WO2014037977A1 - 個別化治療診断のためのマーカータンパク質絶対量の定量方法 - Google Patents

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WO2014037977A1
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peptide
seq
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protein
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純男 大槻
哲也 寺崎
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国立大学法人東北大学
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C07K1/128—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general sequencing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a peptide used for quantification of a protein serving as an index for treatment or diagnosis of a disease by a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC / MS / MS), a method for selecting the peptide, and the use of the peptide. It relates to quantitative methods.
  • LC / MS / MS liquid chromatograph-tandem mass spectrometer
  • test methods mainly used in the clinical field are aimed at detecting a single protein, and cannot detect a large number of different proteins at the same time.
  • test methods since many of the above-described test methods use antibodies, it is difficult to conduct specific quantitative tests due to cross-reactions (see Non-Patent Documents 1 and 2, for example), and for each protein In order to detect a large number of proteins, enormous labor and cost are required.
  • development of a microarray gene expression analysis method has progressed, and a gene expression test method capable of quantifying various types of RNA expression at once has been established. (For example, see Non-Patent Documents 3 to 6).
  • RNA expression profile obtained by microarray analysis is It is not necessarily considered to match the protein expression profile of the patient. Based on the above results, it is difficult to perform individualized treatment with molecular target drugs based on the results of microarray analysis, and a test method capable of comprehensively quantifying the proteins that are actually expressed has been established. There is a strong demand to do.
  • mass spectrometry mass spectrometry
  • MS mass spectrometer
  • LC / LC liquid chromatograph-mass spectrometer
  • MS mass spectrometer
  • MS / MS tandem mass spectrometer
  • liquid chromatograph-tandem mass spectrometer with a liquid chromatograph connected in front of the tandem mass spectrometer Mass spectrometers having various functions such as (LC / MS / MS) have been developed and are widely used for measurement and quantification of biological materials (see, for example, Patent Documents 2 to 4).
  • Patent Documents 5 to 7 For accurate protein quantification using a mass spectrometer, peptides that have properties suitable for analysis by a mass spectrometer are fragmented by enzymatic treatment of the protein to be quantified and fragmented. It is considered important to select and quantify the fragments.
  • Patent Documents 5 to 7 the inventors have already established a method for simultaneously quantifying the absolute expression levels of membrane proteins and metabolic enzymes using LC / MS / MS, and among them, LC / MS / MS The criteria for selecting a peptide to be quantified with a high ionization efficiency suitable for quantification by HPLC are shown. However, Patent Documents 5 to 7 do not show criteria for selecting only peptides that are reliably separated in the LC / MS / MS liquid chromatograph section.
  • Non-Patent Document 7 predicts the retention time of phosphorylated and non-phosphorylated peptides from the retention time (retention times) prediction model in the LC / MS / MS liquid chromatograph, and increases the accuracy of protein quantification. It has been suggested that it can be increased. However, there is no suggestion as to whether a retention time prediction model can be used for measuring target proteins of molecular target drugs, proteins to be diagnosed in general diagnosis, and the like.
  • An object of the present invention is to provide a highly sensitive protein quantification method using LC / MS / MS, which can simultaneously quantify proteins that serve as indicators for treatment or diagnosis of diseases.
  • Patent Document 5 It was thought that the accuracy of the quantification method described in the above could be further improved and quantification with higher sensitivity could be performed. Then, as a result of experiments using various peptide fragments, the present inventors select peptides that are eluted within 35 to 60 minutes in the LC / MS / MS liquid chromatograph section as peptides to be quantified. As a result, it was found that the sensitivity of quantification by LC / MS / MS increases.
  • the present inventors identify peptides that satisfy the criteria for the elution time and the criteria described in Patent Document 5, etc., as quantification target peptides for quantifying proteins that serve as indicators for treatment or diagnosis of diseases. Tried. Then, a parameter for each amino acid for predicting the elution time is derived from known peptide elution position data, and using the parameter, the above criteria are obtained from the amino acid sequence of a protein that serves as an index for treatment or diagnosis of a disease. As a result of searching for satisfying peptides, the peptides consisting of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 309 were identified as peptides to be quantified, and the present invention was completed.
  • the present invention is [1] a peptide used for quantifying a protein serving as an index for treatment or diagnosis of a disease by a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC / MS / MS). It is related with the peptide characterized by being selected by A] and [B].
  • a score of 10 is given in the case of a peptide to which no sugar chain is added; (7) A score of 10 is given when the peptide does not include a post-translational modification site, except when the post-translational modified protein is quantified; (8) If the peptide does not contain a single nucleotide polymorphism (SNP) site, a score of 10 is given; (9) If the proteolytic enzyme cleavage site is a peptide that is not arginine-arginine, arginine-lysine, lysine-arginine, lysine-lysine, a score of 10 is given; (10) When the structure of the protein is determined or predicted, a score of 10 is given when the peptide does not include a transmembrane region; (11) When the peptide does not contain methionine and
  • the present invention also provides [2] a peptide comprising the amino acid sequence shown in any one of SEQ ID NOS: 1 to 308, and [3] prediction of selected criteria (3)
  • the present invention also provides a method for selecting a peptide to be used for quantifying a protein serving as an index for treatment or diagnosis of a disease by [5] liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC / MS / MS). The method is selected by the steps [A] and [B].
  • a score of 10 is given in the case of a peptide to which no sugar chain is added; (7) A score of 10 is given when the peptide does not include a post-translational modification site, except when the post-translational modified protein is quantified; (8) If the peptide does not contain a single nucleotide polymorphism (SNP) site, a score of 10 is given; (9) If the proteolytic enzyme cleavage site is a peptide that is not arginine-arginine, arginine-lysine, lysine-arginine, lysine-lysine, a score of 10 is given; (10) When the structure of the protein is determined or predicted, a score of 10 is given when the peptide does not include a transmembrane region; (11) When the peptide does not contain methionine and
  • the present invention also provides the method according to [5] above, wherein the predicted elution time of [6] selected criteria (3) is 40 to 60 minutes, and [7] the hydrophobic amino acids of selected criteria (4)
  • the present invention also provides [8] a protein serving as an index for treatment or diagnosis of a disease by a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC / MS / MS) comprising the following steps (a) to (d): A method for quantification, wherein the peptide to be quantified is the peptide according to any one of [1] to [4] above.
  • LC / MS / MS liquid chromatograph-tandem mass spectrometer
  • A fragmenting a protein to be quantified in a sample with trypsin to prepare a peptide fragment of the protein to be quantified
  • B Using the peptide to be quantified and a stable isotope-labeled peptide having the same sequence as the peptide to be quantified, perform mass spectrometry using LC / MS / MS for each predetermined concentration step, and create a calibration curve Process
  • C adding the stable isotope-labeled peptide to the peptide fragment of the protein to be quantified, performing mass spectrometry using LC / MS / MS, and determining the mass spectrum area ratio of the protein to be quantified / stable isotope-labeled peptide Calculating (D) a step of calculating a quantitative value from the area ratio using a calibration curve;
  • the present invention is also characterized in that the step [9] preparing the peptide fragment is a step of further fragmenting a protein to be quantified in a sample previously fragmented with lysylendopeptidase using trypsin.
  • the method according to [8] or [9], wherein the method according to [8] or [10] is a cell, tissue, or blood collected from a living body.
  • the present invention further relates to [11] a kit for quantifying a protein serving as an index for treatment or diagnosis of a disease, comprising the peptide according to any one of [1] to [4].
  • the protein quantification method of the present invention it becomes possible to quantitate proteins that are indicators for the treatment or diagnosis of various types of diseases, which were difficult with conventional methods, simply, quickly and accurately (see FIG. 1).
  • the protein quantification method of the present invention it is possible to analyze the profile of protein expression level in individual patients from a small number of samples collected from patients, which is extremely useful knowledge for individualized treatment of diseases. Can be provided.
  • FIG. 3 is a diagram showing the correlation between the predicted elution time of a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 309 to 379 and the actually measured elution time predicted by the elution position prediction parameter of the present invention.
  • the vertical axis represents the actual dissolution time (minutes)
  • the horizontal axis represents the dissolution prediction parameter (minutes). It is the figure shown about the relationship of the isolation
  • a peptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NOs: 380 to 386 was used. It is the figure shown about the target protein of a molecular target drug. It is a figure which shows the result of having quantified the target protein of the molecular target drug by the high sensitivity quantification method of the present invention. It is a figure which shows the result of having quantified the target protein of the human molecular target drug in a brain tumor specimen cell membrane fraction by the high sensitivity quantification method of the present invention. It is a figure shown about the brain tumor individualization treatment of the molecular target drug by the method of quantifying the protein of the present invention.
  • the peptide of the present invention is a peptide used for quantifying a protein serving as an index for treatment or diagnosis of a disease by a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC / MS / MS), [A] (1) It is a peptide obtained by fragmenting a protein that serves as an indicator for the treatment or diagnosis of the disease with trypsin; (2) Specific for a protein that serves as an indicator for the treatment or diagnosis of the disease (3) An elution time parameter for each amino acid is set and, based on the elution time parameter, (i) HPLC: Agilent 1200 HPLC system (manufactured by Agilent Technologies); (ii) Column: XBridge BEH130 C18, 3.5 ⁇ m, 100 ⁇ 1.0 mm (manufactured by Waters); (iii) mobile phase: mobile phase A consisting of 0.1% formic acid / milli-Q water, mobile consisting of 0.1% formic acid / acetonitrile Phase B; (
  • [B] (4) the content of a hydrophobic amino acid selected from tryptophan, tyrosine, valine, leucine, isoleucine, and phenylalanine is 80% or less, and the hydrophobic amino acid is a peptide that does not continue for 10 amino acids or more.
  • a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC / MS / MS) can be used.
  • the protein is indicative of the therapeutic or diagnostic a method of selecting peptides to be used in order to quantify, [A] (1) It is a peptide obtained by fragmenting a protein that serves as an indicator for the treatment or diagnosis of the disease with trypsin; (2) Specific for a protein that serves as an indicator for the treatment or diagnosis of the disease (3) An elution time parameter for each amino acid is set and, based on the elution time parameter, (i) HPLC: Agilent 1200 HPLC system (manufactured by Agilent Technologies); (ii) Column: XBridge BEH130 C18, 3.5 ⁇ m, 100 ⁇ 1.0 mm (manufactured by Waters); (iii) mobile phase: mobile phase A consisting of 0.1% formic acid / milli-Q water, mobile consisting of 0.1% formic acid /
  • [B] (4) the content of a hydrophobic amino acid selected from tryptophan, tyrosine, valine, leucine, isoleucine, and phenylalanine is 80% or less, and the hydrophobic amino acid is a peptide that does not continue for 10 amino acids or more.
  • the “peptide obtained by fragmenting a protein that serves as an indicator for treatment or diagnosis of a disease with trypsin” of the present invention is obtained by actually fragmenting a protein that serves as an indicator for treatment or diagnosis of a disease with trypsin.
  • synthetic peptides having the same amino acid sequence as such peptides are also included.
  • Protein databases in the selection criteria (6) include Protein Information Resource (PIR), SWISS-PROT & TrEMBL, Protein Research Foundation (PRF), NCBI Protein Database, UniProt (http://www.uniprot.org/) However, it is preferably NCBI Protein Database or UniProt (http://www.uniprot.org/).
  • the “peptide not glycosylated in the annotation information of the protein database” specifically includes asparagine-X-serine, asparagine-X-threonine, or asparagine-X-cysteine.
  • Preferable examples include peptides that do not contain a sequence, and wherein X is an amino acid other than proline.
  • a peptide fragment consisting of a known amino acid sequence is obtained by: (i) HPLC: Agilent 1200 HPLC system (manufactured by Agilent Technologies); (ii) Column: XBridge BEH130 C18, 3.5 ⁇ m, 100 ⁇ 1.0 mm (manufactured by Waters); (iii) mobile phase: mobile phase A consisting of 0.1% formic acid / milli-Q water, mobile phase B consisting of 0.1% formic acid / acetonitrile; (Iv) Flow rate: 50 ⁇ L / min for 0 to 60 minutes, 100 ⁇ L / min for 60 to 90 minutes; (v) Concentration gradient: 99/1 (mobile phase A / mobile phase B), 5 minutes for 0 to 5 minutes From 99/1 (mobile phase A / mobile phase B) to 50/50 (mobile phase A / mobile phase B) from 55 to 55 minutes, from 100/1 to 56 to 58 minutes %
  • a peptide whose predicted elution time is in the range of 30 to 70 minutes is defined as (i) HPLC: Agilent 1200 HPLC system ( (Ii) Column: XBridge BEH130 C18, 3.5 ⁇ m, 100 ⁇ 1.0 mm (Waters); (iii) Mobile phase: Mobile phase A consisting of 0.1% formic acid / Milli Q water, Mobile phase B consisting of 0.1% formic acid / acetonitrile; (iv) Flow rate: 50 ⁇ L / min for 0-60 minutes, 100 ⁇ L / min for 60-90 minutes; (v) Concentration gradient: 99/99 for 0-5 minutes 1 (mobile phase A / mobile phase B) from 5/1 to 99/99 (mobile phase A / mobile phase B) to 50/50 (mobile phase A / mobile phase) B), 100% mobile phase B for 56 to 58 minutes, 99/1 (mobile phase A / mobile phase B) for 60 to 90 minutes; calculation of elution time by
  • the predicted elution time of the peptide of the present invention is not particularly limited as long as it is within the range of 30 to 70 minutes. For example, 30 to 65 minutes, 30 to 60 minutes, 35 to 70 minutes, 35 to 65 minutes, It may be 35 to 60 minutes, 40 to 70 minutes, 40 to 65 minutes, 40 to 60 minutes, etc., but 40 to 60 minutes are preferred.
  • a protein that serves as an index for treatment or diagnosis of a disease is not particularly limited.
  • PDGFR ⁇ accession number P16234
  • PDGFR ⁇ accession number P16234
  • PDGFR ⁇ accession
  • the peptide of the present invention is, for example, a peptide comprising the amino acid sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 45 for quantifying a target protein of a molecular target drug, or a diagnosis target in general diagnosis
  • a partial sequence of PDGFR ⁇ (accession number P16234), VETIIAVR (SEQ ID NO: 1), GSTFLPVK (SEQ ID NO: 2), And LVYTLTVPEATVK (SEQ ID NO: 3); partial sequences of PDGFR ⁇ (accession number P09619), EVDSDAYYVYR (SEQ ID NO: 4), LPGFHGLR (SEQ ID NO: 5), and YVSELTLVR (SEQ ID NO: 6); EGFR (accession number P00533) A partial sequence of ELIIEFSK (SEQ ID NO: 7), IPLENLQIIR (SEQ ID NO: 8), and NLQEILHGAVR (SEQ ID NO: 9); EGFR-variant (accession number P0053) 3) are partial sequences of ITDFGR (SEQ ID NO: 10), ITDFGLAK (SEQ ID NO:
  • peptides for quantifying the target protein of the molecular target drug it is a partial sequence of PDGFR ⁇ (accession number P16234), VEETIAVR (sequence number 1); PDGFR ⁇ (accession number P09619) , EVDSDAYYVYR (SEQ ID NO: 4); a partial sequence of EGFR (accession number P00533), ELIIEFSK (SEQ ID NO: 7); a partial sequence of EGFR-variant (accession number P00533), ITDFGR (SEQ ID NO: 10), ITDFGLAK (SEQ ID NO: 11), NYDLSFFLK (SEQ ID NO: 12), and EISDGDVIISGNK (SEQ ID NO: 13); a partial sequence of ERBB2 (accession number P04626), V LQGLPR (SEQ ID NO: 14); a partial sequence of VEGFR1 (accession number P17948), AFPSPEVVWLK (SEQ ID NO: 17
  • VLPQLSR SEQ ID NO: 35
  • VVEATYGLIK SEQ ID NO: 37
  • FLT3 accession number
  • TGVSIQVAVK SEQ ID NO: 40
  • IDTPRPLVGR SEQ ID NO: 43
  • a partial sequence of serum amylase (accession numbers P04745, P04746, P19961), SSDYFGNGR (SEQ ID NO: 46), And IYVSDDGK (SEQ ID NO: 47); partial sequences of Apo-A1 (accession number P02647), QGLLPVLESFK (SEQ ID NO: 48), DLATVYVDVLK (SEQ ID NO: 49), and LLDNWDSVTSTFSK (SEQ ID NO: 50); Apo-A2 (active SPELQAEAK (SEQ ID NO: 51); Apo-B (48 + 100) (accession number P04114), a partial sequence of session number P02652), IEIPLPF GPN (SEQ ID NO: 52), EFQVPTIPIPK (SEQ ID NO: 53), and TGISPLALIK (SEQ ID NO: 54); Apo-B100 (Accession Number P04114
  • VLQGLPR (SEQ ID NO: 90), and GGVLIQR (SEQ ID NO: 91); CRP (Accession No. P00734) No. P02741), ESDTSYVSLK (SEQ ID NO: 92); AFP (accession number P02771), TFQAIVTTK (SEQ ID NO: 93), and DFNQFSSGEK (SEQ ID NO: 94); SCCA1 (accession number P29508) ), Partial distribution of GLVLSGVLHK (SEQ ID NO: 95) and TNSILFYGR (SEQ ID NO: 96); SCCA2 (accession number P48594) VLHFFDQVENTTEK (SEQ ID NO: 97), and TNSILFYGR (SEQ ID NO: 98); NSE (accession number P09104), which is a partial sequence of YITGDQLGARYQDFVR (SEQ ID NO: 99), IEEEELGDEAR (SEQ ID NO: 100), and LGA
  • SSDYFGGNGR SEQ ID NO: 46
  • IYVSDDGK SEQ ID NO: 47
  • a partial sequence of Apo-A1 (accession number P02647)
  • QGLLPVLESFK SEQ ID NO: 48
  • DLATVYVDVLK SEQ ID NO: 49
  • a partial sequence of Apo-A2 (accession number P02652)
  • SPELQAEAK SEQ ID NO: 51
  • IEIPLPFGGGK SEQ ID NO: 52
  • EFQVPFTIPK SEQ ID NO: 5
  • a peptide for quantifying the tumor-related marker protein of the present invention specifically, a partial sequence of Vimentin (accession number P08670), FADLSEANR (SEQ ID NO: 112); Neurofilament medium polypeptide (accession number P07197) VSSSPSSGFR (SEQ ID NO: 113) and FVEEIIEETK (SEQ ID NO: 114); NESTIN (Accession No.
  • LELQFPR SEQ ID NO: 115
  • GAVAGAPK SEQ ID NO: 116
  • GGPPEAFTTSV a partial sequence of transcriptase (accession number O14746) (SEQ ID NO: 117), and SYLPNTVTDALR (SEQ ID NO: 118); beta-catenin (accession number P35222), SGGIPALVK (SEQ ID NO: 119), and LLNDEDQVVVNK (SEQ ID NO: 120); C-MYC (accession) No.
