CN110320287A - 一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法 - Google Patents

一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110320287A
CN110320287A CN201810279340.0A CN201810279340A CN110320287A CN 110320287 A CN110320287 A CN 110320287A CN 201810279340 A CN201810279340 A CN 201810279340A CN 110320287 A CN110320287 A CN 110320287A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mobile phase
substance
relation
tyrosine
analysis method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810279340.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110320287B (zh
Inventor
宋慧琴
田雪春
郭志强
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
TIANJIN PHARMACEUTICALS GROUP CORP
Original Assignee
TIANJIN PHARMACEUTICALS GROUP CORP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by TIANJIN PHARMACEUTICALS GROUP CORP filed Critical TIANJIN PHARMACEUTICALS GROUP CORP
Priority to CN201810279340.0A priority Critical patent/CN110320287B/zh
Publication of CN110320287A publication Critical patent/CN110320287A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110320287B publication Critical patent/CN110320287B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
    • G01N2030/042—Standards
    • G01N2030/047—Standards external

Landscapes

  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)

Abstract

本发明提供一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，以氨基键合硅胶为填充色谱柱，采用紫外检测器检测，检测波长为210～220nm，流动相由A相和B相组成，流动相A为乙腈，流动相B为磷酸盐缓冲液，流动相A：流动B为60～70：30～40。本发明的方法可快速准确检测酪氨酸含量和其相关杂质，具有良好的专属性适用于原料酪氨酸检测；选择流动相便宜易得，操作过程较为简单方便，准确，重复性好。

