽段。
(2)将步骤(1)中得到的净化酶切肽段进行高分辨质谱分析,将分析数据导入Proteinpilot软件,进行肽段的搜库鉴定,从中选取响应高、打分>20、氨基酸个数6~20、可信度>95%、无漏切的肽段作为预选特征肽段,NCBI数据库BLAST比对选择特异性强的肽段作为芝麻各过敏原蛋白检测的特征肽段。
(3)将步骤(2)中鉴定到的芝麻过敏原(Ses i 1~Ses i 7)特征肽段序列导入Skyline软件,构建肽段MRM方法的母子离子对及碰撞能量。
(4)根据步骤(3)中优化的结果进行特异性的验证、重复性考察。
其中,步骤(1)中所述的DTT浓度为10mM,IAA浓度为50mM;提取方法优选为7M尿素+2M硫脲+4%CHAPS超声提取;提取时间优选为30min;酶切处理时间优选为4h;肽段收集过程中,选择25mM的碳酸氢铵清洗滤膜,选择真空旋蒸的方法去除肽段溶液中可挥发性碳酸氢铵。
其中,步骤(2)中所述的高分辨质谱分析条件为:
液相条件:在线Nano-RPLC液相色谱:Eksigent NanoLC-Ultra 2D plus+cHiPLCnanoflex液相色谱系统;色谱柱:C18反相色谱柱,(75μm x 15cm C18-3μmChromXPEksigent);上样流速:2μL/min,10min;柱温:40℃;流动相:A:2%乙腈-98%水-0.1%甲酸;流动相B:98%乙腈-2%水-0.1%甲酸;流速0.3μL/min;进样体积4μL;流动相洗脱梯度见表2。
质谱条件:系统(AB SCIEX);ESI+正离子模式;喷雾电压(Ionspray voltage):2.4kv;雾化气(GAS1):6psi;气帘气(Curtain gas):30psi;质谱扫描模式:信息依赖型采集工作模式(IDA);TOF MS模式:350-1500m/z,250ms;IDA TOF MS/MS模式:100-1500m/z,30MS/MS,100ms,IDA threshold:120cps,母离子电荷选择范围为+2~+5;Rolling CE:enabled;Dynamic exclusion time:20s;运行时间:60min。
其中,步骤(3)所述的特征肽段筛选结果,如表2所示;所建立的LC-MS/MS-MRM方法的液相色谱条件如如下:
液相条件:LC-20A岛津Prominence液相系统;色谱柱:液相色谱柱(WatersXBridge peptide BEH C18,3.5μm,4.6mm×150mm),流速0.4mL/min,柱温40℃。流动相:A:2%乙腈-98%水-0.1%甲酸;流动相B:98%乙腈-2%水-0.1%甲酸;流速0.4mL/min;流动相梯度洗脱程序如表3所示。
质谱条件:ESI+正离子模式;气帘气CUR:20psi;碰撞气CAD:Medium;雾化气GAS1:60psi;辅助气GAS2:50psi;喷雾电压IS:5500V;源温度:600℃;扫描方式:多离子反应监测(MRM);MRM离子对参数如表4所示。
其中,步骤(4)所述的特异性考察实验,选择扁桃仁(美国)、大豆、开心果、杏仁、夏威夷果、腰果、扁桃仁(新疆)、松子、山核桃、碧根果、燕麦、玉米、小麦、大米、花生为阴性样品。
本发明的有益效果:
(1)本发明基于高分辨质谱鉴定分析了芝麻过敏原的酶切肽段,挖掘到芝麻各过敏原肽段,其质谱响应效果好、稳定性高、特异性强。
(2)本发明以芝麻过敏原蛋白为检测基础,根据蛋白质的氨基酸序列在不同物种中具有差异性的特点,根据筛选到的特征肽段的离子对,利用LC-MS/MS-MRM方法定性检测样品中的芝麻过敏原蛋白成分。
(3)本发明多反应监测(MRM)能够在复杂混合物中定向提取特征肽段的特征离子,作为一种质谱检测的分析方法,具有特异性强、灵敏度高、准确度高、重现性好、线性动态范围宽、自动化高通量的突出优点,是目前最灵敏的质谱检测模式。建立的针对芝麻过敏原蛋白的检测方法,能够在糕点、饮料、酱料、冲调制品中有良好的应用效果。
表1 Nano-RPLC液相流动相梯度洗脱程序
表2芝麻过敏原蛋白特异性肽段
表3液相流动相梯度洗脱程序
表4芝麻过敏原蛋白各肽段MRM参数
附图说明
图1是芝麻各过敏原特征肽段的MRM总离子流图。
图2是芝麻过敏原Ses i 1~Ses i 4特征肽段的二级质谱图。
图3是芝麻过敏原Ses i 5~Ses i 7特征肽段的二级质谱图。
图4是芝麻各过敏原LC-MRM特异性验证结果。碧根果中检测到的拟选肽段中非特异肽段(ISGAQPSLR)离子流图;基线为阴性样品中对特征肽段的响应响应;其中,1:扁桃仁(美国)2:大豆3:开心果4:杏仁5:夏威夷果6:腰果7:扁桃仁(新疆)8:松子9:山核桃10.碧根果11:燕麦12:玉米13:小麦14:大米15:花生