  • VSGSSSSFFR which is a partial sequence of Vimentin (accession number P08670), FADLSEANR (SEQ ID NO: 112); Neurofilament medium peptide (accession number P07197) (SEQ ID NO: 113); GELPEAFTSTSVR (partial sequence of NELTIN (accession number P48681), LELQFPR (SEQ ID NO: 115), and GAVAGAPK (SEQ ID NO: 116); Telomerase transcriptase (accession number O14746).
  • SEQ ID NO: 117 beta-catenin (accession The partial sequence of SGGIPALVK (SEQ ID NO: 119); the partial sequence of C-MYC (accession number P01106), the partial sequence of DQIPELENNEK (SEQ ID NO: 121); the partial sequence of N-MYC (accession number P04198) NAALGPGR (SEQ ID NO: 122); a partial sequence of GSTP1 (Accession No. P09211), TLGLYGK (SEQ ID NO: 123); a partial sequence of MGMT (Accession No.
  • EWLLAHEGHR SEQ ID NO: 125
  • TLDSPLGK SEQ ID NO: 126
  • CD133 accession number O43490
  • ANSLPPGNLR SEQ ID NO: 127
  • SNAT3 accession No. Q99624
  • AYEQLGYR SEQ ID NO: 129
  • SNAT5 accession number Q8WUX1
  • partial sequence IVPSEVEPFLSWPK SEQ ID NO: 131
  • SNAT6 accession number Q8IZM9
  • partial sequence VESELLK SEQ ID NO: 133
  • the like can be exemplified as particularly suitable peptides for quantification.
  • peptides for quantifying a protein that can be a target of the molecular target drug of the present invention include GVWIPEGESIK (SEQ ID NO: 134), LTFQLEPNPHTK (SEQ ID NO: 135), which are partial sequences of HER3 (Accession No. P21860).
  • GTQVYDGK (SEQ ID NO: 136); a partial sequence of FGFR1 (accession number P11362), DDVQSINWLR (SEQ ID NO: 137); a partial sequence of FGFR2 (accession number P21802), DAAVISWTK (SEQ ID NO: 138), TVLIGEYLQIK (SEQ ID NO: 139), EAVTVAVK (SEQ ID NO: 140); VGPDGTPYVTVLK (SEQ ID NO:) which is a partial sequence of FGFR3 (accession number P22607) 41); partial sequences of FGFR4 (accession number P22455), YNYLLLDVLER (SEQ ID NO: 142), VLLAVSEEYLDLR (SEQ ID NO: 143), GGHWYK (SEQ ID NO: 144); RET (accession number P07949), VFLSPTSLR (SEQ ID NO: 145), TLGEGEFFGK (SEQ ID NO: 145
  • EphA6 SEQ ID NO: 156
  • ETFNLYYYESDNDK SEQ ID NO: 157
  • GLNPLTSYVFHVR SEQ ID NO: 158
  • VDSSSLVEVR SEQ ID NO: 160
  • TATGYSGYSQK partial sequence of session number Q9UF33
  • SEQ ID NO: 161 SEQ ID NO: 161
  • FTDIFSFLDK SEQ ID NO: 162
  • partial sequences of EphA7 accession number Q15375
  • FEQIVGILDK SEQ ID NO: 163
  • AFTAAGYGNYSPR SEQ ID NO: 164
  • AVHQFAK SEQ ID NO: 165
  • EphA8 accession) No.
  • B7-H1 (Accession No. Q9NZQ7), partial sequences of LQDAGVYR (SEQ ID NO: 232), NIIQFVHGEEDLK (SEQ ID NO: 233); CD19 (accession number P15391), partial sequences of GTSDGPPTQQLTWSR (SEQ ID NO: 234), LYVWAK (SEQ ID NO: 235H, PPLSW) (SEQ ID NO: 236); partial sequences of CD22 (accession number P20273), VTPSDAIVR (SEQ ID NO: 237), QAAVTSTSLTIK (SEQ ID NO: 238), EVQFFWEEK (SEQ ID NO: 239); CD26 (accession number P27487) VLEDNSALDK (SEQ ID NO: 240), WISDHEYLYK (SEQ ID NO: 241), IISNEEGYR (SEQ ID NO: 242); A partial sequence of D28 (accession number P10747), YSEQ ID NO:
  • LTFDAITTIR SEQ ID NO: 295
  • DLPHITVDR (arrangement), which is a partial sequence of MMP7 (accession number P09237) No. 296); partial sequences of MMP9 (accession number P14780), SLGPALLLLQK (SEQ ID NO: 297), GVVVPTR (SEQ ID NO: 298), QLAEEEYLYR (SEQ ID NO: 299); MT-MMP1 (accession number P50281) VWEGIPEPR (SEQ ID NO: 300), EVPYAYIR (SEQ ID NO: 301), FYGLQVTTGK (SEQ ID NO: 302); VCAM1 (accession number P19320), partial sequences of VCAMSVYPLD (SEQ ID NO: 303), LTAFPSESVK (SEQ ID NO: 304) , NTVISVNPSTK (SEQ ID NO: 305); VSLSSWYHDR (SEQ ID NO: 306), which is
  • a step of fragmenting a protein to be quantified in a sample with trypsin to prepare a peptide fragment of the protein to be quantified; (b) the peptide to be quantified and the peptide to be quantified A step of performing a mass analysis using LC / MS / MS for each predetermined concentration step using a stable isotope-labeled peptide of the same sequence as that in step (c), creating a calibration curve; Adding the stable isotope-labeled peptide, performing mass spectrometry using LC / MS / MS, and calculating a mass spectrum area ratio of the quantified protein peptide / stable isotope-labeled peptide; (d) the area ratio
  • a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer comprising steps (a) to (d) of calculating a quantitative value using a calibration curve from LC / MS / MS) is a method for quantifying a
  • the step of preparing the peptide fragment is not particularly limited as long as it is a step of fragmenting the protein to be quantified in the sample with trypsin to prepare the peptide fragment of the protein to be quantified, but arginine of the protein to be quantified. Since it is possible to efficiently cleave both residues and lysine residues, the protein to be quantified in the sample previously fragmented with lysylendopeptidase may be further fragmented with trypsin. preferable.
  • the step of preparing the peptide fragment can be carried out under standard reaction conditions for protein digestion enzymes.
  • the trypsin reaction conditions are, for example, preferably 30 to 45 ° C.
  • the reaction conditions for lysyl endopeptidase in the step of preparing the peptide fragment are preferably, for example, 1 to 36 hours at room temperature to 45 ° C., and more preferably 3 hours at room temperature to 25 ° C. .
  • the sample used in the method for quantifying the protein of the present invention is not particularly limited, and specifically, a cell, tissue, blood or the like collected from a living body can be preferably exemplified.
  • the peptide to be quantified is not particularly limited as long as it is the peptide of the present invention. Specifically, the amino acid represented by any one of SEQ ID NOs: 1 to 45 for quantifying the target protein of the molecular target drug of the present invention.
  • Preferable examples include peptides consisting of amino acid sequences shown in any of 133, peptides consisting of amino acid sequences shown in any of SEQ ID NOs: 134 to 308 for quantifying proteins that can be targets of molecular target drugs, etc. Can do.
  • the peptide of the present invention can be produced by a general chemical synthesis method.
  • a stepwise erosion method in which each amino acid is sequentially linked one by one to extend the chain, or a fragment consisting of several amino acids is synthesized in advance, and then each fragment is synthesized. Any of the fragment condensation methods for coupling reaction can be employed.
  • the stable isotope labeled peptide of the present invention is a stable isotope in which at least one of the amino acids constituting the unlabeled peptide of the present invention includes any one or more of 15 N, 13 C, 18 O, and 2 H. if the body-labeled peptide, the type of amino acid, position, and number, liquid chromatography - is not particularly limited as long as having a separable mass difference tandem mass spectrometer (LC / MS / MS), among them 13 C It is more preferable to include leucine labeled at 6 positions.
  • Such a stable isotope-labeled peptide can be obtained by an appropriate means such as the F-moc method (Amblard., Et al.
  • the kit of the present invention is not particularly limited as long as it is a kit for quantifying a protein serving as an index for treatment or diagnosis of a disease, characterized by comprising the peptide of the present invention, but is the same as the above-mentioned peptide of the present invention. It is preferable to further comprise a stable isotope labeled peptide consisting of an amino acid sequence.
  • the protein quantification kit of the present invention may further include trypsin or lysyl endopeptidase, a buffer solution, a pH adjuster, a reaction container, and the like according to necessity and purpose.
  • the peptide of the present invention is used as a quantification target peptide for quantifying a protein serving as an index for treatment or diagnosis of a disease by a liquid chromatograph-tandem mass spectrometer (LC / MS / MS).
  • the method of the present invention is not particularly limited, and the peptide of the present invention is used for preparing a calibration curve for quantification, and the stable isotope-labeled peptide consisting of the same amino acid sequence as the peptide of the present invention is calibrated for quantification. Used as line creation and internal standard peptide.
  • the quantification methods described in International Publication No. 2007/055116 pamphlet, JP 2010-197110 A and JP 2010-85103 A (hereinafter, these quantification methods are referred to as “ The “quantitative method in the past” may be collectively referred to as having a criterion for selecting a peptide that can be detected with high sensitivity by a mass spectrometer.
  • quantitative method of the present invention For the purpose of establishing a more sensitive protein quantification method (hereinafter sometimes referred to as “quantitative method of the present invention”) as compared with the conventional quantification method, (1) Experiments were conducted to improve the enzyme treatment process and (2) establish a standard for selecting peptides that can be reliably separated by liquid chromatography as peptides to be quantified.
  • Lys-C lysyl endopeptidase
  • ntcp and mct1 proteins expressed on the cell membrane was digested with trypsin alone and with Lys-C. After digestion for 3 hours, comparison was made with the case of digestion with trypsin for 16 hours.
  • the reaction conditions for trypsin and Lys-C are as follows.
  • FIGS. 3 and 4 The results are shown in FIGS. 3 and 4, respectively. As shown in FIGS. 3 and 4, it is clear that the digestion efficiency of both ntcp and mct1 proteins is significantly increased when digested with trypsin after Lys-C digestion compared to trypsin alone. It became.
  • a cell membrane fraction was prepared by ultracentrifugation and sucrose density gradient centrifugation. The cell membrane fraction was digested with trypsin for 16 hours, and after digestion with Lys-C for 3 hours with trypsin.
  • ntcp has a quantitative value of 3.72 when digested with trypsin alone, whereas it has a quantitative value of 26.2 when digested with trypsin after Lys-C digestion. A difference of 7 times was observed. From the above, it was revealed that more accurate quantitative values can be obtained by digestion with Lys-C before digestion with trypsin.
  • FVSPLSWDLVGR (SEQ ID NO: 309) LGGNPLFR (SEQ ID NO: 310) VPLLAVDR (SEQ ID NO: 311) VLPTLLDSR (SEQ ID NO: 312) NAVVPIK (SEQ ID NO: 313) TNTFPDLFSLDDK (SEQ ID NO: 314) QFQSPLR (SEQ ID NO: 315) LFPQAAR (SEQ ID NO: 316) DGHGDSPLFFLK (SEQ ID NO: 317) LLAIPIPDNR (SEQ ID NO: 318) FHPQNLPADGFK (SEQ ID NO: 319) NTTGALTTR (SEQ ID NO: 320) IATEAIENIR (SEQ ID NO: 321) SADLIVTLK (SEQ ID NO: 322) STALQLIQR (SEQ ID NO: 323) TPSGNLVNR (SEQ ID NO: 324) QLLNNILR (SEQ ID NO: 310) VPLLAVDR (SEQ ID NO: 311) VLPTLLDSR (SEQ
  • the criteria for selecting the peptide to be measured in the conventional quantification method were added with the criteria relating to the elution time of the peptide to select the peptide to be quantified.
  • a peptide with improved measurement sensitivity is shown in FIG. ABCA9, NET, xCT, BOIT (BOCT), MDR1, CYP2C8, and CYP2B6 have greatly increased sensitivity compared to the conventional measurement method, and all the quantification target peptide fragments examined were detected at a concentration of 10 fmol.
  • the amino acid sequence of the peptide to be quantified used for measurement here is as follows.
  • ABCA9 LFPQAAQQER (SEQ ID NO: 380)
  • NET FTPAEFYER (SEQ ID NO: 381) xCT: GGYLQGNVNGR (SEQ ID NO: 382) BOIT (BOCT): QPPPTR (SEQ ID NO: 383) MDR1: FYDPLAGK (SEQ ID NO: 384)
  • CYP2C8 EHQASLDVNNPR (SEQ ID NO: 385)
  • CYP2B6 GYIIPK (SEQ ID NO: 386)
  • the state of tissue crushing is confirmed with a microscope. If the cells are not sufficiently disrupted, the disrupted tissue suspension is treated with nitrogen gas cell disruption. The cells were transferred to a vessel and disrupted by the nitrogen cavitation method (450 psi, 15 minutes, 4 ° C.).
  • the obtained whole tissue lysate was centrifuged (10,000 g, 10 minutes, 4 ° C.), the supernatant was collected, and the debris fraction was removed. The obtained supernatant was further ultracentrifuged (100,000 g, 40 minutes, 4 ° C.), and the pellet was collected. This pellet was suspended in an ice-cooled suspension buffer [250 mM sucrose (8.56% sucrose), 10 mM Tris-HCl, pH 7.4]. The prepared suspension was layered on a 38% sucrose solution (10 mM Tris-HCl, pH 7.4), and ultracentrifuged (100,000 g, 40 minutes, 4 ° C.) to recover the intermediate layer.
  • This intermediate layer was again subjected to ultracentrifugation (100,000 g, 40 minutes, 4 ° C.), and the resulting pellet was used as a cell membrane fraction.
  • the collected cell membrane fraction was suspended in an ice-cooled suspension buffer [250 mM sucrose (8.56% sucrose), 10 mM Tris-HCl, pH 7.4].
  • the protein sample obtained by the methanol-chloroform precipitation treatment is dissolved in 6M urea (0.1M Tris-HCl, pH 8.5), and 0.1M Tris is prepared so that the final concentration of urea is 1.2M.
  • -HCl pH 8.5
  • 1% ProteaseMAX TM Surfactant manufactured by Promega
  • lysyl endopeptidase having an amount of 1/100 of the protein contained therein was added, followed by enzyme treatment at room temperature for 3 hours. After treatment with lysyl endopeptidase, trypsin in an amount of 1/100 of the protein amount was further added, followed by enzyme treatment at 37 ° C. for 16 hours.
  • HPLC liquid chromatograph part
  • Mobile phase mobile phase A consisting of 0.1% formic acid / milli-Q water
  • mobile phase B consisting of 0.1% formic acid / acetonitrile
  • Flow rate 50 ⁇ L / min for 0-60 minutes, 100 ⁇ L / min for 60-90 minutes
  • Concentration gradient 99/1 (mobile phase A / mobile phase B) from 0 to 5 minutes, 99/1 (mobile phase A / mobile phase B) to 50/50 (mobile phase A / mobile) from 5 minutes to 55 minutes Phase B), 100% mobile phase B for 56-58 minutes, 99/1 for 60-90 minutes (mobile phase A / mobile phase B);
  • MS / MS ESI-Triple Quadrupole Mass Spectrometer (QTRAP5500; manufactured by AB
  • the upper right figure of FIG. 12 shows the quantification result by the protein quantification method using LC / MS / MS of the present invention.
  • the molecular target drug sunitinib that inhibits PDGFR ⁇ was administered to the female patient under the conditions of 1 course of 12.5 mg ⁇ 2 times / day for 28 days.
  • Two weeks after the start MRI findings that were thought to be internal necrosis of contrast lesions including the primary lesion and the disseminated lesion were obtained.
  • results are shown in the lower panel of FIG.
  • an expression level of a target protein of a molecular target drug in a specimen is analyzed using the quantification method of the present invention, and a difficult-to-control tumor whose MIB1 index is 60% or more based on the obtained data Even so, tumor growth could be controlled.