Description

一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法
技术领域
本发明属于发明技术领域，尤其是涉及一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法。
背景技术
氨基酸类物质被普遍定义为营养类物质，其杂质也是其它氨基酸，不存在安全风险，故并没有人研究氨基酸类的杂质。目前，国内外没有文献及药典对酪氨酸的有关物质测定方法进行报道和收载，各国药典，仅采用薄层色谱法对纯度进行控制，未涉及仪器检测进行有关物质定量控制。
酪氨酸作为原料被广泛用于氨基酸复合制剂使用，酪氨酸含量测定方法收载于CP2015、EP9.0、USP40、JP17，方法均为电位滴定法，较之液相测定方法专属性稍差，故本发明建立外标含量测定方法。
酪氨酸杂质含量直接决定了成品制剂中的杂质含量，随着药品研发水平的提升以及相关制剂的不良反应日益被关注，国内审评专家和业内专业人员均开始对酪氨酸相关品种的杂质进行研究。
发明内容
本发明目的是提供一种酪氨酸含量和有关物质分析检测方法。该方法专属性好，重复性好，灵敏度高，可用于酪氨酸含量和有关物质的控制。
本发明根据酪氨酸的理化性质，开发了一套液相色谱体系对其进行测定。本方法可用于准确控制酪氨酸的含量、工艺及降解杂质，并可用于指导稳定性样品的考察。
本发明的技术方案是：
一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，以氨基键合硅胶为填充色谱柱，采用紫外检测器检测，检测波长为210～220nm，流动相由A相和B相组成，流动相A为乙腈，流动相B为磷酸盐缓冲液，流动相A：流动B为60～70：30～40。
为了取得更好的技术效果，所述一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法中，流动相A和流动相B的比例为65:35。
为了取得更好的技术效果，所述一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法中，检测波长为215nm。
为了取得更好的技术效果，所述一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法中，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L～0.08mol/L，pH值4.0～5.0。
为了取得更好的技术效果，所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH值4.5。
为了取得更好的技术效果，所述一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法中，进样量为15-25ul。
为了取得更好的技术效果，所述进样量为20ul。
为了取得更好的技术效果，所述一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法中，所用流速为0.5ml/min～1.0ml/min；
为了取得更好的技术效果，所用流速为0.8ml/min；
为了取得更好的技术效果，所述一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法中，所用柱温为25℃～35℃；
为了取得更好的技术效果，所用柱温为30℃；
本发明对酪氨酸有关物质的方法学验证结果：空白溶液对酪氨酸有关物质检测无干扰，主峰与各杂质峰分离度良好，供试品中酪氨酸色谱峰的纯度因子大于阈值，证明酪氨酸主峰为纯峰，方法专属性良好。酪氨酸检测限浓度为0.064μg/ml，酪氨酸的定量限浓度为0.128μg/ml，线性范围0.128μg/ml～7.695μg/ml(相当于供试品溶液浓度的0.0025％～1.500％)。具有良好的准确度及重复性，中间精密度良好，溶液稳定性良好。
本发明通过酪氨酸含量方法学验证，检测的线性范围为0.3040mg～0.7600mg/ml(相当于供试品溶液浓度的60％～150％)，平均回收率为99.56％，具有良好的准确度及重复性，中间精密度良好，溶液稳定性良好。
本发明所检测有关物质包括未知杂质RRT1.3、RRT1.8和总杂质。
氨基酸类原料，普遍存在紫外吸收较弱且末端吸收的问题，本发明所提供的方法通过全波长扫描确立最佳波长用于检测酪氨酸及其相关杂质，且通过方法学验证后，专属性良好。
色谱柱选择，通过比较各种填充材料色谱柱，最终选择氨基键合硅胶填充色谱柱以达到更好分离氨基酸类杂质，使各成分峰保留时间及分离度显著改善。
流动相成分建立选择磷酸盐作为缓冲盐体系，使保留时间较短的氨基酸类物质，保留时间明显延后，达到主峰及各杂质有效分离。同时，适宜的PH值选择既可以保护色谱柱的氨基减缓流失，也使样品达到最佳解离常数，检出结果稳定可靠。
样品配制方式选用流动相溶解后直接进样，避免传统氨基酸类物质衍生所带来的耗时、准确度差的问题，达到快速准确的有效检测。
综上，本发明的方法可快速准确检测酪氨酸含量和其相关杂质，具有良好的专属性适用于原料酪氨酸检测；选择流动相便宜易得，操作过程较为简单方便，准确，重复性好。
附图说明
图1是实施例1空白溶液色谱图
图2是实施例1样品溶液色谱图
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明作进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。本领域的技术人员应理解，对本发明的技术特征所作的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。
含量测定方法：
溶液配制：
空白溶液：流动相
供试品溶液：取供试品约25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加7.5ml 0.1mol/l盐酸溶液，超声使溶解，加水稀释定容至刻度，摇匀，作为供试品贮备液。精密量取供试品贮备液5ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释定容至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
对照溶液：取对照品约20mg，精密称定，置20ml量瓶中，加6ml 0.1mol/l盐酸溶液，超声使溶，加水稀释定容至刻度，摇匀，备用。精密量取上述溶液5ml，置10ml量瓶中，加流动相稀释定容至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算，即得含量。
有关物质测定方法：
溶液配置：
空白溶液和供试品溶液的配制同含量测定方法中的配制。
自身对照溶液：精密量取样品溶液1ml，置100ml量瓶中，加流动相稀释定容至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。
精密量取对照品溶液和供试品溶液各20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。按照自身对照法计算单个杂质和杂质总量。
实施例1
色谱条件：
高效液相色谱仪：HPLC
色谱柱：氨基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(250×4.6mm，5.0μm)
流动相：
流动相A：乙腈 流动相B：缓冲盐溶液(磷酸调pH＝4.5)
流动相A：流动相B＝65:35
检测波长：215nm 柱温：30℃
流速：0.8ml/min 进样量：20μl
检测结果：
名称 分离度 含量
酪氨酸(RT 6.837) / 99.28％
RRT 1.3 6.037 0.034％
RRT 1.8 5.279 0.082％
实施例2
色谱条件：
高效液相色谱仪：HPLC
色谱柱：氨基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(250×4.6mm，5.0μm)
流动相：
流动相A：乙腈 流动相B：缓冲盐溶液(磷酸调pH＝4.5)
流动相A：流动相B＝60:35
检测波长：212nm 柱温：28℃
流速：0.6ml/min 进样量：15μl
检测结果：
名称 分离度 含量
酪氨酸(RT 6.843) / 99.26％
RRT 1.3 6.329 0.034％
RRT 1.8 5.511 0.083％
实施例3
色谱条件：
高效液相色谱仪：HPLC
色谱柱：氨基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(250×4.6mm，5.0μm)
流动相：
流动相A：乙腈 流动相B：缓冲盐溶液(磷酸调pH＝4.5)
流动相A：流动相B＝65:38
检测波长：212nm 柱温：28℃
流速：0.6ml/min 进样量：18μl
检测结果：
名称 分离度 含量
酪氨酸(RT 6.850) / 99.29％
RRT 1.3 6.431 0.033％
RRT 1.8 5.608 0.081％
实施例4
色谱条件：
高效液相色谱仪：HPLC
色谱柱：氨基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(250×4.6mm，5.0μm)
流动相：
流动相A：乙腈 流动相B：缓冲盐溶液(磷酸调pH＝5.0)
流动相A：流动相B＝65:35
检测波长：212nm 柱温：28℃
流速：0.6ml/min 进样量：22μl
检测结果：
名称 分离度 含量
酪氨酸(RT 6.837) / 99.62％
RRT 1.3 6.037 0.034％
RRT 1.8 5.279 0.081％
对比实施例1
色谱条件：
高效液相色谱仪：HPLC
色谱柱：氨基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(250×4.6mm，5.0μm)
流动相：
流动相A：乙腈 流动相B：缓冲盐溶液(磷酸调pH＝4.5)
流动相A：流动相B＝75:25
检测波长：215nm 柱温：30℃
流速：0.8ml/min 进样量：20μl
名称 分离度 含量
酪氨酸(RT 10.279) / /
RRT 1.3 0.96 /
RRT 1.8 1.03 /
对比实施例2
色谱条件：
高效液相色谱仪：HPLC
色谱柱：氨基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(250×4.6mm，5.0μm)
流动相：
流动相A：乙腈 流动相B：缓冲盐溶液(磷酸调pH＝4.5)
流动相A：流动相B＝57:43
检测波长：212nm 柱温：28℃
流速：0.6ml/min 进样量：15μl
名称 分离度 含量
酪氨酸((RT 5.946)) / /
RRT 1.3 1.04 /
RRT 1.8 0.86 /
对比实施例3
色谱条件：
高效液相色谱仪：HPLC
色谱柱：氨基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(250×4.6mm，5.0μm)
流动相：
流动相A：乙腈 流动相B：缓冲盐溶液(磷酸调pH＝5.5)
流动相A：流动相B＝65:35
检测波长：212nm 柱温：28℃
流速：0.6ml/min 进样量：18μl
名称 分离度 含量
酪氨酸(RT 6.361) / /
RRT 1.3 1.72 /
RRT 1.8 0.52 /
实施例5酪氨酸含量的线性与范围
5.1测定
精密称取酪氨酸对照品101.33mg置100ml量瓶中，用适量溶剂溶解，并稀释定容，摇匀，作为贮备溶液液。精密量取上述贮备溶液逐级稀释，在供试品浓度的60％～150％范围之间选取5-7个浓度点进行检测，以主峰浓度对主峰面积的函数作图，用最小二乘法进行曲线回归，该曲线的线性回归系数R不得小于0.999。
5.2线性实验结果
酪氨酸的浓度在0.3040mg～0.7600mg/ml(相当于供试品溶液浓度的60％～150％)范围内，线性关系良好。
实施例6酪氨酸有关物质的线性与范围
6.1测定
取酪氨酸对照品10.26mg，精密称定，置10ml量瓶中，用适量溶剂溶解，并稀释定容，摇匀，作为贮备溶液液。精密量取上述贮备溶液逐级稀释，在定量限浓度至自身对照浓度的150％范围之间选取5-7个浓度点进行检测，以主峰浓度对主峰面积的函数作图，用最小二乘法进行曲线回归，该曲线的线性回归系数R不得小于0.999。实验结果见下表。
6.2线性实验结果
酪氨酸的浓度在0.128μg～7.695μg/ml(相当于供试品溶液浓度的0.025％～1.500％)范围内，线性关系良好；
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。