图5是芝麻各过敏原特征肽段的稳定性结果。A:未加工;B120℃烘烤处理;C:180℃烘烤处理。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明作进一步的说明,但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
(1)样品前处理样品磨粉后,冷丙酮搅拌脱脂3次,每次2h,得到脱脂芝麻粉。
(2)蛋白提取称取400mg脱脂芝麻粉,溶于4.0mL 7M尿素+2M硫脲+4%CHAPS溶液超声1h提取蛋白。4℃下12000g离心10min收集上清液,过0.22μm微孔滤膜后,4℃保存。
(3)蛋白浓度测定(Bradford法)先用0.15M NaCl溶液配制1mg/ml的牛血清蛋白(BSA)母液,再往母液中加入磷酸缓冲溶液(PBS)配制一组浓度分别为1.0mg/ml,0.8mg/ml,0.4mg/ml,0.2mg/ml,0.1mg/ml的BSA溶液100μL。将配置好的不同浓度的蛋白标准溶液30μL加到1mL Bradford工作液中(0.01%(w/v)G250,8.5%磷酸和4.75%乙醇),轻轻颠倒混匀,静止5min。将适量体积的样品用PBS适当稀释(0.1-1.0mg/mL)至30μL,加入1mL Bradford工作液,轻轻颠倒混匀,静止5min。将反应好的溶液300μL加入到96孔板的样品孔中。使用酶标仪测定A595nm下的吸光度。根据标准溶液的吸光度绘制标准曲线,再根据标准曲线计算出样品的浓度。
(4)还原烷基化根据蛋白浓度测定结果,各样品均取含200μg蛋白的提取液,置于1.5mL棕色离心管中,加入120μL 10mM二硫苏糖醇(DTT),混匀后37℃水浴还原1h,冷却至室温后加入120μL50mM碘乙酰胺(IAA)混匀后室温下烷基化反应15min。将还原并烷基化后的蛋白溶液全部转移至10kDa超滤离心管中,12000g离心20min。再加入100μL 50mM碳酸氢铵溶液,12000g离心20min,重复2次该步骤。弃去收集管中的所有液体,并用超纯水清洗3次,控干。
(5)酶切处理将滤膜上加入100μL 50mM的碳酸氢铵溶液,充分涡旋混匀。取50mM乙酸溶液加入胰蛋白酶中,配制成1μg/μL的酶溶液,按照蛋白:酶=50:1的比例,加入4μL蛋白酶液,混匀后将超滤膜置于37℃水浴中酶切处理4h。酶切后12000g离心20min,加入25mM的碳酸氢铵溶液100μL于滤膜上,涡旋,12000g离心20min,重复3次,合并滤液。
(6)肽段收集真空旋转蒸发肽段溶液直至干燥,加100μL超纯水复溶、真空干燥,重复该步骤3次,除去溶液中的可挥发性碳酸氢铵,收集净化后的肽段。
(7)高分辨质谱分析将酶切肽段用100μL 0.1%甲酸-2%乙腈-水溶液复溶后,12000g离心10min,取90μL用于液质分析。液相条件流动相洗脱程序(见表5)及高分辨质谱条件如下:
液相条件:在线Nano-RPLC液相色谱:Eksigent NanoLC-Ultra 2D plus+cHiPLCnanoflex液相色谱系统;色谱柱:C18反相色谱柱,(75μm x 15cm C18-3μmChromXPEksigent);上样流速:2μL/min,10min;柱温:40℃;流动相:A:2%乙腈-98%水-0.1%甲酸;流动相B:98%乙腈-2%水-0.1%甲酸;流速0.3μL/min;进样体积4μL;流动相洗脱梯度见表5。
质谱条件:系统(AB SCIEX);ESI+正离子模式;喷雾电压(Ionspray voltage):2.4kv;雾化气(GAS1):6psi;气帘气(Curtain gas):30psi;质谱扫描模式:信息依赖型采集工作模式(IDA);TOF MS模式:350-1500m/z,250ms;IDA TOF MS/MS模式:100-1500m/z,30MS/MS,100ms,IDA threshold:120cps,母离子电荷选择范围为+2~+5;Rolling CE:enabled;Dynamic exclusion time:20s;运行时间:60min。
表5 Nano-RPLC液相流动相梯度洗脱程序
(8)搜库鉴定高分辨质谱获得的wiff数据导入Proteinpilot软件,并以UniprotKB中的芝麻(Sesamum indicum)蛋白为库搜索鉴定酶切肽段序列。参数设置:Sample Type:Identification;Cys Alkylation:Iodoacetamide;Digestion:Trypsin;Search Effort:Rapid ID;ID Focus:Biological modifications。从中选取响应高、打分>20、氨基酸个数6~20、可信度>95%、无漏切的肽段作为预选特征肽段,NCBI数据库BLAST比对验证肽段特异性,筛选肽段如表6所示。
表6芝麻过敏原蛋白特异性肽段
(9)构建芝麻过敏原蛋白定性检测LC-MRM方法