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Abstract

　疾患の診断又は治療のための指標となるタンパク質を一斉に定量することができる、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いた高感度なタンパク質の定量方法を提供することを課題とし、被定量タンパク質のペプチド断片を調製する工程において、試料中の被定量タンパク質を、リシルエンドペプチダーゼを用いて断片化した後に、さらに、トリプシンを用いて断片化する。また、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）の液体クロマトグラフ部において３０～７０分の間に溶出されるペプチドを同定し、該ペプチドを定量対象ペプチドとして用いることにより解決しようとする。

Description

個別化治療診断のためのマーカータンパク質絶対量の定量方法
　本発明は、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）よる、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質の定量に用いるペプチドや、該ペプチドの選定方法や、前記ペプチドを用いた定量方法等に関する。
　近年、ヒトゲノム計画の進展により、薬剤に対する感受性の個人差を遺伝子レベルで解析して医薬の開発に応用する、薬理ゲノミクスに関する研究が盛んに行われている。薬剤に対する感受性の個人差を診断できるようになれば、試行錯誤的な投薬を実施することなく、治療の初期から適切な投薬が可能な、いわゆる個別化治療が可能となる。特に、がん治療の分野においては、従来の抗がん剤と比較して副作用の少ない分子標的薬が盛んに開発されており、臨床現場においても使用されるようになってきている（例えば、特許文献１参照）。分子標的薬は標的となるタンパク質に特異的に作用する薬剤であるため、個々の患者におけるタンパク質発現量のプロファイルを解析し、どのような標的タンパク質が高発現しているかを知ることができれば、適切な個別化治療を計画／実施することが可能となると考えられている。
　しかし、現在、臨床現場において主に使用されている検査法は、単一のタンパク質を検出することを目的としたものであり、多数の異なるタンパク質を同時に検出することはできない。さらに、前記検査法の多くは抗体を用いたものであるため、交差反応等のため特異的な定量検査を行うことが困難であり（例えば、非特許文献１、２参照）、また、タンパク質ごとに異なる抗体を使用しなければならないことから、多数のタンパク質を検出するためには莫大な手間と費用がかかる。このような問題を解決するために、最近、マイクロアレイ遺伝子発現分析法の開発が進み、様々な種類のＲＮＡ発現を一度に定量することが可能な遺伝子発現検査方法が確立されてきている。（例えば、非特許文献３～６参照）。しかし、分子標的薬の標的タンパク質の多くは細胞膜上に発現する膜タンパク質であり、膜タンパク質発現量とＲＮＡ発現量との相関性は極めて悪いことから、マイクロアレイ解析により得られたＲＮＡ発現プロファイルが、必ずしも患者のタンパク質発現プロファイルと一致するとは考えられていない。以上のことから、マイクロアレイ解析の結果に基づいて、分子標的薬による個別化治療を行うことは困難であり、実際に発現しているタンパク質を、網羅的に定量することが可能な検査方法を確立することが強く求められている。
　近年、質量分析法（mass spectrometry）の進展がめざましく、種々の生物学材料の検出や測定にこの方法が応用されている。これまでに、エレクトロスプレー・イオン化法による質量分析計（mass spectrometer；ＭＳ）や、質量分析計の前に液体クロマトグラフ（liquid chromatograph；ＬＣ）部を連結した液体クロマトグラフ－質量分析計（ＬＣ／ＭＳ）や、直列に接続された２台の質量分析計からなるタンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）や、タンデム質量分析計の前に液体クロマトグラフ部を連結した液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）等、種々の機能をもつ質量分析計が開発されており、生物学材料の測定、定量に広く利用されている（例えば、特許文献２～４参照）。
　質量分析計を用いたタンパク質の定量を正確に行うためには、被定量タンパク質を酵素処理することによって断片化し、断片化されたペプチドの中から、質量分析計による解析に適した性質を有するペプチド断片を選択して定量することが重要であると考えられている。特許文献５～７において、発明者らは、既にＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて膜タンパク質及び代謝酵素の絶対発現量を一斉定量する方法を確立しており、その中で、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量に適した、イオン化効率の高い定量対象ペプチドを選択するためのクライテリアを示している。しかし、特許文献５～７には、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの液体クロマトグラフ部において、確実に分離されたペプチドのみを選択するためのクライテリアは示されていない。また、非特許文献７には、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの液体クロマトグラフ部における保持時間（retention times）予測モデルから、リン酸化ペプチドと非リン酸化ペプチドの保持時間を予測し、タンパク質定量の精度を高めることが可能であることが示唆されている。しかし、分子標的薬の標的タンパク質や、一般診断において診断対象となるタンパク質等の測定に、保持時間予測モデルが利用できるかどうかについては何ら示唆されていない。
特開２００３－１９２６０３号公報 特開２００４－２８９９３号公報 特開２００４－７７２７６号公報 特表２００４－５３３６１０号公報 国際公開第２００７／０５５１１６号パンフレット 特開２０１０－１９７１１０号公報 特開２０１０－８５１０３号公報
Baron et al., Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, 10: 1175-1185 (2001) Michaud et al., Nature Biotechnology, 21: 1509-1512 (2003) Golub et al., Science 286: 531-537 (1999) Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 13790-13795 (2001) Chen-Hsiang et al., Bioinformatics 17 (Suppl.1): S316-S322 (2001) Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 15149-15154(2001) Perlova et al., Proteomics, 10: 3458-3468 (2010)
　発明の課題は、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を一斉に定量することができる、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた高感度なタンパク質の定量方法を提供することにある。
　本発明者らは、前記課題を解決すべく鋭意検討する中で、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの液体クロマトグラフ部において、適切に分離されたペプチドのみを定量対象ペプチドとして選択することにより、特許文献５等に記載の定量方法の精度をさらに改善させることができ、より感度の高い定量を行うことが可能であると考えた。そして、本発明者らは、様々なペプチド断片を用いた実験を行った結果、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳの液体クロマトグラフ部において３５～６０分の間に溶出されるペプチドを定量対象ペプチドとして選択することにより、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量の感度が上がることを見い出した。次に、本発明者らは、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量するための定量対象ペプチドとして、前記の溶出時間に関するクライテリア、及び特許文献５等に記載のクライテリアを満たすペプチドの同定を試みた。そして、溶出時間を予測するための各アミノ酸に対するパラメータを既知のペプチド溶出位置データから導き出し、該パラメータを用いて、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質のアミノ酸配列の中から、前記のクライテリアを満たすペプチドを検索した結果、配列番号１～３０９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを定量対象ペプチドとして同定するに至り、本発明を完成した。
　すなわち本発明は、［１］液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量するために用いるペプチドであって、以下の工程［Ａ］及び［Ｂ］により選択されることを特徴とするペプチドに関する。
［Ａ］以下の必須クライテリア（１）～（３）を満たすペプチドを選択する工程；
　　（１）前記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質をトリプシンにより断片化することにより得られるペプチドであること；
　　（２）前記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなるペプチドであること； 
　　（３）各アミノ酸における溶出時間パラメータを設定し、該溶出時間パラメータに基づいて、以下の条件（ｉ）～（ｖ）の液体クロマトグラフィによる予測溶出時間を算定したとき、該予測溶出時間が３０～７０分の範囲内であるペプチドであること； 
　　　　（ｉ）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００　ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；
　　　　（ii）カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　ＢＥＨ１３０　Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；
　　　　（iii）移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；
　　　　（iv）流速：０～６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０～９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；
　　　　（ｖ）濃度勾配：０分～５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分～５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６～５８分では１００％移動相Ｂ、６０～９０分にでは９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；
［Ｂ］以下の選択クライテリア（４）～（１５）に基づいてスコア合計値を算定し、該スコア合計値の高いペプチドを優先的に選択する工程；
　　（４）トリプトファン、チロシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニンから選択される疎水アミノ酸の含量が８０％以下であり、且つ、前記疎水アミノ酸が１０アミノ酸以上連続しないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（５）アミノ酸残基数が４～３０のペプチドである場合、スコア３を付与する；
　　（６）タンパク質データベースのアノテーション情報において、糖鎖付加されないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（７）翻訳後修飾タンパク質を定量する場合を除き、翻訳後修飾部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（８）１塩基多型（ＳＮＰ）部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（９）タンパク質分解酵素切断部がアルギニン－アルギニン、アルギニン－リジン、リジン－アルギニン、リジン－リジンではないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（１０）タンパク質の構造が決定又は予測されている場合に、膜貫通領域を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（１１）メチオニン、システインを含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（１２）トリプトファンを含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；
　　（１３）グルタミン酸を含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；
　　（１４）ヒスチジンを含まないペプチドである場合、スコア２を付与する；　　（１５）プロリンを含むペプチドである場合、スコア２を付与する；
　また本発明は、［２］配列番号１～３０８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする上記［１］記載のペプチドや、［３］選択クライテリア（３）の予測溶出時間が４０～６０分であることを特徴とする上記［１］又は［２］記載のペプチドや、［４］選択クライテリア（４）の疎水アミノ酸の含量が５０％以下であり、且つ、選択クライテリア（５）のアミノ酸残基数が６～１６のペプチドであることを特徴とする上記［１］～［３］のいずれか記載のペプチドに関する。
　また本発明は、［５］液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量するために用いるペプチドの選定方法であって、以下の工程［Ａ］及び［Ｂ］により選択されることを特徴とする方法に関する。
［Ａ］以下の必須クライテリア（１）～（３）を満たすペプチドを選択する工程；
　　（１）前記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質をトリプシンにより断片化することにより得られるペプチドであること；
　　（２）前記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなるペプチドであること； 
　　（３）各アミノ酸における溶出時間パラメータを設定し、該溶出時間パラメータに基づいて、以下の条件（ｉ）～（ｖ）の液体クロマトグラフィによる予測溶出時間を算定したとき、該予測溶出時間が３０～７０分の範囲内であるペプチドであること； 
　　　　（ｉ）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００　ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；
　　　　（ii）カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　ＢＥＨ１３０　Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；
　　　　（iii）移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；
　　　　（iv）流速：０～６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０～９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；
　　　　（ｖ）濃度勾配：０分～５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分～５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６～５８分では１００％移動相Ｂ、６０～９０分にでは９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；
［Ｂ］以下の選択クライテリア（４）～（１５）に基づいてスコア合計値を算定し、該スコア合計値の高いペプチドを優先的に選択する工程；
　　（４）トリプトファン、チロシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニンから選択される疎水アミノ酸の含量が８０％以下であり、且つ、前記疎水アミノ酸が１０アミノ酸以上連続しないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（５）アミノ酸残基数が４～３０のペプチドである場合、スコア３を付与する；
　　（６）タンパク質データベースのアノテーション情報において、糖鎖付加されないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（７）翻訳後修飾タンパク質を定量する場合を除き、翻訳後修飾部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（８）１塩基多型（ＳＮＰ）部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（９）タンパク質分解酵素切断部がアルギニン－アルギニン、アルギニン－リジン、リジン－アルギニン、リジン－リジンではないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（１０）タンパク質の構造が決定又は予測されている場合に、膜貫通領域を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（１１）メチオニン、システインを含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
　　（１２）トリプトファンを含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；
　　（１３）グルタミン酸を含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；
　　（１４）ヒスチジンを含まないペプチドである場合、スコア２を付与する；
　　（１５）プロリンを含むペプチドである場合、スコア２を付与する； 
　また本発明は、［６］選択クライテリア（３）の予測溶出時間が４０～６０分であることを特徴とする上記［５］記載の方法や、［７］選択クライテリア（４）の疎水アミノ酸の含量が５０％以下であり、且つ、選択クライテリア（５）のアミノ酸残基数が６～１６のペプチドであることを特徴とする上記［５］又は［６］記載の方法に関する。
　また本発明は、［８］以下の工程（ａ）～（ｄ）を備えた、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量する方法であって、定量対象ペプチドが、上記［１］～［４］のいずれか記載のペプチドであることを特徴とする方法に関する。
（ａ）試料中の被定量タンパク質をトリプシンによって断片化し、被定量タンパク質のペプチド断片を調製する工程；
（ｂ）前記定量対象ペプチド、及び前記定量対象ペプチドと同配列の安定同位体標識ペプチドを用いて、それぞれの所定濃度段階に対するＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、検量線を作成する工程；
（ｃ）前記被定量タンパク質のペプチド断片に、前記安定同位体標識ペプチドを添加してＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、被定量タンパク質ペプチド／安定同位体標識ペプチドのマススペクトル面積比を算出する工程；
（ｄ）該面積比から検量線を用いて定量値を算出する工程；
　本発明はまた、［９］ペプチド断片を調製する工程が、あらかじめリシルエンドペプチダーゼを用いて断片化した試料中の被定量タンパク質を、さらにトリプシンを用いて断片化する工程であることを特徴とする上記［８］記載の方法や、［１０］試料が、生体から採取された細胞、組織、又は血液であることを特徴とする上記［８］又は［９］記載の方法に関する。
　本発明はさらに、［１１］上記［１］～［４］のいずれか記載のペプチドを備えることを特徴とする、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量するためのキットに関する。
　本発明のタンパク質の定量方法により、従来法では困難であった様々な種類の疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質の定量を、簡便、且つ迅速に、精度よく行うことが可能となる（図１）。本発明のタンパク質の定量方法を用いることによって、患者から採取されたわずかな試料から、個々の患者におけるタンパク質発現量のプロファイルを解析することでき、疾患の個別化治療を行う上で極めて有用な知見を提供することができる。
本発明のタンパク質診断を用いた分子標的薬によるがん個別化治療の概要を示す図である。 本発明のタンパク質酵素処理工程の概要を示す図である。図中、Ｋはリシン残基を、Ｒはアルギニン残基を示す。 ｎｔｃｐタンパク質を、トリプシン単独により消化した場合と、リシンエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ－Ｃ）とトリプシンを組み合わせて消化した場合の、消化率の経時的な変化を示す図である。縦軸はトリプシンによる消化率（％）を、横軸はトリプシン消化時間（ｈｒ）を示す。また、グラフ中の、－◆－はＬｙｓ－Ｃによる３時間の消化後にトリプシン消化した場合の消化率を、…●…はトリプシンのみで消化した場合の消化率をそれぞれ示す。 ｍｃｔ１タンパク質を、トリプシン単独により消化した場合と、リシンエンドペプチダーゼ（Ｌｙｓ－Ｃ）とトリプシンを組み合わせて消化した場合の、消化率の経時的な変化を示す図である。縦軸はトリプシンによる消化率（％）を、横軸はトリプシン消化時間（ｈｒ）を示す。また、グラフ中の、－◆－はＬｙｓ－Ｃによる３時間の消化後にトリプシン消化した場合の消化率を、…●…はトリプシンのみで消化した場合の消化率をそれぞれ示す。 ４Ｆ２ｈｃ、ｍｒｐ６、ａｂｃｇ５、ａｂｃｇ８、ｏａｔｐ１、ｍｃｔ１、ｂｓｅｐ、ｎｔｃｐ、ｇｌｕｔ１、ｂｇｔ１、及びＮａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅを、トリプシン単独で１６時間消化した場合と、Ｌｙｓ－Ｃによる３時間の消化後にトリプシンで消化した場合とでは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量値が変化することを示す図である。 本発明の溶出位置予測パラメータにより予測された、配列番号３０９～３７９に示されるアミノ酸配列からなるペプチドの予測溶出時間と、実測溶出時間との相関を示す図である。図の縦軸は実測溶出時間（分）を、横軸は溶出予測パラメータ（分）を示す。 本発明のＨＰＬＣ又はｎａｎｏＬＣによるペプチドの分離と予測溶出時間の関連について示した図である。 本発明の溶出位置予測を選択基準に加えることによって、測定感度が改善されたタンパク質を示す図である。ＡＢＣＡ９、ＮＥＴ、ｘＣＴ、ＢＯＩＴ（ＢＯＣＴ）、ＭＤＲ１、ＣＹＰ２Ｃ８、及びＣＹＰ２Ｂ６の定量には、配列番号３８０～３８６に示されるアミノ酸配列からなるペプチドを用いた。 分子標的薬の標的タンパク質について示した図である。 分子標的薬の標的タンパク質を、本発明の高感度定量方法によって定量した結果を示す図である。 脳腫瘍検体細胞膜分画におけるヒト分子標的薬の標的タンパク質を、本発明の高感度定量方法によって定量した結果を示す図である。 本発明のタンパク質を定量する方法による分子標的薬の脳腫瘍個別化治療について示す図である。
　本発明のペプチドとしては、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量するために用いるペプチドであって、
［Ａ］（１）上記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質をトリプシンにより断片化することにより得られるペプチドであること；（２）上記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなるペプチドであること；（３）各アミノ酸における溶出時間パラメータを設定し、該溶出時間パラメータに基づいて、（ｉ）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００　ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；（ii）カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　ＢＥＨ１３０　Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；（iii）移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；（iv）流速：０～６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０～９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；（ｖ）濃度勾配：０分～５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分～５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６～５８分では１００％移動相Ｂ、６０～９０分にでは９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；の（ｉ）～（ｖ）の条件からなる液体クロマトグラフィによる予測溶出時間を算定したとき、該予測溶出時間が３０～７０分の範囲内であるペプチドであること；の（１）～（３）からなる必須クライテリアを満たすペプチドを選択する工程；及び
［Ｂ］（４）トリプトファン、チロシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニンから選択される疎水アミノ酸の含量が８０％以下であり、且つ、前記疎水アミノ酸が１０アミノ酸以上連続しないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（５）アミノ酸残基数が４～３０のペプチドである場合、スコア３を付与する；（６）タンパク質データベースのアノテーション情報において、糖鎖付加されないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（７）翻訳後修飾タンパク質を定量する場合を除き、翻訳後修飾部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（８）１塩基多型（ＳＮＰ）部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（９）タンパク質分解酵素切断部がアルギニン－アルギニン、アルギニン－リジン、リジン－アルギニン、リジン－リジンではないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（１０）タンパク質の構造が決定又は予測されている場合に、膜貫通領域を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（１１）メチオニン、システインを含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（１２）トリプトファンを含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；（１３）グルタミン酸を含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；（１４）ヒスチジンを含まないペプチドである場合、スコア２を付与する；（１５）プロリンを含むペプチドである場合、スコア２を付与する；の（４）～（１５）からなる選択クライテリアに基づいてスコア合計値を算定し、該スコア合計値の高いペプチドを優先的に選択する工程；により選択されるペプチドであれば特に制限されず、また、本発明のペプチドの選定方法としては、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量するために用いるペプチドの選定方法であって、
［Ａ］（１）上記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質をトリプシンにより断片化することにより得られるペプチドであること；（２）上記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなるペプチドであること；（３）各アミノ酸における溶出時間パラメータを設定し、該溶出時間パラメータに基づいて、（ｉ）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００　ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；（ii）カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　ＢＥＨ１３０　Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；（iii）移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；（iv）流速：０～６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０～９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；（ｖ）濃度勾配：０分～５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分～５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６～５８分では１００％移動相Ｂ、６０～９０分にでは９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；の（ｉ）～（ｖ）の条件からなる液体クロマトグラフィによる予測溶出時間を算定したとき、該予測溶出時間が３０～７０分の範囲内であるペプチドであること；の（１）～（３）からなる必須クライテリアを満たすペプチドを選択する工程；及び
［Ｂ］（４）トリプトファン、チロシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニンから選択される疎水アミノ酸の含量が８０％以下であり、且つ、前記疎水アミノ酸が１０アミノ酸以上連続しないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（５）アミノ酸残基数が４～３０のペプチドである場合、スコア３を付与する；（６）タンパク質データベースのアノテーション情報において、糖鎖付加されないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（７）翻訳後修飾タンパク質を定量する場合を除き、翻訳後修飾部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（８）１塩基多型（ＳＮＰ）部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（９）タンパク質分解酵素切断部がアルギニン－アルギニン、アルギニン－リジン、リジン－アルギニン、リジン－リジンではないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（１０）タンパク質の構造が決定又は予測されている場合に、膜貫通領域を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（１１）メチオニン、システインを含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；（１２）トリプトファンを含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；（１３）グルタミン酸を含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；（１４）ヒスチジンを含まないペプチドである場合、スコア２を付与する；（１５）プロリンを含むペプチドである場合、スコア２を付与する；の（４）～（１５）からなる選択クライテリアに基づいてスコア合計値を算定し、該スコア合計値の高いペプチドを優先的に選択する工程；により選択されるペプチドの選定方法であれば特に制限されず、前記選択クライテリア（４）において、疎水アミノ酸の含量が５０％以下であり、且つ、前記選択クライテリア（５）において、アミノ酸残基数が６～１６のペプチドであることがより好ましい。前記本発明の「疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質をトリプシンにより断片化することにより得られるペプチド」には、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を、実際にトリプシンにより断片化して得られたペプチドの他、かかるペプチドと同じアミノ酸配列を有する合成ペプチドも含まれる。また、前記選択クライテリア（６）における、タンパク質データベースとしては、Protein Information Resource（ＰＩＲ）、ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴ＆ＴｒＥＭＢＬ、Protein Research Foundation（ＰＲＦ）、NCBI Protein Database、UniProt(http://www.uniprot.org/)等の公知のタンパク質データベースであれば特に制限されないが、中でも、NCBI Protein DatabaseやUniProt（http://www.uniprot.org/）であることが好ましい。前記選択クライテリア（６）における、「タンパク質データベースのアノテーション情報において、糖鎖付加されないペプチド」としては、具体的には、アスパラギン－Ｘ－セリン、アスパラギン－Ｘ－スレオニン、又は、アスパラギン－Ｘ－システインの配列を含まないペプチドであって、前記Ｘがプロリン以外のアミノ酸であるペプチド等を好適に例示することができる。
　前記必須クライテリア（３）における、各アミノ酸における溶出時間パラメータとしては、既知のアミノ酸配列からなるペプチド断片を、（ｉ）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００　ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；（ii）カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　ＢＥＨ１３０　Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；（iii）移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；（iv）流速：０～６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０～９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；（ｖ）濃度勾配：０分～５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分～５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６～５８分では１００％移動相Ｂ、６０～９０分にでは９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；の（ｉ）～（ｖ）の条件からなる液体クロマトグラフィにより分離することにより得られる溶出時間データに基づいて設定されたものであれば特に制限されないが、より具体的には、例えば、アラニン（Ａ）の溶出時間パラメータとしては－０．６７２を、システイン（Ｃ）の溶出時間パラメータとしては＋１を、アスパラギン酸（Ｄ）の溶出時間パラメータとしては＋０．７６９を、グルタミン酸（Ｅ）の溶出時間パラメータとしては＋０．０８１を、フェニルアラニン（Ｆ）の溶出時間パラメータとしては＋１６．３０９を、グリシン（Ｇ）の溶出時間パラメータとしては－０．２５１を、ヒスチジン（Ｈ）の溶出時間パラメータとしては－２．９９５を、イソロイシン（Ｉ）の溶出時間パラメータとしては＋７．７６３を、リジン（Ｋ）の溶出時間パラメータとしては－３．２０１を、ロイシン（Ｌ）の溶出時間パラメータとしては＋１０．４６８を、メチオニン（Ｍ）の溶出時間パラメータとしては＋８．３１３を、アスパラギン（Ｎ）の溶出時間パラメータとしては－１を、プロリン（Ｐ）の溶出時間パラメータとしては＋２．１９５を、グルタミン（Ｑ）の溶出時間パラメータとしては－１を、アルギニン（Ｒ）の溶出時間パラメータとしては－０．０１３を、セリン（Ｓ）の溶出時間パラメータとしては－２．１８１を、トレオニン（Ｔ）の溶出時間パラメータとしては＋４．２１５を、バリン（Ｖ）の溶出時間パラメータとしては＋６．４２２を、トリプトファン（Ｗ）の溶出時間パラメータとしては＋１８．６５を、チロシン（Ｙ）の溶出時間パラメータとしては＋７．３７を好適に挙げることができる。上記（ｉ）～（ｖ）の条件からなる液体クロマトグラフィによるペプチドの溶出時間は、これらの各アミノ酸の溶出時間パラメータに基づいて算出することができる。
　また、前記必須クライテリア（３）において、「予測溶出時間が３０～７０分の範囲内であるペプチド」とは、前記各アミノ酸における溶出時間パラメータに基づいて、（ｉ）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００　ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；（ii）カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　ＢＥＨ１３０　Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；（iii）移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；（iv）流速：０～６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０～９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；（ｖ）濃度勾配：０分～５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分～５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６～５８分では１００％移動相Ｂ、６０～９０分にでは９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；の条件（ｉ）～（ｖ）の液体クロマトグラフィによる溶出時間を算出したときに、３０～７０分の範囲内で溶出されると予測されるペプチドを意味し、ここで「溶出時間」とは、液体クロマトグラフに導入してから流出してくるまでに掛かる時間、すなわち、液体クロマトグラフィ用カラムにおける保持時間を意味する。また、上記本発明のペプチドの予測溶出時間は、３０～７０分の範囲内であれば特に制限されず、例えば、３０～６５分、３０～６０分、３５～７０分、３５～６５分、３５～６０分、４０～７０分、４０～６５分、４０～６０分などであってもよいが、４０～６０分であることが好ましい。