液相条件:岛津Prominence LC-20A液相系统;色谱柱:液相色谱柱(WatersXBridge peptide BEH C18,3.5μm,4.6mm×150mm),流速0.4mL/min,柱温40℃。流动相:A:2%乙腈-98%水-0.1%甲酸;流动相B:98%乙腈-2%水-0.1%甲酸;流速0.4mL/min;流动相梯度洗脱程序如表3所示。
质谱条件:ESI+正离子模式;气帘气CUR:20psi;碰撞气CAD:Medium;雾化气GAS1:60psi;辅助气GAS2:50psi;喷雾电压IS:5500V;源温度:600℃;扫描方式:多离子反应监测(MRM);
离子对参数设置根据Skyline软件分析肽段序列,根据易断裂位点顺序每个肽段筛选出若干离子对,根据Proteinpilot软件的鉴定肽段结果,利用Skyline软件构建肽段MRM方法的母子离子对及碰撞能量等。根据每个母子离子对的CE值,以2为步幅,上下调整CE值,根据峰面积确定最优CE值,将所有离子对碰撞能量优化后根据峰面积强度每个肽段筛选6个特征离子对,结果如表7所示。
表7液相流动相梯度洗脱程序
表8芝麻过敏原蛋白各肽段MRM参数
(8)特异性验证选用扁桃仁(美国)、大豆、开心果、杏仁、夏威夷果、腰果、扁桃仁(新疆)、松子、山核桃、碧根果、燕麦、玉米、小麦、大米、花生为阴性样品,相同前处理后,LC-MRM方法进行实际样品的特异性验证。
(9)稳定性验证将芝麻进行120℃、180℃烘烤处理20min,再进行MRM方法检测,考察肽段的稳定性。
(10)方法重现性为了验证实验方法的重现性,重复进样酶解的样品五次,分别考查其中肽段峰面积的重现性,结果如表9所示,CV<5%
虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述,但是本领域技术人员应认识到,在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而,本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。
表9芝麻过敏原蛋白各肽段MRM参数
Claims (2)
1.一种基于LC-MS/MS-MRM的芝麻过敏原蛋白的检测方法,该检测方法用于检测食品中芝麻过敏原蛋白成分,其特征在于,根据筛选到的特征肽段的离子对,利用LC-MS/MS-MRM方法定性检测样品中的芝麻过敏原蛋白成分,筛选到的芝麻各过敏原蛋白的特征肽段氨基酸序列如下:
Ses i 1特征肽段1:QQQQEGGYQEGQSQQVYQR;
Ses i 2特征肽段1:MC[CAM]GMSYPTEC[CAM]R;
Ses i 3特征肽段1:IPYVFEDQHFITGF;
Ses i 3特征肽段2:SFSDEILEAAFNTR;
Ses i 4特征肽段1:GVQEGTLYVGEK;
Ses i 4特征肽段2:ATGQGPLEYAK;
Ses i 5特征肽段1:APHLQLQPR;
Ses i 6特征肽段1:AFYLAGGVPR;
Ses i 6特征肽段2:IQSEGGTTELWDER;
Ses i 6特征肽段3:ISGAQPSLR;
Ses i 7特征肽段1:FESEAGLTEFWDR;
Ses i 7特征肽段2:EGQLIIVPQNYVVAK;
在MRM-scheduled模式下检测的特征肽段的母子离子对、CE值、保留时间如下表所示:
;筛选芝麻各过敏原蛋白的特征肽段的高分辨质谱方法如下:
液相条件:在线Nano-RPLC液相色谱:EksigentNanoLC-Ultra 2D plus+cHiPLCnanoflex液相色谱系统;色谱柱:C18反相色谱柱,75μm x 15cm C18-3μmChromXPEksigent;上样流速:2μL/min,10min;柱温:40℃;流动相:A:2%乙腈-98%水-0.1%甲酸;流动相B:98%乙腈-2%水-0.1%甲酸;流速0.3μL/min;进样体积4μL;流动相洗脱梯度如下表所示:
2.根据权利要求1所述的基于LC-MS/MS-MRM的芝麻过敏原蛋白的检测方法,其特征在于,筛选芝麻各过敏原蛋白的特征肽段的搜库鉴定方法如下:高分辨质谱获得的wiff数据导入Proteinpilot软件,并以UniprotKB中的芝麻蛋白为库搜索鉴定酶切肽段序列;参数设置:Sample Type:Identification;Cys Alkylation:Iodoacetamide;Digestion:Trypsin;Search Effort:Rapid ID;ID Focus:Biological modifications;从中选取响应高、打分>20、氨基酸个数6~20、可信度>95%、无漏切的肽段作为预选特征肽段,NCBI数据库BLAST比对验证肽段特异性。
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