　本発明において、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質としては、特に制限されないが、具体的には、例えば、分子標的薬の標的タンパク質である、ＰＤＧＦＲα（アクセッションナンバーＰ１６２３４）、ＰＤＧＦＲβ（アクセッションナンバーＰ０９６１９）、ＥＧＦＲ（アクセッションナンバーＰ００５３３）、ＥＧＦＲ－ｖａｒｉａｎｔ（アクセッションナンバーＰ００５３３）、ＥＲＢＢ２（アクセッションナンバーＰ０４６２６）、ＶＥＧＦＲ１（アクセッションナンバーＰ１７９４８）、ＶＥＧＦＲ２（アクセッションナンバーＰ３５９６８）、ＶＥＧＦＲ３（アクセッションナンバーＰ３５９１６）、ＭＥＴ（アクセッションナンバーｓｐ＿Ｐ０８５８１）、ＩＧＦＲ（アクセッションナンバーＰ０８０６９）、ＣＤ３３（アクセッションナンバーＰ２０１３８）、ＣＤ３７（アクセッションナンバーＰ１１０４９）、ｃ－ｋｉｔ（アクセッションナンバーＰ１０７２１）、ＦＬＴ３（アクセッションナンバーＰ３６８８８）、ｍＴＯＲ（アクセッションナンバーＰ４２３４５）や、一般診断において診断対象となるタンパク質である、血清アミラーゼ（アクセッションナンバーＰ０４７４５、Ｐ０４７４６、Ｐ１９９６１）、Ａｐｏ－Ａ１（アクセッションナンバーＰ０２６４７）、Ａｐｏ－Ａ２（アクセッションナンバーＰ０２６５２）、Ａｐｏ－Ｂ（４８＋１００）（アクセッションナンバーＰ０４１１４）、Ａｐｏ－Ｂ１００（アクセッションナンバーＰ０４１１４）、Ａｐｏ－Ｃ２（アクセッションナンバーＰ０２６５５）、ＡｐｏＣ３（アクセッションナンバーＰ０２６５６）、Ａｐｏ－Ｅ（アクセッションナンバーＰ０２６４９）、ＧＯＴ（細胞質）（アクセッションナンバーＰ１７１７４）、ＧＯＴ（ミトコンドリア）（アクセッションナンバーＰ００５０５）、ＧＰＴ（アクセッションナンバーＱ８ＴＤ３０）、ＬＤＨ＿Ｍ（アクセッションナンバーＰ００３３８）、ＬＤＨ＿Ｈ（アクセッションナンバーＰ０７１９５）、ＡＬＰ（アクセッションナンバーＰ０５１８６）、ｇ－ＧＴＰ（アクセッションナンバーＰ１９４４０、Ｐ３６２６８、Ａ６ＮＧＵ５）、ＺＴＴ（アクセッションナンバーＰ０１８５７）、ＣＨＥ（アクセッションナンバーＰ０６２７６）、ＣＥＡ（アクセッションナンバーＰ０６７３１）、ＰＳＡ（アクセッションナンバーＰ０７２８８）、ＣＡ１２５（アクセッションナンバーＱ８ＷＸＩ７）、ＣＡ１５－３（アクセッションナンバーＰ１５９４１）、ＣＹＦＲＡ（アクセッションナンバーＰ０８７２７）、ＰＩＶＫＡ－II（アクセッションナンバーＰ００７３４）、血清ＨＥＲ２タンパク質（アクセッションナンバーＰ０４６２６）、ＣＲＰ（アクセッションナンバーＰ０２７４１）、ＡＦＰ（アクセッションナンバーＰ０２７７１）、ＳＣＣＡ１（アクセッションナンバーＰ２９５０８）、ＳＣＣＡ２（アクセッションナンバーＰ４８５９４）、ＮＳＥ（アクセッションナンバーＰ０９１０４）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ＿Ｈ（アクセッションナンバーＰ０２７９４）、ｆｅｒｒｉｔｉｎ＿Ｌ（アクセッションナンバーＰ０２７９２）、ｅｌａｓｔａｓｅ１（アクセッションナンバーＱ１４２３７）、Ｐｒｏ－ＧＲＰ（アクセッションナンバーＰ０７４９２）、ＰＡＰ（アクセッションナンバーＰ１５３０９）や、腫瘍関連マーカータンパク質であるＶｉｍｅｎｔｉｎ（アクセッションナンバーＰ０８６７０）、Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（アクセッションナンバーＰ０７１９７）、Ｎｅｓｔｉｎ（アクセッションナンバーＰ４８６８１）、Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（アクセッションナンバーＯ１４７４６）、ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ（アクセッションナンバーＰ３５２２２）、Ｃ－ＭＹＣ（アクセッションナンバーＰ０１１０６）、Ｎ－ＭＹＣ（アクセッションナンバーＰ０４１９８）、ＧＳＴＰ１（アクセッションナンバーＰ０９２１１）、ＭＧＭＴ（アクセッションナンバーＰ１６４５５）、ＣＤ１３３（アクセッションナンバーＯ４３４９０）、ＳＮＡＴ３（アクセッションナンバーＱ９９６２４）、ＳＮＡＴ５（アクセッションナンバーＱ８ＷＵＸ１）、ＳＮＡＴ６（アクセッションナンバーＱ８ＩＺＭ９）や、分子標的薬の標的となり得るタンパク質である、ＨＥＲ３（アクセッションナンバーＰ２１８６０）、ＦＧＦＲ１（アクセッションナンバーＰ１１３６２）、ＦＧＦＲ２（アクセッションナンバーＰ２１８０２）、ＦＧＦＲ３（アクセッションナンバーＰ２２６０７）、ＦＧＦＲ４（アクセッションナンバーＰ２２４５５）、ＲＥＴ（アクセッションナンバーＰ０７９４９）、ＥｐｈＡ１（アクセッションナンバーＰ２１７０９）、ＥｐｈＡ２（アクセッションナンバーＰ２９３１７）、ＥｐｈＡ３（アクセッションナンバーＰ２９３２０）、ＥｐｈＡ４（アクセッションナンバーＰ５４７６４）、ＥｐｈＡ５（アクセッションナンバーＰ５４７５６）、ＥｐｈＡ６（アクセッションナンバーＱ９ＵＦ３３）、ＥｐｈＡ７（アクセッションナンバーＱ１５３７５）、ＥｐｈＡ８（アクセッションナンバーＰ２９３２２）、ＥｐｈＡ１０（アクセッションナンバーＱ５ＪＺＹ３）、ＥｐｈＢ１（アクセッションナンバーＰ５４７６２）、ＥｐｈＢ２（アクセッションナンバーＰ２９３２３）、ＥｐｈＢ３（アクセッションナンバーＰ５４７５３）、ＥｐｈＢ４（アクセッションナンバーＰ５４７６０）、ＥｐｈＢ６（アクセッションナンバーＯ１５１９７）、ＡＫＴ１（アクセッションナンバーＰ３１７４９）、ＡＫＴ２（アクセッションナンバーＰ３１７５１）、ＡＫＴ３（アクセッションナンバーＱ９Ｙ２４３）、ＥＲＫ１（アクセッションナンバーＰ２７３６１）、ＥＲＫ２（アクセッションナンバーＰ２８４８２）、ＭＥＫ１（アクセッションナンバーＱ０２７５０）、ＭＥＫ２（アクセッションナンバーＰ３６５０７）、ＨＳＰ９０α（アクセッションナンバーＰ０７９００）、ｐ３８α（アクセッションナンバーＱ１６５３９）、ｐ３８β（アクセッションナンバーＱ１５７５９）、ｐ３８γ（アクセッションナンバーＰ５３７７８）、ｐ３８δ（アクセッションナンバーＯ１５２６４）、Ｎｏｔｃｈ１（アクセッションナンバーＰ４６５３１）、Ｎｏｔｃｈ２（アクセッションナンバーＱ０４７２１）、Ｎｏｔｃｈ３（アクセッションナンバーＱ９ＵＭ４７）、Ｎｏｔｃｈ４（アクセッションナンバーＱ９９４６６）、ＨＩＦ－１α（アクセッションナンバーＱ１６６６５）、ＤＬＬ１（アクセッションナンバーＯ００５４８）、ＤＬＬ３（アクセッションナンバーＱ９ＮＹＪ７）、ＤＬＬ４（アクセッションナンバーＱ９ＮＲ６１）、Ｂ７－Ｈ１（アクセッションナンバーＱ９ＮＺＱ７）、ＣＤ１９（アクセッションナンバーＰ１５３９１）、ＣＤ２２（アクセッションナンバーＰ２０２７３）、ＣＤ２６（アクセッションナンバーＰ２７４８７）、ＣＤ２８（アクセッションナンバーＰ１０７４７）、ＣＤ４４（アクセッションナンバーＰ１６０７０）、ＣＤ６６ｄ（アクセッションナンバーＰ４０１９８）、ＥｐＣＡＭ（アクセッションナンバーＰ１６４２２）、ＣＴＬＡ４（アクセッションナンバーＰ１６４１０）、ＩＬ６（アクセッションナンバーＰ０５２３１）、ＩＬ６Ｒα（アクセッションナンバーＰ０８８８７）、ＩＬ６Ｒβ（アクセッションナンバーＰ４０１８９）、ＩＬ１０（アクセッションナンバーＰ２２３０１）、ＩＬ１０Ｒα（アクセッションナンバーＱ１３６５１）、ＩＬ１０Ｒβ（アクセッションナンバーＱ０８３３４）、ＲＡＮＴＥＳ（アクセッションナンバーＰ１３５０１）、ＣＣＲ１（アクセッションナンバーＰ３２２４６）、ＣＣＲ３（アクセッションナンバーＰ５１６７７）、ＣＤＫ１（アクセッションナンバーＰ０６４９３）、ＣＤＫ２（アクセッションナンバーＰ２４９４１）、ＣＤＫ４（アクセッションナンバーＰ１１８０２）、ＣＤＫ６（アクセッションナンバーＱ００５３４）、ＴＮＦα（アクセッションナンバーＰ０１３７５）、Ｆａｓ（アクセッションナンバーＰ２５４４５）、ＴＲＡＩＬＲ１（アクセッションナンバーＯ００２２０）、ＴＲＡＩＬＲ２（アクセッションナンバーＯ１４７６３）、ＢＣＬ２（アクセッションナンバーＰ１０４１５）、ｃＩＡＰ１（アクセッションナンバーＱ１３４９０）、ＸＩＡＰ（アクセッションナンバーＰ９８１７０）、ＰＡＲＰ１（アクセッションナンバーＰ０９８７４）、ＫＲＡＳ（アクセッションナンバーＰ０１１１６）、ＢＲＡＦ（アクセッションナンバーＰ１５０５６）、ＡＰＣ（アクセッションナンバーＰ２５０５４）、ＭＭＰ１（アクセッションナンバーＰ０３９５６）、ＭＭＰ７（アクセッションナンバーＰ０９２３７）、ＭＭＰ９（アクセッションナンバーＰ１４７８０）、ＭＴ－ＭＭＰ１（アクセッションナンバーＰ５０２８１）、ＶＣＡＭ１（アクセッションナンバーＰ１９３２０）、ＲＡＮＫＬ（アクセッションナンバーＯ１４７８８）等を好適に挙げることができる。なお、分子標的薬の標的タンパク質としてのＥＲＢＢ２（アクセッションナンバーＰ０４６２６）と、一般診断において診断対象となるタンパク質としての血清ＨＥＲ２タンパク質（アクセッションナンバーＰ０４６２６）とは、同一のタンパク質である。
　本発明のペプチドとしては、具体的には、例えば、分子標的薬の標的タンパク質を定量するための配列番号１～４５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、一般診断において診断対象となるタンパク質を定量するための配列番号４６～１１１のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、腫瘍関連マーカータンパク質を定量するための配列番号１１２～１３３のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、分子標的薬の標的となり得るタンパク質を定量するための配列番号１３４～３０８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド等を挙げることができる。
　本発明の分子標的薬の標的タンパク質を定量するためのペプチドとしては、具体的には、ＰＤＧＦＲα（アクセッションナンバーＰ１６２３４）の部分配列である、ＶＥＥＴＩＡＶＲ（配列番号１）、ＧＳＴＦＬＰＶＫ（配列番号２）、及びＬＶＹＴＬＴＶＰＥＡＴＶＫ（配列番号３）；ＰＤＧＦＲβ（アクセッションナンバーＰ０９６１９）の部分配列である、ＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲ（配列番号４）、ＬＰＧＦＨＧＬＲ（配列番号５）、及びＹＶＳＥＬＴＬＶＲ（配列番号６）；ＥＧＦＲ（アクセッションナンバーＰ００５３３）の部分配列である、ＥＬＩＩＥＦＳＫ（配列番号７）、ＩＰＬＥＮＬＱＩＩＲ（配列番号８）、及びＮＬＱＥＩＬＨＧＡＶＲ（配列番号９）；ＥＧＦＲ－ｖａｒｉａｎｔ（アクセッションナンバーＰ００５３３）の部分配列である、ＩＴＤＦＧＲ（配列番号１０）、ＩＴＤＦＧＬＡＫ（配列番号１１）、ＮＹＤＬＳＦＬＫ（配列番号１２）、及びＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫ（配列番号１３）；ＥＲＢＢ２（アクセッションナンバーＰ０４６２６）の部分配列である、ＶＬＱＧＬＰＲ（配列番号１４）、ＧＬＱＳＬＰＴＨＤＰＳＰＬＱＲ（配列番号１５）、及びＧＩＷＩＰＤＧＥＮＶＫ（配列番号１６）；ＶＥＧＦＲ１（アクセッションナンバーＰ１７９４８）の部分配列である、ＡＦＰＳＰＥＶＶＷＬＫ（配列番号１７）、ＬＧＤＬＬＱＡＮＶＱＱＤＧＫ（配列番号１８）、及びＮＩＬＬＳＥＮＮＶＶＫ（配列番号１９）；ＶＥＧＦＲ２（アクセッションナンバーＰ３５９６８）の部分配列である、ＹＬＧＹＰＰＰＥＩＫ（配列番号２０）、ＴＦＥＤＩＰＬＥＥＰＥＶＫ（配列番号２１）、ＮＱＦＡＬＩＥＧＫ（配列番号２２）；ＶＥＧＦＲ３（アクセッションナンバーＰ３５９１６）の部分配列である、ＬＡＡＹＰＰＰＥＦＱＷＹＫ（配列番号２３）、ＧＰＩＬＥＡＴＡＧＤＥＬＶＫ（配列番号２４）、ＹＧＮＬＳＮＦＬＲ（配列番号２５）；ＭＥＴ（アクセッションナンバーｓｐ＿Ｐ０８５８１）の部分配列である、ＶＦＰＮＳＡＰＬＥＧＧＴＲ（配列番号２６）、ＤＬＩＧＦＧＬＱＶＡＫ（配列番号２７）、ＹＶＮＤＦＦＮＫ（配列番号２８）；ＩＧＦＲ（アクセッションナンバーＰ０８０６９）の部分配列である、ＡＥＮＧＰＧＰＧＶＬＶＬＲ（配列番号２９）、ＱＰＱＤＧＹＬＹＲ（配列番号３０）、ＤＬＩＳＦＴＶＹＹＫ（配列番号３１）；ＣＤ３３（アクセッションナンバーＰ２０１３８）の部分配列である、ＦＡＧＡＧＶＴＴＥＲ（配列番号３２）、ＩＬＩＰＧＴＬＥＰＧＨＳＫ（配列番号３３）、ＮＳＰＶＨＧＹＷＦＲ（配列番号３４）；ＣＤ３７（アクセッションナンバーＰ１１０４９）の部分配列である、ＶＩＬＰＱＬＳＲ（配列番号３５）、ＮＬＤＨＶＹＮＲ（配列番号３６）；ｃ－ｋｉｔ（アクセッションナンバーＰ１０７２１）の部分配列である、ＶＶＥＡＴＡＹＧＬＩＫ（配列番号３７）、ＬＶＶＱＳＳＩＤＳＳＡＦＫ（配列番号３８）、ＡＶＰＶＶＳＶＳＫ（配列番号３９）；ＦＬＴ３（アクセッションナンバーＰ３６８８８）の部分配列である、ＴＧＶＳＩＱＶＡＶＫ（配列番号４０）、ＩＬＦＡＦＶＳＳＶＡＲ（配列番号４１）、ＴＷＴＥＩＦＫ（配列番号４２）；ｍＴＯＲ（アクセッションナンバーＰ４２３４５）の部分配列である、ＩＤＴＰＲＰＬＶＧＲ（配列番号４３）、ＬＬＶＶＧＩＴＤＰＤＰＤＩＲ（配列番号４４）、ＩＱＳＩＡＰＳＬＱＶＩＴＳＫ（配列番号４５）；等を例示することができる。
　また、前記分子標的薬の標的タンパク質を定量するためのペプチドの中でも、ＰＤＧＦＲα（アクセッションナンバーＰ１６２３４）の部分配列である、ＶＥＥＴＩＡＶＲ（配列番号１）；ＰＤＧＦＲβ（アクセッションナンバーＰ０９６１９）の部分配列である、ＥＶＤＳＤＡＹＹＶＹＲ（配列番号４）；ＥＧＦＲ（アクセッションナンバーＰ００５３３）の部分配列である、ＥＬＩＩＥＦＳＫ（配列番号７）；ＥＧＦＲ－ｖａｒｉａｎｔ（アクセッションナンバーＰ００５３３）の部分配列である、ＩＴＤＦＧＲ（配列番号１０）、ＩＴＤＦＧＬＡＫ（配列番号１１）、ＮＹＤＬＳＦＬＫ（配列番号１２）、及びＥＩＳＤＧＤＶＩＩＳＧＮＫ（配列番号１３）；ＥＲＢＢ２（アクセッションナンバーＰ０４６２６）の部分配列である、ＶＬＱＧＬＰＲ（配列番号１４）；ＶＥＧＦＲ１（アクセッションナンバーＰ１７９４８）の部分配列である、ＡＦＰＳＰＥＶＶＷＬＫ（配列番号１７）；ＶＥＧＦＲ２（アクセッションナンバーＰ３５９６８）の部分配列である、ＹＬＧＹＰＰＰＥＩＫ（配列番号２０）；ＶＥＧＦＲ３（アクセッションナンバーＰ３５９１６）の部分配列である、ＬＡＡＹＰＰＰＥＦＱＷＹＫ（配列番号２３）；ＭＥＴ（アクセッションナンバーｓｐ＿Ｐ０８５８１）の部分配列である、ＶＦＰＮＳＡＰＬＥＧＧＴＲ（配列番号２６）；ＩＧＦＲ（アクセッションナンバーＰ０８０６９）の部分配列である、ＡＥＮＧＰＧＰＧＶＬＶＬＲ（配列番号２９）；ＣＤ３３（アクセッションナンバーＰ２０１３８）の部分配列である、ＦＡＧＡＧＶＴＴＥＲ（配列番号３２）；ＣＤ３７（アクセッションナンバーＰ１１０４９）の部分配列である、ＶＩＬＰＱＬＳＲ（配列番号３５）；ｃ－ｋｉｔ（アクセッションナンバーＰ１０７２１）の部分配列である、ＶＶＥＡＴＡＹＧＬＩＫ（配列番号３７）；ＦＬＴ３（アクセッションナンバーＰ３６８８８）の部分配列である、ＴＧＶＳＩＱＶＡＶＫ（配列番号４０）；ｍＴＯＲ（アクセッションナンバーＰ４２３４５）の部分配列である、ＩＤＴＰＲＰＬＶＧＲ（配列番号４３）；等を特に好適な定量対象ペプチドとして例示することができる。
　本発明の一般診断において診断対象となるタンパク質を定量するためのペプチドとしては、具体的には、血清アミラーゼ（アクセッションナンバーＰ０４７４５、Ｐ０４７４６、Ｐ１９９６１）の部分配列である、ＳＳＤＹＦＧＮＧＲ（配列番号４６）、及びＩＹＶＳＤＤＧＫ（配列番号４７）；Ａｐｏ－Ａ１（アクセッションナンバーＰ０２６４７）の部分配列である、ＱＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫ（配列番号４８）、ＤＬＡＴＶＹＶＤＶＬＫ（配列番号４９）、及びＬＬＤＮＷＤＳＶＴＳＴＦＳＫ（配列番号５０）；Ａｐｏ－Ａ２（アクセッションナンバーＰ０２６５２）の部分配列である、ＳＰＥＬＱＡＥＡＫ（配列番号５１）；Ａｐｏ－Ｂ（４８＋１００）（アクセッションナンバーＰ０４１１４）の部分配列である、ＩＥＩＰＬＰＦＧＧＫ（配列番号５２）、ＥＦＱＶＰＴＦＴＩＰＫ（配列番号５３）、及びＴＧＩＳＰＬＡＬＩＫ（配列番号５４）；Ａｐｏ－Ｂ１００（アクセッションナンバーＰ０４１１４）の部分配列である、ＮＰＮＧＹＳＦＳＩＰＶＫ（配列番号５５）、ＮＩＩＬＰＶＹＤＫ（配列番号５６）、及びＩＰＳＶＱＩＮＦＫ（配列番号５７）；Ａｐｏ－Ｃ２（アクセッションナンバーＰ０２６５５）の部分配列である、ＴＹＬＰＡＶＤＥＫ（配列番号５８）；ＡｐｏＣ３（アクセッションナンバーＰ０２６５６）の部分配列である、ＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ（配列番号５９）；Ａｐｏ－Ｅ（アクセッションナンバーＰ０２６４９）の部分配列である、ＬＧＰＬＶＥＱＧＲ（配列番号６０）；ＧＯＴ（細胞質）（アクセッションナンバーＰ１７１７４）の部分配列である、ＩＴＷＳＮＰＰＡＱＧＡＲ（配列番号６１）、ＬＡＬＧＤＤＳＰＡＬＫ（配列番号６２）、ＶＧＮＬＴＶＶＧＫ（配列番号６３）、及びＩＮＶＳＧＬＴＴＫ（配列番号６４）；ＧＯＴ（ミトコンドリア）（アクセッションナンバーＰ００５０５）の部分配列である、ＦＶＴＶＱＴＩＳＧＴＧＡＬＲ（配列番号６５）；ＧＰＴ（アクセッションナンバーＱ８ＴＤ３０）の部分配列である、ＩＬＶＳＧＧＧＫ（配列番号６６）、ＴＰＳＳＷＧＲ（配列番号６７）、ＡＶＥＹＡＶＲ（配列番号６８）、及びＶＱＬＰＰＲ（配列番号６９）；ＬＤＨ＿Ｍ（アクセッションナンバーＰ００３３８）の部分配列である、ＬＶＩＩＴＡＧＡＲ（配列番号７０）；ＬＤＨ＿Ｈ（アクセッションナンバーＰ０７１９５）の部分配列である、ＩＶＶＶＴＡＧＶＲ（配列番号７１）；ＡＬＰ（アクセッションナンバーＰ０５１８６）の部分配列である、ＦＰＦＶＡＬＳＫ（配列番号７２）；ｇ－ＧＴＰ（アクセッションナンバーＰ１９４４０、Ｐ３６２６８、Ａ６ＮＧＵ５）の部分配列である、ＧＧＬＳＶＡＶＰＧＥＩＲ（配列番号７３）、及びＦＶＤＶＴＥＳＴＲ（配列番号７４）；ＺＴＴ（アクセッションナンバーＰ０１８５７）の部分配列である、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号７５）、ＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号７６）、及びＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫ（配列番号７７）；ＣＨＥ（アクセッションナンバーＰ０６２７６）の部分配列である、ＮＩＡＡＦＧＧＮＰＫ（配列番号７８）、ＦＷＴＳＦＦＰＫ（配列番号７９）、及びＹＬＴＬＮＴＥＳＴＲ（配列番号８０）；ＣＥＡ（アクセッションナンバーＰ０６７３１）の部分配列である、ＩＮＧＩＰＱＱＨＴＱＶＬＦＩＡＫ（配列番号８１）；ＰＳＡ（アクセッションナンバーＰ０７２８８）の部分配列である、ＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲ（配列番号８２）；ＣＡ１２５（アクセッションナンバーＱ８ＷＸＩ７）の部分配列である、ＬＴＳＰＶＶＴＴＳＴＲ（配列番号８３）、ＦＰＤＩＦＳＶＡＳＳＲ（配列番号８４）、及びＬＴＡＴＱＳＴＡＰＫ（配列番号８５）；ＣＡ１５－３（アクセッションナンバーＰ１５９４１）の部分配列である、ＳＳＶＰＳＳＴＥＫ（配列番号８６）、及びＡＴＴＴＰＡＳＫ（配列番号８７）；ＣＹＦＲＡ（アクセッションナンバーＰ０８７２７）の部分配列である、ＩＬＧＡＴＩＥＮＳＲ（配列番号８８）；ＰＩＶＫＡ－II（アクセッションナンバーＰ００７３４）の部分配列である、ＡＮＴＦＬＥＥＶＲ（配列番号８９）；血清ＨＥＲ２タンパク質（アクセッションナンバーＰ０４６２６）の部分配列である、ＶＬＱＧＬＰＲ（配列番号９０）、及びＧＧＶＬＩＱＲ（配列番号９１）；ＣＲＰ（アクセッションナンバーＰ０２７４１）の部分配列である、ＥＳＤＴＳＹＶＳＬＫ（配列番号９２）；ＡＦＰ（アクセッションナンバーＰ０２７７１）の部分配列である、ＴＦＱＡＩＴＶＴＫ（配列番号９３）、及びＤＦＮＱＦＳＳＧＥＫ（配列番号９４）；ＳＣＣＡ１（アクセッションナンバーＰ２９５０８）の部分配列である、ＧＬＶＬＳＧＶＬＨＫ（配列番号９５）、及びＴＮＳＩＬＦＹＧＲ（配列番号９６）；ＳＣＣＡ２（アクセッションナンバーＰ４８５９４）の部分配列である、ＶＬＨＦＤＱＶＴＥＮＴＴＥＫ（配列番号９７）、及びＴＮＳＩＬＦＹＧＲ（配列番号９８）；ＮＳＥ（アクセッションナンバーＰ０９１０４）の部分配列である、ＹＩＴＧＤＱＬＧＡＬＹＱＤＦＶＲ（配列番号９９）、ＩＥＥＥＬＧＤＥＡＲ（配列番号１００）、及びＬＧＡＥＶＹＨＴＬＫ（配列番号１０１）；ｆｅｒｒｉｔｉｎ＿Ｈ（アクセッションナンバーＰ０２７９４）の部分配列である、ＮＶＮＱＳＬＬＥＬＨＫ（配列番号１０２）；ｆｅｒｒｉｔｉｎ＿Ｌ（アクセッションナンバーＰ０２７９２）の部分配列である、ＬＧＧＰＥＡＧＬＧＥＹＬＦＥＲ（配列番号１０３）、及びＤＤＶＡＬＥＧＶＳＨＦＦＲ（配列番号１０４）；ｅｌａｓｔａｓｅ１（アクセッションナンバーＱ１４２３７）の部分配列である、ＡＧＹＤＩＡＬＬＲ（配列番号１０５）、及びＴＮＧＱＬＡＱＴＬＱ（配列番号１０６）；Ｐｒｏ－ＧＲＰ（アクセッションナンバーＰ０７４９２）の部分配列である、ＮＬＬＧＬＩＥＡＫ（配列番号１０７）、及びＮＨＱＰＰＱＰＫ（配列番号１０８）；ＰＡＰ（アクセッションナンバーＰ１５３０９）の部分配列である、ＳＰＩＤＴＥＰＴＤＰＩＫ（配列番号１０９）、ＦＶＴＬＶＦＲ（配列番号１１０）、及びＦＱＥＬＥＳＥＴＬＫ（配列番号１１１）；等を例示することができる。
　前記一般診断において診断対象となるタンパク質を定量するためのペプチドの中でも、血清アミラーゼ（アクセッションナンバーＰ０４７４５、Ｐ０４７４６、Ｐ１９９６１）の部分配列である、ＳＳＤＹＦＧＮＧＲ（配列番号４６）、及びＩＹＶＳＤＤＧＫ（配列番号４７）；Ａｐｏ－Ａ１（アクセッションナンバーＰ０２６４７）の部分配列である、ＱＧＬＬＰＶＬＥＳＦＫ（配列番号４８）、及びＤＬＡＴＶＹＶＤＶＬＫ（配列番号４９）；Ａｐｏ－Ａ２（アクセッションナンバーＰ０２６５２）の部分配列である、ＳＰＥＬＱＡＥＡＫ（配列番号５１）；Ａｐｏ－Ｂ（４８＋１００）（アクセッションナンバーＰ０４１１４）の部分配列である、ＩＥＩＰＬＰＦＧＧＫ（配列番号５２）、及びＥＦＱＶＰＴＦＴＩＰＫ（配列番号５３）；Ａｐｏ－Ｂ１００（アクセッションナンバーＰ０４１１４）の部分配列である、ＮＰＮＧＹＳＦＳＩＰＶＫ（配列番号５５）、及びＮＩＩＬＰＶＹＤＫ（配列番号５６）；Ａｐｏ－Ｃ２（アクセッションナンバーＰ０２６５５）の部分配列である、ＴＹＬＰＡＶＤＥＫ（配列番号５８）；ＡｐｏＣ３（アクセッションナンバーＰ０２６５６）の部分配列である、ＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫ（配列番号５９）；Ａｐｏ－Ｅ（アクセッションナンバーＰ０２６４９）の部分配列である、ＬＧＰＬＶＥＱＧＲ（配列番号６０）；ＧＯＴ（細胞質）（アクセッションナンバーＰ１７１７４）の部分配列である、ＩＴＷＳＮＰＰＡＱＧＡＲ（配列番号６１）、及びＬＡＬＧＤＤＳＰＡＬＫ（配列番号６２）；ＧＯＴ（ミトコンドリア）（アクセッションナンバーＰ００５０５）の部分配列である、ＦＶＴＶＱＴＩＳＧＴＧＡＬＲ（配列番号６５）；ＧＰＴ（アクセッションナンバーＱ８ＴＤ３０）の部分配列である、ＩＬＶＳＧＧＧＫ（配列番号６６）、及びＴＰＳＳＷＧＲ（配列番号６７）；ＬＤＨ＿Ｍ（アクセッションナンバーＰ００３３８）の部分配列である、ＬＶＩＩＴＡＧＡＲ（配列番号７０）；ＬＤＨ＿Ｈ（アクセッションナンバーＰ０７１９５）の部分配列である、ＩＶＶＶＴＡＧＶＲ（配列番号７１）；ＡＬＰ（アクセッションナンバーＰ０５１８６）の部分配列である、ＦＰＦＶＡＬＳＫ（配列番号７２）；ｇ－ＧＴＰ（アクセッションナンバーＰ１９４４０、Ｐ３６２６８、Ａ６ＮＧＵ５）の部分配列である、ＧＧＬＳＶＡＶＰＧＥＩＲ（配列番号７３）；ＺＴＴ（アクセッションナンバーＰ０１８５７）の部分配列である、ＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ（配列番号７５）、及びＡＬＰＡＰＩＥＫ（配列番号７６）；ＣＨＥ（アクセッションナンバーＰ０６２７６）の部分配列である、ＮＩＡＡＦＧＧＮＰＫ（配列番号７８）、及びＦＷＴＳＦＦＰＫ（配列番号７９）；ＣＥＡ（アクセッションナンバーＰ０６７３１）の部分配列である、ＩＮＧＩＰＱＱＨＴＱＶＬＦＩＡＫ（配列番号８１）；ＰＳＡ（アクセッションナンバーＰ０７２８８）の部分配列である、ＨＳＱＰＷＱＶＬＶＡＳＲ（配列番号８２）；ＣＡ１２５（アクセッションナンバーＱ８ＷＸＩ７）の部分配列である、ＬＴＳＰＶＶＴＴＳＴＲ（配列番号８３）、及びＦＰＤＩＦＳＶＡＳＳＲ（配列番号８４）；ＣＡ１５－３（アクセッションナンバーＰ１５９４１）の部分配列である、ＳＳＶＰＳＳＴＥＫ（配列番号８６）、及びＡＴＴＴＰＡＳＫ（配列番号８７）；ＣＹＦＲＡ（アクセッションナンバーＰ０８７２７）の部分配列である、ＩＬＧＡＴＩＥＮＳＲ（配列番号８８）；ＰＩＶＫＡ－II（アクセッションナンバーＰ００７３４）の部分配列である、ＡＮＴＦＬＥＥＶＲ（配列番号８９）；血清ＨＥＲ２タンパク質（アクセッションナンバーＰ０４６２６）の部分配列である、ＶＬＱＧＬＰＲ（配列番号９０）、及びＧＧＶＬＩＱＲ（配列番号９１）；等を特に好適な定量対象ペプチドとして例示することができる。
　本発明の腫瘍関連マーカータンパク質を定量するためのペプチドとしては、具体的には、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（アクセッションナンバーＰ０８６７０）の部分配列である、ＦＡＤＬＳＥＡＡＮＲ（配列番号１１２）；Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（アクセッションナンバーＰ０７１９７）の部分配列である、ＶＳＧＳＰＳＳＧＦＲ（配列番号１１３）、及びＦＶＥＥＩＩＥＥＴＫ（配列番号１１４）；Ｎｅｓｔｉｎ（アクセッションナンバーＰ４８６８１）の部分配列である、ＬＥＬＱＦＰＲ（配列番号１１５）、及びＧＡＶＡＧＡＰＫ（配列番号１１６）；Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（アクセッションナンバーＯ１４７４６）の部分配列である、ＧＧＰＰＥＡＦＴＴＳＶＲ（配列番号１１７）、及びＳＹＬＰＮＴＶＴＤＡＬＲ（配列番号１１８）；ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ（アクセッションナンバーＰ３５２２２）の部分配列である、ＳＧＧＩＰＡＬＶＫ（配列番号１１９）、及びＬＬＮＤＥＤＱＶＶＶＮＫ（配列番号１２０）；Ｃ－ＭＹＣ（アクセッションナンバーＰ０１１０６）の部分配列である、ＤＱＩＰＥＬＥＮＮＥＫ（配列番号１２１）；Ｎ－ＭＹＣ（アクセッションナンバーＰ０４１９８）の部分配列である、ＮＡＡＬＧＰＧＲ（配列番号１２２）；ＧＳＴＰ１（アクセッションナンバーＰ０９２１１）の部分配列である、ＴＬＧＬＹＧＫ（配列番号１２３）、及びＥＥＶＶＴＶＥＴＷＱＥＧＳＬＫ（配列番号１２４）；ＭＧＭＴ（アクセッションナンバーＰ１６４５５）の部分配列である、ＥＷＬＬＡＨＥＧＨＲ（配列番号１２５）、及びＴＴＬＤＳＰＬＧＫ（配列番号１２６）；ＣＤ１３３（アクセッションナンバーＯ４３４９０）の部分配列である、ＡＮＳＬＰＰＧＮＬＲ（配列番号１２７）、及びＴＧＮＧＬＬＥＲ（配列番号１２８）；ＳＮＡＴ３（アクセッションナンバーＱ９９６２４）の部分配列である、ＡＹＥＱＬＧＹＲ（配列番号１２９）、及びＥＰＨＦＴＤＦＥＧＫ（配列番号１３０）；ＳＮＡＴ５（アクセッションナンバーＱ８ＷＵＸ１）の部分配列である、ＩＶＰＳＥＶＥＰＦＬＳＷＰＫ（配列番号１３１）、及びＡＦＧＰＡＧＫ（配列番号１３２）；ＳＮＡＴ６（アクセッションナンバーＱ８ＩＺＭ９）の部分配列である、ＶＥＳＥＬＬＫ（配列番号１３３）；等を例示することができる。
　前記腫瘍関連マーカータンパク質を定量するためのペプチドの中でも、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（アクセッションナンバーＰ０８６７０）の部分配列である、ＦＡＤＬＳＥＡＡＮＲ（配列番号１１２）；Ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ（アクセッションナンバーＰ０７１９７）の部分配列である、ＶＳＧＳＰＳＳＧＦＲ（配列番号１１３）；Ｎｅｓｔｉｎ（アクセッションナンバーＰ４８６８１）の部分配列である、ＬＥＬＱＦＰＲ（配列番号１１５）、及びＧＡＶＡＧＡＰＫ（配列番号１１６）；Ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（アクセッションナンバーＯ１４７４６）の部分配列である、ＧＧＰＰＥＡＦＴＴＳＶＲ（配列番号１１７）；ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ（アクセッションナンバーＰ３５２２２）の部分配列である、ＳＧＧＩＰＡＬＶＫ（配列番号１１９）；Ｃ－ＭＹＣ（アクセッションナンバーＰ０１１０６）の部分配列である、ＤＱＩＰＥＬＥＮＮＥＫ（配列番号１２１）；Ｎ－ＭＹＣ（アクセッションナンバーＰ０４１９８）の部分配列である、ＮＡＡＬＧＰＧＲ（配列番号１２２）；ＧＳＴＰ１（アクセッションナンバーＰ０９２１１）の部分配列である、ＴＬＧＬＹＧＫ（配列番号１２３）；ＭＧＭＴ（アクセッションナンバーＰ１６４５５）の部分配列である、ＥＷＬＬＡＨＥＧＨＲ（配列番号１２５）、及びＴＴＬＤＳＰＬＧＫ（配列番号１２６）；ＣＤ１３３（アクセッションナンバーＯ４３４９０）の部分配列である、ＡＮＳＬＰＰＧＮＬＲ（配列番号１２７）；ＳＮＡＴ３（アクセッションナンバーＱ９９６２４）の部分配列である、ＡＹＥＱＬＧＹＲ（配列番号１２９）；ＳＮＡＴ５（アクセッションナンバーＱ８ＷＵＸ１）の部分配列である、ＩＶＰＳＥＶＥＰＦＬＳＷＰＫ（配列番号１３１）；ＳＮＡＴ６（アクセッションナンバーＱ８ＩＺＭ９）の部分配列である、ＶＥＳＥＬＬＫ（配列番号１３３）；等を特に好適な定量対象ペプチドとして例示することができる。
　本発明の分子標的薬の標的となり得るタンパク質を定量するためのペプチドとしては、具体的には、ＨＥＲ３（アクセッションナンバーＰ２１８６０）の部分配列である、ＧＶＷＩＰＥＧＥＳＩＫ（配列番号１３４）、ＬＴＦＱＬＥＰＮＰＨＴＫ（配列番号１３５）、ＧＴＱＶＹＤＧＫ（配列番号１３６）；ＦＧＦＲ１（アクセッションナンバーＰ１１３６２）の部分配列である、ＤＤＶＱＳＩＮＷＬＲ（配列番号１３７）；ＦＧＦＲ２（アクセッションナンバーＰ２１８０２）の部分配列である、ＤＡＡＶＩＳＷＴＫ（配列番号１３８）、ＴＶＬＩＧＥＹＬＱＩＫ（配列番号１３９）、ＥＡＶＴＶＡＶＫ（配列番号１４０）；ＦＧＦＲ３（アクセッションナンバーＰ２２６０７）の部分配列である、ＶＧＰＤＧＴＰＹＶＴＶＬＫ（配列番号１４１）；ＦＧＦＲ４（アクセッションナンバーＰ２２４５５）の部分配列である、ＹＮＹＬＬＤＶＬＥＲ（配列番号１４２）、ＶＬＬＡＶＳＥＥＹＬＤＬＲ（配列番号１４３）、ＧＧＨＷＹＫ（配列番号１４４）；ＲＥＴ（アクセッションナンバーＰ０７９４９）の部分配列である、ＶＦＬＳＰＴＳＬＲ（配列番号１４５）、ＴＬＧＥＧＥＦＧＫ（配列番号１４６）、ＡＤＧＴＮＴＧＦＰＲ（配列番号１４７）；ＥｐｈＡ１（アクセッションナンバーＰ２１７０９）の部分配列である、ＴＩＡＮＦＤＰＲ（配列番号１４８）、ＡＱＧＥＬＧＷＬＬＤＰＰＫ（配列番号１４９）、ＶＴＴＶＡＡＤＱＳＦＴＩＲ（配列番号１５０）；ＥｐｈＡ２（アクセッションナンバーＰ２９３１７）の部分配列である、ＷＴＰＰＱＤＳＧＧＲ（配列番号１５１）、ＮＧＶＳＧＬＶＴＳＲ（配列番号１５２）、ＴＬＡＤＦＤＰＲ（配列番号１５３）；ＥｐｈＡ３（アクセッションナンバーＰ２９３２０）の部分配列である、ＦＥＱＩＶＳＩＬＤＫ（配列番号１５４）、ＱＥＱＥＴＳＹＴＩＬＲ（配列番号１５５）；ＥｐｈＡ４（アクセッションナンバーＰ５４７６４）の部分配列である、ＩＧＩＴＡＩＴＨＱＮＫ（配列番号１５６）、ＥＴＦＮＬＹＹＹＥＳＤＮＤＫ（配列番号１５７）、ＧＬＮＰＬＴＳＹＶＦＨＶＲ（配列番号１５８）；ＥｐｈＡ５（アクセッションナンバーＰ５４７５６）の部分配列である、ＤＱＥＴＳＹＴＩＩＫ（配列番号１５９）；ＥｐｈＡ６（アクセッションナンバーＱ９ＵＦ３３）の部分配列である、ＶＤＳＳＳＬＶＥＶＲ（配列番号１６０）、ＴＡＴＧＹＳＧＹＳＱＫ（配列番号１６１）、ＦＴＤＩＶＳＦＬＤＫ（配列番号１６２）；ＥｐｈＡ７（アクセッションナンバーＱ１５３７５）の部分配列である、ＦＥＱＩＶＧＩＬＤＫ（配列番号１６３）、ＡＦＴＡＡＧＹＧＮＹＳＰＲ（配列番号１６４）、ＡＶＨＱＦＡＫ（配列番号１６５）；ＥｐｈＡ８（アクセッションナンバーＰ２９３２２）の部分配列である、ＤＬＧＡＳＴＱＥＳＱＦＬＫ（配列番号１６６）、ＤＶＩＳＳＶＥＥＧＹＲ（配列番号１６７）、ＡＦＱＤＳＤＥＥＫ（配列番号１６８）；ＥｐｈＡ１０（アクセッションナンバーＱ５ＪＺＹ３）の部分配列である、ＷＬＰＰＡＤＳＧＧＲ（配列番号１６９）、ＶＥＰＱＳＶＳＬＳＷＲ（配列番号１７０）、ＥＡＬＬＳＧＩＳＡＬＱＡＲ（配列番号１７１）；ＥｐｈＢ１（アクセッションナンバーＰ５４７６２）の部分配列である、ＥＩＤＶＳＦＶＫ（配列番号１７２）、ＴＶＡＧＹＧＫ（配列番号１７３）、ＬＱＨＹＳＴＧＲ（配列番号１７４）；ＥｐｈＢ２（アクセッションナンバーＰ２９３２３）の部分配列である、ＦＧＱＩＶＮＴＬＤＫ（配列番号１７５）、ＥＩＱＧＩＦＦＫ（配列番号１７６）、ＴＶＡＧＹＧＲ（配列番号１７７）；ＥｐｈＢ３（アクセッションナンバーＰ５４７５３）の部分配列である、ＥＳＳＱＮＮＷＬＲ（配列番号１７８）、ＹＴＦＥＶＱＡＶＮＧＶＳＧＫ（配列番号１７９）；ＥｐｈＢ４（アクセッションナンバーＰ５４７６０）の部分配列である、ＥＶＰＰＡＶＳＤＩＲ（配列番号１８０）、ＦＰＥＴＶＰＲ（配列番号１８１）、ＦＰＱＶＶＳＡＬＤＫ（配列番号１８２）；ＥｐｈＢ６（アクセッションナンバーＯ１５１９７）の部分配列である、ＳＦＧＰＬＴＱＲ（配列番号１８３）、ＥＴＦＴＬＹＹＲ（配列番号１８４）、ＷＡＡＰＥＶＩＡＨＧＫ（配列番号１８５）；ＡＫＴ１（アクセッションナンバーＰ３１７４９）の部分配列である、ＮＤＧＴＦＩＧＹＫ（配列番号１８６）、ＴＦＨＶＥＴＰＥＥＲ（配列番号１８７）、ＤＥＶＡＨＴＬＴＥＮＲ（配列番号１８８）；ＡＫＴ２（アクセッションナンバーＰ３１７５１）の部分配列である、ＳＤＧＳＦＩＧＹＫ（配列番号１８９）、ＹＤＳＬＧＬＬＥＬＤＱＲ（配列番号１９０）、ＴＦＨＶＤＳＰＤＥＲ（配列番号１９１）；ＡＫＴ３（アクセッションナンバーＱ９Ｙ２４３）の部分配列である、ＳＬＬＳＧＬＬＩＫ（配列番号１９２）、ＨＰＦＬＴＳＬＫ（配列番号１９３）、ＥＥＷＴＥＡＩＱＡＶＡＤＲ（配列番号１９４）；ＥＲＫ１（アクセッションナンバーＰ２７３６１）の部分配列である、ＧＱＰＦＤＶＧＰＲ（配列番号１９５）、ＥＬＩＦＱＥＴＡＲ（配列番号１９６）、ＮＹＬＱＳＬＰＳＫ（配列番号１９７）；ＥＲＫ２（アクセッションナンバーＰ２８４８２）の部分配列である、ＧＱＶＦＤＶＧＰＲ（配列番号１９８）；ＭＥＫ１（アクセッションナンバーＱ０２７５０）の部分配列である、ＩＰＥＱＩＬＧＫ（配列番号１９９）、ＩＳＥＬＧＡＧＮＧＧＶＶＦＫ（配列番号２００）；ＭＥＫ２（アクセッションナンバーＰ３６５０７）の部分配列である、ＤＤＤＦＥＲ（配列番号２０１）、ＩＳＥＬＧＡＧＮＧＧＶＶＴＫ（配列番号２０２）；ＨＳＰ９０α（アクセッションナンバーＰ０７９００）の部分配列である、ＤＱＶＡＮＳＡＦＶＥＲ（配列番号２０３）、ＶＶＶＳＮＲ（配列番号２０４）；ｐ３８α（アクセッションナンバーＱ１６５３９）の部分配列である、ＨＥＮＶＩＧＬＬＤＶＦＴＰＡＲ（配列番号２０５）、ＹＩＨＳＡＤＩＩＨＲ（配列番号２０６）；ｐ３８β（アクセッションナンバーＱ１５７５９）の部分配列である、ＴＶＷＥＶＰＱＲ（配列番号２０７）；ｐ３８γ（アクセッションナンバーＰ５３７７８）の部分配列である、ＹＩＨＡＡＧＩＩＨＲ（配列番号２０８）；ｐ３８δ（アクセッションナンバーＯ１５２６４）の部分配列である、ＶＴＧＶＰＧＴＥＦＶＱＫ（配列番号２０９）、ＤＹＬＤＱＬＴＱＩＬＫ（配列番号２１０）、ＹＩＨＳＡＧＶＶＨＲ（配列番号２１１）；Ｎｏｔｃｈ１（アクセッションナンバーＰ４６５３１）の部分配列である、ＧＳＩＶＹＬＥＩＤＮＲ（配列番号２１２）、ＬＬＤＥＹＮＬＶＲ（配列番号２１３）、ＶＬＬＤＨＦＡＮＲ（配列番号２１４）；Ｎｏｔｃｈ２（アクセッションナンバーＱ０４７２１）の部分配列である、ＡＬＧＴＬＬＨＴＮＬＲ（配列番号２１５）、ＥＰＬＰＰＩＶＴＦＱＬＩＰＫ（配列番号２１６）；Ｎｏｔｃｈ３（アクセッションナンバーＱ９ＵＭ４７）の部分配列である、ＬＤＦＰＹＰＬＲ（配列番号２１７）、ＳＳＡＤＦＬＱＲ（配列番号２１８）、ＥＩＴＤＨＬＤＲ（配列番号２１９）；Ｎｏｔｃｈ４（アクセッションナンバーＱ９９４６６）の部分配列である、ＥＱＴＰＬＦＬＡＡＲ（配列番号２２０）、ＴＷＳＶＤＬＡＡＲ（配列番号２２１）、ＥＡＧＰＦＰＲ（配列番号２２２）；ＨＩＦ－１α（アクセッションナンバーＱ１６６６５）の部分配列である、ＴＴＶＰＥＥＥＬＮＰＫ（配列番号２２３）、ＳＰＮＶＬＳＶＡＬＳＱＲ（配列番号２２４）、ＮＬＬＱＧＥＥＬＬＲ（配列番号２２５）；ＤＬＬ１（アクセッションナンバーＯ００５４８）の部分配列である、ＧＴＰＴＴＬＲ（配列番号２２６）、ＹＰＡＶＤＹＮＬＶＱＤＬＫ（配列番号２２７）、ＹＱＳＶＹＶＩＳＥＥＫ（配列番号２２８）；ＤＬＬ３（アクセッションナンバーＱ９ＮＹＪ７）の部分配列である、ＡＧＡＷＥＬＲ（配列番号２２９）、ＥＶＡＴＰＬＦＰＰＬＨＴＧＲ（配列番号２３０）；ＤＬＬ４（アクセッションナンバーＱ９ＮＲ６１）の部分配列である、ＤＮＬＩＰＡＡＱＬＫ（配列番号２３１）；Ｂ７－Ｈ１（アクセッションナンバーＱ９ＮＺＱ７）の部分配列である、ＬＱＤＡＧＶＹＲ（配列番号２３２）、ＮＩＩＱＦＶＨＧＥＥＤＬＫ（配列番号２３３）；ＣＤ１９（アクセッションナンバーＰ１５３９１）の部分配列である、ＧＴＳＤＧＰＴＱＱＬＴＷＳＲ（配列番号２３４）、ＬＹＶＷＡＫ（配列番号２３５）、ＧＰＬＳＷＴＨＶＨＰＫ（配列番号２３６）；ＣＤ２２（アクセッションナンバーＰ２０２７３）の部分配列である、ＶＴＰＳＤＡＩＶＲ（配列番号２３７）、ＱＡＡＶＴＳＴＳＬＴＩＫ（配列番号２３８）、ＥＶＱＦＦＷＥＫ（配列番号２３９）；ＣＤ２６（アクセッションナンバーＰ２７４８７）の部分配列である、ＶＬＥＤＮＳＡＬＤＫ（配列番号２４０）、ＷＩＳＤＨＥＹＬＹＫ（配列番号２４１）、ＩＩＳＮＥＥＧＹＲ（配列番号２４２）；ＣＤ２８（アクセッションナンバーＰ１０７４７）の部分配列である、ＹＳＹＮＬＦＳＲ（配列番号２４３）；ＣＤ４４（アクセッションナンバーＰ１６０７０）の部分配列である、ＥＱＷＦＧＮＲ（配列番号２４４）、ＹＧＦＩＥＧＨＶＶＩＰＲ（配列番号２４５）；ＣＤ６６ｄ（アクセッションナンバーＰ４０１９８）の部分配列である、ＥＱＱＰＱＡＬＡＰＧＲ（配列番号２４６）；ＥｐＣＡＭ（アクセッションナンバーＰ１６４２２）の部分配列である、ＴＹＷＩＩＩＥＬＫ（配列番号２４７）；ＣＴＬＡ４（アクセッションナンバーＰ１６４１０）の部分配列である、ＱＦＱＰＹＦＩＰＩＮ（配列番号２４８）；ＩＬ６（アクセッションナンバーＰ０５２３１）の部分配列である、ＥＡＬＡＥＮＮＬＮＬＰＫ（配列番号２４９）、ＦＥＳＳＥＥＱＡＲ（配列番号２５０）；ＩＬ６Ｒα（アクセッションナンバーＰ０８８８７）の部分配列である、ＤＤＤＮＩＬＦＲ（配列番号２５１）；ＩＬ６Ｒβ（アクセッションナンバーＰ４０１８９）の部分配列である、ＴＬＰＰＦＥＡＮＧＫ（配列番号２５２）、ＬＴＷＴＮＰＳＩＫ（配列番号２５３）、ＤＧＰＥＦＴＦＴＴＰＫ（配列番号２５４）；ＩＬ１０（アクセッションナンバーＰ２２３０１）の部分配列である、ＤＱＬＤＮＬＬＬＫ（配列番号２５５）、ＡＨＶＮＳＬＧＥＮＬＫ（配列番号２５６）；ＩＬ１０Ｒα（アクセッションナンバーＱ１３６５１）の部分配列である、ＧＱＤＤＳＧＩＤＬＶＱＮＳＥＧＲ（配列番号２５７）；ＩＬ１０Ｒβ（アクセッションナンバーＱ０８３３４）の部分配列である、ＬＳＶＩＡＥＤＳＥＳＧＫ（配列番号２５８）；ＲＡＮＴＥＳ（アクセッションナンバーＰ１３５０１）の部分配列である、ＥＹＦＹＴＳＧＫ（配列番号２５９）；ＣＣＲ１（アクセッションナンバーＰ３２２４６）の部分配列である、ＷＬＰＦＬＳＶＤＲ（配列番号２６０）；ＣＣＲ３（アクセッションナンバーＰ５１６７７）の部分配列である、ＹＩＰＦＬＰＳＥＫ（配列番号２６１）；ＣＤＫ１（アクセッションナンバーＰ０６４９３）の部分配列である、ＮＬＤＥＮＧＬＤＬＬＳＫ（配列番号２６２）；ＣＤＫ２（アクセッションナンバーＰ２４９４１）の部分配列である、ＶＶＰＰＬＤＥＤＧＲ（配列番号２６３）、ＡＦＧＶＰＶＲ（配列番号２６４）、ＥＬＮＨＰＮＩＶＫ（配列番号２６５）；ＣＤＫ４（アクセッションナンバーＰ１１８０２）の部分配列である、ＡＰＰＰＧＬＰＡＥＴＩＫ（配列番号２６６）、ＤＰＨＳＧＨＦＶＡＬＫ（配列番号２６７）、ＶＴＬＶＦＥＨＶＤＱＤＬＲ（配列番号２６８）；ＣＤＫ６（アクセッションナンバーＱ００５３４）の部分配列である、ＶＰＥＰＧＶＰＴＥＴＩＫ（配列番号２６９）、ＦＶＴＤＩＤＥＬＧＫ（配列番号２７０）；ＴＮＦα（アクセッションナンバーＰ０１３７５）の部分配列である、ＤＬＳＬＩＳＰＬＡＱＡＶＲ（配列番号２７１）；Ｆａｓ（アクセッションナンバーＰ２５４４５）の部分配列である、ＤＩＴＳＤＳＥＮＳＮＦＲ（配列番号２７２）；ＴＲＡＩＬＲ１（アクセッションナンバーＯ００２２０）の部分配列である、ＩＱＤＬＬＶＤＳＧＫ（配列番号２７３）、ＶＷＧＳＳＡＧＲ（配列番号２７４）、ＮＡＳＩＨＴＬＬＤＡＬＥＲ（配列番号２７５）；ＴＲＡＩＬＲ２（アクセッションナンバーＯ１４７６３）の部分配列である、ＩＥＤＨＬＬＳＳＧＫ（配列番号２７６）；ＢＣＬ２（アクセッションナンバーＰ１０４
１５）の部分配列である、ＦＡＴＶＶＥＥＬＦＲ（配列番号２７７）；ｃＩＡＰ１（アクセッションナンバーＱ１３４９０）の部分配列である、ＩＬＴＴＧＥＮＹＫ（配列番号２７８）、ＧＱＥＦＶＤＥＩＱＧＲ（配列番号２７９）、ＥＩＤＳＴＬＹＫ（配列番号２８０）；ＸＩＡＰ（アクセッションナンバーＰ９８１７０）の部分配列である、ＮＦＰＮＳＴＮＬＰＲ（配列番号２８１）、ＡＧＦＹＡＬＧＥＧＤＫ（配列番号２８２）、ＡＧＦＬＹＴＧＥＧＤＴＶＲ（配列番号２８３）；ＰＡＲＰ１（アクセッションナンバーＰ０９８７４）の部分配列である、ＡＱＮＤＬＩＷＮＩＫ（配列番号２８４）、ＴＬＧＤＦＡＡＥＹＡＫ（配列番号２８５）、ＤＰＩＤＶＮＹＥＫ（配列番号２８６）；ＫＲＡＳ（アクセッションナンバーＰ０１１１６）の部分配列である、ＳＦＥＤＩＨＨＹＲ（配列番号２８７）；ＢＲＡＦ（アクセッションナンバーＰ１５０５６）の部分配列である、ＬＴＱＥＨＩＥＡＬＬＤＫ（配列番号２８８）、ＮＱＦＧＱＲ（配列番号２８９）；ＡＰＣ（アクセッションナンバーＰ２５０５４）の部分配列である、ＴＳＳＶＴＩＰＥＬＤＤＮＫ（配列番号２９０）、ＥＬＮＬＤＳＳＮＦＰＧＶＫ（配列番号２９１）、ＱＳＴＦＰＱＳＳＫ（配列番号２９２）；ＭＭＰ１（アクセッションナンバーＰ０３９５６）の部分配列である、ＴＹＦＦＶＡＮＫ（配列番号２９３）、ＳＱＮＰＶＱＰＩＧＰＱＴＰＫ（配列番号２９４）、ＬＴＦＤＡＩＴＴＩＲ（配列番号２９５）；ＭＭＰ７（アクセッションナンバーＰ０９２３７）の部分配列である、ＤＬＰＨＩＴＶＤＲ（配列番号２９６）；ＭＭＰ９（アクセッションナンバーＰ１４７８０）の部分配列である、ＳＬＧＰＡＬＬＬＬＱＫ（配列番号２９７）、ＧＶＶＶＰＴＲ（配列番号２９８）、ＱＬＡＥＥＹＬＹＲ（配列番号２９９）；ＭＴ－ＭＭＰ１（アクセッションナンバーＰ５０２８１）の部分配列である、ＶＷＥＧＩＰＥＳＰＲ（配列番号３００）、ＥＶＰＹＡＹＩＲ（配列番号３０１）、ＦＹＧＬＱＶＴＧＫ（配列番号３０２）；ＶＣＡＭ１（アクセッションナンバーＰ１９３２０）の部分配列である、ＶＰＳＶＹＰＬＤＲ（配列番号３０３）、ＬＴＡＦＰＳＥＳＶＫ（配列番号３０４）、ＮＴＶＩＳＶＮＰＳＴＫ（配列番号３０５）；ＲＡＮＫＬ（アクセッションナンバーＯ１４７８８）の部分配列である、ＶＳＬＳＳＷＹＨＤＲ（配列番号３０６）、ＱＡＦＱＧＡＶＱＫ（配列番号３０７）、ＥＬＱＨＩＶＧＳＱＨＩＲ（配列番号３０８）；等を例示することができる。
　本発明のタンパク質を定量する方法としては、（ａ）試料中の被定量タンパク質をトリプシンによって断片化し、被定量タンパク質のペプチド断片を調製する工程；（ｂ）前記定量対象ペプチド、及び前記定量対象ペプチドと同配列の安定同位体標識ペプチドを用いて、それぞれの所定濃度段階に対するＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、検量線を作成する工程；（ｃ）前記被定量タンパク質のペプチド断片に、前記安定同位体標識ペプチドを添加してＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、被定量タンパク質ペプチド／安定同位体標識ペプチドのマススペクトル面積比を算出する工程；（ｄ）該面積比から検量線を用いて定量値を算出する工程；の工程（ａ）～（ｄ）を備えた、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量する方法であって、定量対象ペプチドが、前記本発明のペプチドあることを特徴とする方法であれば、特に制限されるものではなく、前記ペプチド断片を調製する工程としては、試料中の被定量タンパク質をトリプシンによって断片化し、被定量タンパク質のペプチド断片を調製する工程であれば特に制限されないが、被定量タンパク質のアルギニン残基及びリシン残基の両方の部位を効率よく切断できるという点から、あらかじめリシルエンドペプチダーゼを用いて断片化した試料中の被定量タンパク質を、さらにトリプシンを用いて断片化する工程であることが好ましい。前記ペプチド断片を調製する工程は、タンパク質消化酵素の標準的な反応条件により行うことができ、トリプシンの反応条件としては、例えば、３０℃～４５℃において１～３６時間であることが好ましく、３６～３７℃において１６～２４時間であることがさらに好ましい。また、前記ペプチド断片を調製する工程における、リシルエンドペプチダーゼの反応条件としては、例えば、室温～４５℃において１～３６時間であることが好ましく、室温～２５℃において３時間であることがさらに好ましい。前記本発明のタンパク質を定量する方法に用いる試料としては、特に制限されるものではないが、具体的には、生体から採取された細胞、組織、又は血液等を好適に例示することができる。
　上記定量対象ペプチドとしては、本発明のペプチドであれば特に制限されないが、具体的には、本発明の分子標的薬の標的タンパク質を定量するための配列番号１～４５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、一般診断において診断対象となるタンパク質を定量するための配列番号４６～１１１のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、腫瘍関連マーカータンパク質を定量するための配列番号１１２～１３３のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドや、分子標的薬の標的となり得るタンパク質を定量するための配列番号１３４～３０８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチド等を好適に例示することができる。また、上記本発明のペプチドは、一般的な化学合成法により製造することができる。かかるペプチド合成法として、アミノ酸配列情報に基づいて、各アミノ酸を１個ずつ逐次結合させ鎖を延長させていくステップワイズエロゲーション法や、アミノ酸数個からなるフラグメントを予め合成し、次いで各フラグメントをカップリング反応させるフラグメント・コンデンセーション法のいずれも採用することができる。
　また、本発明の安定同位体標識ペプチドとしては、前記の本件非標識ペプチドを構成するアミノ酸の１個以上が、１５Ｎ，１３Ｃ，１８Ｏ，及び２Ｈのいずれか１以上を含む安定同位体標識ペプチドであれば、アミノ酸の種類、位置、及び数は、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）で分離可能な質量差を有する限りにおいて特に制限されないが、中でも１３Ｃで６箇所標識されたロイシンを含むことがより好ましい。かかる安定同位体標識ペプチドは、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてＦ－ｍｏｃ法（Amblard., et al. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で目的ペプチドを化学合成することができる。また、安定同位体標識ペプチドは、定量対象ペプチドと標識アミノ酸の質量が異なる点以外では化学的に同一でＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定において同一の挙動を示すことから、質量分析装置を用いたタンパク質定量における内部標準ペプチドとして有利に用いることができる。
　本発明のキットとしては、本発明のペプチドを備えることを特徴とする、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量するためのキットであれば特に制限されないが、上記本発明のペプチドと同じアミノ酸配列からなる安定同位体標識ペプチドをさらに備えたものであることが好ましい。また、本発明のタンパク質定量用キットは、トリプシン又はリシルエンドペプチダーゼや、必要と目的に応じた緩衝液、ｐＨ調製剤、反応容器等をさらに備えたものであってもよい。
　本発明の使用方法としては、本発明のペプチドを、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量するための定量対象ペプチドとして使用する方法であれば特に制限されず、上記本発明のペプチドは、定量用の検量線作成に用いられ、上記本発明のペプチドと同じアミノ酸配列からなる安定同位体標識ペプチドは、定量用の検量線作成及び内部標準ペプチドとして用いられる。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
１．より高感度なタンパク質の定量方法の確立
　国際公開第２００７／０５５１１６号パンフレット、特開２０１０－１９７１１０号公報、及び特開２０１０－８５１０３号公報に記載された定量方法（以下、これらの定量方法を「従来の定量方法」と総称する場合もある）は、質量分析計で高感度に検出できるペプチドを選定するためのクライテリアを備えたものであった。本実施例においては、従来の定量方法と比較して、より高感度なタンパク質の定量方法（以下、「本発明の定量方法」と称する場合もある）を確立する目的で、（１）タンパク質の酵素処理工程の改良実験、及び（２）定量対象ペプチドとして、液体クロマトグラフィにより確実に分離できるペプチドを選択する基準を確立するための検討を行った。
（１）タンパク質の酵素処理工程の改良
　質量分析計を用いたタンパク質の定量を行う際に、酵素によるタンパク質の消化が不完全であると正確な定量値を得ることが出来ない。従来の定量方法においては、トリプシンによってタンパク質の消化を行っていた。トリプシンは、リシン（Ｋ）及びアルギニン（Ｒ）のカルボキシル基側のペプチド結合を加水分解する酵素であるが、アルギニン残基における切断効率と比較して、リシン残基における切断効率が低いと考えられていた。そこで、本実験においては、リシン残基を切断する活性を有する酵素であるリシルエンドペプチダーゼ（以下、「Ｌｙｓ－Ｃ」と記載する場合もある）を、トリプシンと組み合わせて用いることによって、効率的なタンパク質の分解が可能となるかを検討した（図２）。
　そこで、マウス肝臓から、超遠心処理及びスクロース密度勾配遠心によって細胞膜画分を調製し、細胞膜上に発現するタンパク質（ｎｔｃｐ及びｍｃｔ１）の消化効率について、トリプシン単独で消化した場合と、Ｌｙｓ－Ｃによる３時間の消化後に、トリプシンで１６時間消化した場合とを比較した。トリプシン及びＬｙｓ－Ｃの反応条件は以下の通りである。
＜トリプシン＞
トリプシン：Sequencing Grade Modified Trypsin，Frozen（プロメガ社製）
濃度：タンパク質量の１／１００量
バッファー組成：１．２Ｍ　ｕｒｅａ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０５％ProteaseMaxTM Surfactant
温度：３７℃
＜Ｌｙｓ－Ｃ＞
Ｌｙｓ－Ｃ：Lysyl Endopeptidase生化学用（和光純薬工業社製）
濃度：タンパク質量の１／１００量
バッファー組成：１．２Ｍ　ｕｒｅａ、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．０５％ProteaseMaxTM Surfactant
温度：室温
　結果を図３及び４にそれぞれ示す。図３及び４に示されるように、ｎｔｃｐタンパク質及びｍｃｔ１タンパク質の両方のタンパク質の消化効率は、トリプシン単独と比較して、Ｌｙｓ－Ｃ消化後にトリプシンで消化した場合に、大幅に上昇することが明らかとなった。次に、マウス肝臓から、超遠心処理及びスクロース密度勾配遠心によって細胞膜画分を調製し、該細胞膜分画を、トリプシン単独で１６時間消化した場合と、Ｌｙｓ－Ｃによる３時間の消化後にトリプシンで消化した場合の、４Ｆ２ｈｃ、ｍｒｐ６、ａｂｃｇ５、ａｂｃｇ８、ｏａｔｐ１、ｍｃｔ１、ｂｓｅｐ、ｎｔｃｐ、ｇｌｕｔ１、ｂｇｔ１、及びＮａ／Ｋ　ＡＴＰａｓｅのＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量値の違いを検討した。図５に結果を示すように、ｎｔｃｐは、トリプシン単独で消化した場合の定量値が３．７２であるのに対し、Ｌｙｓ－Ｃ消化後にトリプシンで消化した場合の定量値は２６．２であり、７倍もの差が認められた。以上のことから、トリプシンでの消化を行う前に、Ｌｙｓ－Ｃで消化を行うことにより、より正確な定量値を得ることが可能となることが明らかとなった。
（２）液体クロマトグラフ部における分離
　ＨＰＬＣ又はｎａｎｏＬＣにおいて、溶出時間が早すぎる場合には十分なペプチドの分離が行われず感度が低下することや、脱塩カラムやトラップカラムに保持されず定量できないことが考えられる。また、溶出時間が遅すぎる場合は、分離カラムへのペプチドの保持力が強いため、回収率の低下による感度の低下が考えられる。そこで、従来の定量方法により計測した既知のペプチド溶出位置から、各アミノ酸に対するパラメータを設定し測定に適した溶出時間を検討した。前記パラメータを用いて、７１のペプチドについて溶出時間を予測し、実際の溶出時間と比較した。結果を図６に示す。検討したペプチドのうち、８５％のペプチド（６０のペプチド）がパラメータから予測された溶出時間と５分以内の誤差に収まった。一方、パラメータからの予測時間と１０分以上の誤差が認められたペプチドはわずか２．８％（２つのペプチド）であった。この予測溶出時間に基づき定量に適した溶出時間を検討した結果、図７に示すように液体クロマトグラフィにより最も適切な分離が行われるペプチドが、溶出時間４０～６０分の間のものであることが明らかとなった。
　以下に上記の溶出時間予測に用いた７１のペプチドのアミノ酸配列を示す。
ＦＶＳＰＬＳＷＤＬＶＧＲ（配列番号３０９）
ＬＧＧＮＰＬＦＲ（配列番号３１０）
ＶＰＬＬＡＶＤＲ（配列番号３１１）
ＶＬＰＴＬＬＤＳＲ（配列番号３１２）
ＮＡＶＶＰＩＫ（配列番号３１３）
ＴＮＴＦＰＤＬＦＳＤＬＤＫ（配列番号３１４）
ＱＦＱＳＰＬＲ（配列番号３１５）
ＬＦＰＱＡＡＲ（配列番号３１６）
ＤＧＨＧＤＳＰＬＦＦＬＫ（配列番号３１７）
ＬＬＡＩＰＩＰＤＮＲ（配列番号３１８）
ＦＨＰＱＮＬＰＡＤＧＦＫ（配列番号３１９）
ＮＴＴＧＡＬＴＴＲ（配列番号３２０）
ＩＡＴＥＡＩＥＮＩＲ（配列番号３２１）
ＳＡＤＬＩＶＴＬＫ（配列番号３２２）
ＳＴＡＬＱＬＩＱＲ（配列番号３２３）
ＴＰＳＧＮＬＶＮＲ（配列番号３２４）
ＱＬＬＮＮＩＬＲ（配列番号３２５）
ＡＥＧＥＩＳＤＰＦＲ（配列番号３２６）
ＡＰＶＬＦＦＤＲ（配列番号３２７）
ＳＬＳＥＡＳＶＡＶＤＲ（配列番号３２８）
ＡＰＥＴＥＰＦＬＲ（配列番号３２９）
ＶＦＴＡＬＡＬＶＲ（配列番号３３０）
ＦＮＬＤＰＦＤＲ（配列番号３３１）
ＦＳＩＡＩＬＰＦＳＩＫ（配列番号３３２）
ＥＤＬＦＥＬＫ（配列番号３３３）
ＧＡＶＬＩＮＧＬＰＲ（配列番号３３４）
ＳＳＬＬＤＶＬＡＡＲ（配列番号３３５）
ＧＶＶＴＮＬＩＰＹＬＫ（配列番号３３６）
ＤＳＰＧＶＦＳＫ（配列番号３３７）
ＡＳＬＬＤＶＩＴＧＲ（配列番号３３８）
ＧＧＰＥＡＴＬＥＶＲ（配列番号３３９）
ＹＬＱＮＱＧＷＬＫ（配列番号３４０）
ＹＴＡＤＬＬＥＶＬＫ（配列番号３４１）
ＶＤＮＳＳＬＴＧＥＳＥＰＱＴＲ（配列番号３４２）
ＶＱＤＡＦＡＡＡＫ（配列番号３４３）
ＧＩＹＤＧＤＬＫ（配列番号３４４）
ＩＡＧＬＰＷＹＲ（配列番号３４５）
ＴＬＰＶＦＰＫ（配列番号３４６）
ＳＩＴＶＦＦＫ（配列番号３４７）
ＡＶＴＶＦＦＫ（配列番号３４８）
ＶＮＴＡＡＶＮＬＶＰＧＤＰＲ（配列番号３４９）
ＥＧＬＥＴＮＡＤＩＩＫ（配列番号３５０）
ＬＮＴＶＧＩＡＫ（配列番号３５１）
ＩＹＮＳＶＦＦＧＲ（配列番号３５２）
ＶＬＬＱＴＬＲ（配列番号３５３）
ＳＧＥＬＱＧＤＥＡＱＲ（配列番号３５４）
ＹＥＶＥＬＤＡＧＶＲ（配列番号３５５）
ＬＹＤＳＮＶＦＲ（配列番号３５６）
ＮＰＶＨＬＤＱＮＤＰＲ（配列番号３５７）
ＩＦＧＴＩＰＧＰＳＩＦＫ（配列番号３５８）
ＨＬＰＧＴＡＥＩＱＡＧＫ（配列番号３５９）
ＬＳＰＳＦＡＤＬＦＲ（配列番号３６０）
ＳＬＰＡＳＬＱＲ（配列番号３６１）
ＦＬＱＧＶＦＧＫ（配列番号３６２）
ＴＳＬＡＶＬＧＫ（配列番号３６３）
ＮＶＡＬＬＡＰＬＰＲ（配列番号３６４）
ＹＴＡＳＤＬＦＲ（配列番号３６５）
ＮＬＰＬＰＤＴＩＫ（配列番号３６６）
ＶＶＦＡＶＬＧＫ（配列番号３６７）
ＧＧＡＩＬＧＰＬＶＲ（配列番号３６８）
ＴＧＰＳＧＮＡＬＤＬＦＲ（配列番号３６９）
ＤＱＰＬＳＥＳＬＮＨＳＳＱＩＲ（配列番号３７０）
ＶＧＧＩＩＡＰＦＩＰＳＬＫ（配列番号３７１）
ＴＬＧＰＴＶＧＧＬＬＹＲ（配列番号３７２）
ＡＧＳＳＦＶＦＧＥＡＬＶＫ（配列番号３７３）
ＤＨＦＦＡＦＫ（配列番号３７４）
ＷＬＰＳＬＶＬＡＲ（配列番号３７５）
ＳＬＴＳＹＦＬＷＰＤＥＤＳＲ（配列番号３７６）
ＤＶＬＳＶＦＬＰＤＶＰＥＴＥＳ（配列番号３７７）
ＶＤＮＳＳＬＴＧＥＳＥＰＱＴＲ（配列番号３７８）
ＬＦＱＰＳＩＱＬＡＲ（配列番号３７９）
　実際に、従来の定量方法における測定対象ペプチドを選択するためのクライテリアに、前記のペプチドの溶出時間に関するクライテリアを追加して定量対象ペプチドの選定を行った。その結果、測定感度が改善されたペプチドを図８に示す。ＡＢＣＡ９、ＮＥＴ、ｘＣＴ、ＢＯＩＴ（ＢＯＣＴ）、ＭＤＲ１、ＣＹＰ２Ｃ８、及びＣＹＰ２Ｂ６は、従来の測定方法と比較して感度が大幅に上がり、検討した全ての定量対象ペプチド断片が１０ｆｍｏｌの濃度で検出された。また、ここで測定のために使用された定量対象ペプチドのアミノ酸配列は以下の通りである。
ＡＢＣＡ９：ＬＦＰＱＡＡＱＱＥＲ（配列番号３８０）
ＮＥＴ：ＦＴＰＡＡＥＦＹＥＲ（配列番号３８１）
ｘＣＴ：ＧＧＹＬＱＧＮＶＮＧＲ（配列番号３８２）
ＢＯＩＴ（ＢＯＣＴ）：ＱＰＰＰＴＲ（配列番号３８３）
ＭＤＲ１：ＦＹＤＰＬＡＧＫ（配列番号３８４）
ＣＹＰ２Ｃ８：ＥＨＱＡＳＬＤＶＮＮＰＲ（配列番号３８５）
ＣＹＰ２Ｂ６：ＧＹＩＩＰＫ（配列番号３８６）
２．本発明の定量方法を用いた分子標的薬の標的タンパク質の定量
　実施例１～３に記載のように、従来の定量方法を改良することにより、より高感度の本発明の定量方法が確立できることが明らかとなった。図９に示すように、現在のがん治療には様々な分子標的薬が使用されており、個々の患者における標的分子の発現を解析することは、治療薬を選択する上で非常に重要な指標となり得る。そこで、がんの個別化治療法の開発を行うために、現在一般的に用いられている分子標的薬の標的タンパク質が、前記本発明の定量方法により定量できるかどうかを検討した。図１０に結果を示すように、分子標的薬の標的として知られる各種タンパク質（ＰＤＧＦＲα、ＰＤＧＦＲβ、ＥＧＦＲ－ｐｅｐ３、ＰＤＧＦＲα、ＣＤ３３、Ｎａ+／Ｋ+ＡＴＰａｓｅ、ＨＥＲ２、ＣＤ３７、ＥＧＦＲ－ｐｅｐ２、ＥＧＦＲ－ｐｅｐ１、ＩＧＦＲ、及びｃ－ｋｉｔ）はいずれも、５ｆｍｏｌ／ｉｎｊｅｃｔｉｏｎで定量できることが明らかとなった。次に、本発明の定量方法により、実際のヒト脳腫瘍検体細胞膜分画中の分子標的薬の標的タンパク質を定量した。図１１に結果を示すように、実際のヒト脳腫瘍検体細胞膜分画において、ＰＤＧＦＲβ、ＦＬＴ３、ＥＧＦＲ－ｐｅｐ２、ＨＥＲ２、ＶＥＧＦＲ１、ＣＤ３３、ＣＤ３７、及びｃ－ｋｉｔが、本発明の定量方法の検出限界（ｆｍｏｌ／μｇタンパク質）以上の濃度で存在しており、これらのタンパク質については定量できることが明らかとなった。また、実験に用いたヒト脳腫瘍検体細胞膜分画における、ＶＥＧＦＲ２、ＭＥＴ（ＨＧＦＲ）、ＩＧＦＲ、及びＦＬＴ３の濃度は、本発明の定量方法の検出限界（ｆｍｏｌ／μｇタンパク質）以下であることが明らかとなった。
３．腫瘍組織におけるタンパク質の定量と個別化治療の確立
　実施例４に記載のように、本発明の定量方法を用いて、分子標的薬の標的タンパク質を高感度で定量できることが明らかとなった。そこで、本発明の定量方法を用いて、脳腫瘍組織における様々な分子標的薬の標的タンパク質の定量を行い、得られた結果に基づいて脳腫瘍患者の個別化治療を行った。
（１）患者
　右蝶形骨縁退形成性髄膜腫の女性患者（６２歳）。２度の腫瘍摘出術及び放射線治療（全脳照射＋播種性病変へのLINACsurgery）を実施したが、１ヵ月後に原発巣の再発と播種性病変の増悪が認められた。
（２）細胞膜分画の調製
　前記患者より摘出された検体を凍結保存し、以下の実験に用いた。凍結保存された検体を細切し、組織湿重量の１／１００量のＰＭＳＦ及びプロテアーゼインヒビターを含む氷冷した低張緩衝液（１０ｍＭ　ＮａＣｌ、１．５ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）を加えた。テフロン（登録商標）製ホモジナイザー（１０ストローク）により組織を破砕し、３０分間氷中で静置した後、再び、テフロン（登録商標）製ホモジナイザー（２０ストローク）により組織を破砕した。このようにして得られた破砕組織懸濁液を全組織ライセートとした。また、前記のテフロン（登録商標）製ホモジナイザーによる組織を破砕処理後に顕微鏡で組織の破砕状況を確認し、細胞が十分に破砕されていなかった場合には、破砕組織懸濁液を窒素ガス細胞破砕器に移し、nitrogen cavitation法（４５０ｐｓｉ、１５分、４℃）によって、細胞を破砕した。
　得られた全組織ライセートを遠心（１０，０００ｇ、１０分、４℃）して上清を回収し、debris分画を取り除いた。得られた上清を、さらに超遠心（１００，０００ｇ、４０分、４℃）し、ペレットを回収した。このペレットを、氷冷したサスペンジョン緩衝液［２５０ｍＭ　ｓｕｃｒｏｓｅ　（８．５６％　ｓｕｃｒｏｓｅ）、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４］で懸濁した。作製した懸濁液を、３８％スクロース溶液（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）に重層して、超遠心（１００，０００ｇ、４０分、４℃）し、中間層を回収した。この中間層を、再度、超遠心（１００，０００ｇ、４０分、４℃）し、得られたペレットを細胞膜分画とした。回収した細胞膜分画を、氷冷したサスペンジョン緩衝液［２５０ｍＭ　ｓｕｃｒｏｓｅ　（８．５６％　ｓｕｃｒｏｓｅ）、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４］で懸濁した。
（３）細胞膜分画の還元アルキル化及び酵素消化処理
　調製した細胞膜分画のタンパク質量は、ＤＣプロテインアッセイキットを用いて定量した。細胞膜分画懸濁液に、細胞膜分画懸濁液と等容量以上のアルキル化バッファー（７Ｍ　グアニジン塩酸塩、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ－２Ｎａ、０．５Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５）を加えて、計２２０μＬとした。ここにタンパク質量と等量のジチオトレイトールを加えて１時間撹拌した。その後、さらに、タンパク質量の２．５倍量のヨードアセトアミドを加え、遮光下で１時間撹拌した。撹拌後に、氷冷した６００μＬのメタノール、氷冷した１５０μＬのクロロホルム、及び氷冷した４５０μＬのミリＱ水を順次加え、スイングローターを用いて遠心（１２，０００ｒｐｍ、３分、４℃）した。遠心後に上清を取り除き、氷冷した４５０μＬのメタノールをさらに加えて、再度遠心（１５，０００ｒｐｍ、５分、４℃）した。遠心後に完全に上清を取り除き、タンパク質試料を回収した。前記のメタノール－クロロホルム沈殿処理によって得られたタンパク質試料を、６Ｍ尿素（０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５）に溶解し、尿素の最終濃度が１．２Ｍとなるように、０．１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）を加えた。さらに、最終濃度が０．０５％となるように１％のProteaseMAXTM Surfactant（プロメガ社製）を加えた。次に、ここに含まれるタンパク質量の１／１００量のリシルエンドペプチダーゼを加えて、室温で３時間酵素処理した。リシルエンドペプチダーゼ処理後に、さらに、タンパク質量の１／１００量のトリプシンを加えて、３７℃で１６時間酵素処理を行った。
（４）ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる定量
　ＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いて調製した試料に含まれる、薬物トランスポーターや受容体チロシンキナーゼを含む腫瘍細胞膜タンパク発現量を解析した。定量の条件を以下に示す。（液体クロマトグラフ部）
ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００　ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；
カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　ＢＥＨ１３０　Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；
移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；
流速：０～６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０～９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；
濃度勾配：０分～５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分～５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６～５８分では１００％移動相Ｂ、６０～９０分にでは９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；
ＭＳ／ＭＳ：ESI-Triple Quadrupole Mass Spectrometer（ＱＴＲＡＰ５５００；ＡＢ　ＳＣＩＥＸ社製）；
（５）腫瘍組織におけるタンパク質の定量結果
　図１２の右上図に、本発明のＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いたタンパク質定量方法による定量結果を示す。図１２の右上図に示されるように、前記女性患者の脳腫瘍組織においては、他の分子標的薬の標的タンパク質と比較して、ＰＤＧＦＲβの発現が高いことが明らかとなった。そこで、学内倫理審査委員会の承認を得て、前記女性患者に、ＰＤＧＦＲβを阻害する分子標的薬スニチニブ（sunitinib）を、１クールを１２．５ｍｇｘ２回／日、２８日間の条件で投与したところ、開始２週間後に原発巣及び播種巣を含む造影病変の内部壊死と見られるＭＲＩ所見が得られた。結果を図１２の下パネルに示す。以上のように、本発明の定量方法を用いて、検体における分子標的薬の標的タンパク質の発現量を解析し、得られたデータに基づいて、ＭＩＢ１インデックスが６０％以上を示す、制御の難しい腫瘍であっても腫瘍増殖を制御することができた。

Claims (11)

  1. 液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量するために用いるペプチドであって、以下の工程［Ａ］及び［Ｂ］により選択されることを特徴とするペプチド。
    ［Ａ］以下の必須クライテリア（１）～（３）を満たすペプチドを選択する工程；
    　　（１）前記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質をトリプシンにより断片化することにより得られるペプチドであること；
    　　（２）前記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなるペプチドであること； 
    　　（３）各アミノ酸における溶出時間パラメータを設定し、該溶出時間パラメータに基づいて、以下の条件（ｉ）～（ｖ）の液体クロマトグラフィによる予測溶出時間を算定したとき、該予測溶出時間が３０～７０分の範囲内であるペプチドであること； 
    　　　　（ｉ）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００　ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；
    　　　　（ii）カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　ＢＥＨ１３０　Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；
    　　　　（iii）移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；
    　　　　（iv）流速：０～６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０～９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；
    　　　　（ｖ）濃度勾配：０分～５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分～５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６～５８分では１００％移動相Ｂ、６０～９０分にでは９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；
    ［Ｂ］以下の選択クライテリア（４）～（１５）に基づいてスコア合計値を算定し、該スコア合計値の高いペプチドを優先的に選択する工程；
    　　（４）トリプトファン、チロシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニンから選択される疎水アミノ酸の含量が８０％以下であり、且つ、前記疎水アミノ酸が１０アミノ酸以上連続しないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（５）アミノ酸残基数が４～３０のペプチドである場合、スコア３を付与する；
    　　（６）タンパク質データベースのアノテーション情報において、糖鎖付加されないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（７）翻訳後修飾タンパク質を定量する場合を除き、翻訳後修飾部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（８）１塩基多型（ＳＮＰ）部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（９）タンパク質分解酵素切断部がアルギニン－アルギニン、アルギニン－リジン、リジン－アルギニン、リジン－リジンではないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（１０）タンパク質の構造が決定又は予測されている場合に、膜貫通領域を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（１１）メチオニン、システインを含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（１２）トリプトファンを含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；
    　　（１３）グルタミン酸を含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；
    　　（１４）ヒスチジンを含まないペプチドである場合、スコア２を付与する；
    　　（１５）プロリンを含むペプチドである場合、スコア２を付与する；
  2. 配列番号１～３０８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるペプチドであることを特徴とする請求項１記載のペプチド。
  3. 選択クライテリア（３）の予測溶出時間が４０～６０分であることを特徴とする請求項１又は２記載のペプチド。
  4. 選択クライテリア（４）の疎水アミノ酸の含量が５０％以下であり、且つ、選択クライテリア（５）のアミノ酸残基数が６～１６のペプチドであることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載のペプチド。
  5. 液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量するために用いるペプチドの選定方法であって、以下の工程［Ａ］及び［Ｂ］により選択されることを特徴とする方法。
    ［Ａ］以下の必須クライテリア（１）～（３）を満たすペプチドを選択する工程；
    　　（１）前記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質をトリプシンにより断片化することにより得られるペプチドであること；
    　　（２）前記疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質に特異的なアミノ酸配列からなるペプチドであること； 
    　　（３）各アミノ酸における溶出時間パラメータを設定し、該溶出時間パラメータに基づいて、以下の条件（ｉ）～（ｖ）の液体クロマトグラフィによる予測溶出時間を算定したとき、該予測溶出時間が３０～７０分の範囲内であるペプチドであること； 
    　　　　（ｉ）ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ　１２００　ＨＰＬＣシステム（アジレント・テクノロジー社製）；
    　　　　（ii）カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ　ＢＥＨ１３０　Ｃ１８、３．５μｍ、１００ｘ１．０ｍｍ（ウォーターズ社製）；
    　　　　（iii）移動相：０．１％ギ酸／ミリＱ水からなる移動相Ａ、０．１％ギ酸／アセトニトリルからなる移動相Ｂ；
    　　　　（iv）流速：０～６０分では５０μＬ／ｍｉｎ、６０～９０分では１００μＬ／ｍｉｎ；
    　　　　（ｖ）濃度勾配：０分～５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５分～５５分では９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）から５０／５０（移動相Ａ／移動相Ｂ）、５６～５８分では１００％移動相Ｂ、６０～９０分にでは９９／１（移動相Ａ／移動相Ｂ）；
    ［Ｂ］以下の選択クライテリア（４）～（１５）に基づいてスコア合計値を算定し、該スコア合計値の高いペプチドを優先的に選択する工程；
    　　（４）トリプトファン、チロシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、及びフェニルアラニンから選択される疎水アミノ酸の含量が８０％以下であり、且つ、前記疎水アミノ酸が１０アミノ酸以上連続しないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（５）アミノ酸残基数が４～３０のペプチドである場合、スコア３を付与する；
    　　（６）タンパク質データベースのアノテーション情報において、糖鎖付加されないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（７）翻訳後修飾タンパク質を定量する場合を除き、翻訳後修飾部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（８）１塩基多型（ＳＮＰ）部位を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（９）タンパク質分解酵素切断部がアルギニン－アルギニン、アルギニン－リジン、リジン－アルギニン、リジン－リジンではないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（１０）タンパク質の構造が決定又は予測されている場合に、膜貫通領域を含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（１１）メチオニン、システインを含まないペプチドである場合、スコア１０を付与する；
    　　（１２）トリプトファンを含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；
    　　（１３）グルタミン酸を含まないペプチドである場合、スコア１を付与する；
    　　（１４）ヒスチジンを含まないペプチドである場合、スコア２を付与する；
    　　（１５）プロリンを含むペプチドである場合、スコア２を付与する；
  6. 選択クライテリア（３）の予測溶出時間が４０～６０分であることを特徴とする請求項５記載の方法。
  7. 選択クライテリア（４）の疎水アミノ酸の含量が５０％以下であり、且つ、選択クライテリア（５）のアミノ酸残基数が６～１６のペプチドであることを特徴とする請求項５又は６記載の方法。
  8. 以下の工程（ａ）～（ｄ）を備えた、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析装置（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量する方法であって、定量対象ペプチドが、請求項１～４のいずれか記載のペプチドであることを特徴とする方法。
    （ａ）試料中の被定量タンパク質をトリプシンによって断片化し、被定量タンパク質のペプチド断片を調製する工程；
    （ｂ）前記定量対象ペプチド、及び前記定量対象ペプチドと同配列の安定同位体標識ペプチドを用いて、それぞれの所定濃度段階に対するＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、検量線を作成する工程；
    （ｃ）前記被定量タンパク質のペプチド断片に、前記安定同位体標識ペプチドを添加してＬＣ／ＭＳ／ＭＳを用いた質量分析を行い、被定量タンパク質ペプチド／安定同位体標識ペプチドのマススペクトル面積比を算出する工程；
    （ｄ）該面積比から検量線を用いて定量値を算出する工程；
  9. ペプチド断片を調製する工程が、あらかじめリシルエンドペプチダーゼを用いて断片化した試料中の被定量タンパク質を、さらにトリプシンを用いて断片化する工程であることを特徴とする請求項８記載の方法。
  10. 試料が、生体から採取された細胞、組織、又は血液であることを特徴とする請求項８又は９記載の方法。
  11. 請求項１～４のいずれか記載のペプチドを備えることを特徴とする、疾患の治療又は診断の指標となるタンパク質を定量するためのキット。
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