Claims (10)

1.一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，其特征在于：以氨基键合硅胶为填充色谱柱，采用紫外检测器检测，检测波长为210～220nm，流动相由A相和B相组成，流动相A为乙腈，流动相B为磷酸盐缓冲液，流动相A：流动B为60～70：30～40。
2.根据权利要求1所述的一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，其特征在于：流动相A和流动相B的比例为65:35。
3.根据权利要求1所述的一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，其特征在于：检测波长为215nm。
4.根据权利要求1所述的一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.02mol/L～0.08mol/L，pH值4.0～5.0。
5.根据权利要求1所述的一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液的浓度为0.05mol/L，pH值4.5。
6.根据权利要求1所述的一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，其特征在于：进样量为15-25ul。
7.根据权利要求1所述的一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，其特征在于：所述进样量为20ul。
8.根据权利要求1所述的一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，其特征在于：所用流速为0.5ml/min～1.0ml/min。
9.根据权利要求1所述的一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，其特征在于：为0.8ml/min。
10.根据权利要求1所述的一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法，其特征在于：所用柱温为25℃～35℃。
CN201810279340.0A 2018-03-31 2018-03-31 一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法 Active CN110320287B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810279340.0A CN110320287B (zh) 2018-03-31 2018-03-31 一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810279340.0A CN110320287B (zh) 2018-03-31 2018-03-31 一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110320287A true CN110320287A (zh) 2019-10-11
CN110320287B CN110320287B (zh) 2022-08-09

Family

ID=68111997

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810279340.0A Active CN110320287B (zh) 2018-03-31 2018-03-31 一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110320287B (zh)

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102841151A (zh) * 2012-08-31 2012-12-26 石家庄中硕药业集团有限公司 一种甘氨酸含量的测定方法
CN103197022A (zh) * 2013-04-25 2013-07-10 山西省食品质量安全监督检验研究所 一种检测食醋中所含氨基酸的方法
WO2014037977A1 (ja) * 2012-09-05 2014-03-13 国立大学法人東北大学 個別化治療診断のためのマーカータンパク質絶対量の定量方法
CN104198643A (zh) * 2014-09-21 2014-12-10 上海海洋大学 一种同时测定三种芳香族氨基酸含量的方法
CN106556651A (zh) * 2015-09-30 2017-04-05 深圳翰宇药业股份有限公司 检测丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和/或酪氨酸的方法
CN107192783A (zh) * 2017-07-31 2017-09-22 中国中医科学院医学实验中心 液相色谱质谱联用直接检测生物组织非均匀样本中氨基酸的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102841151A (zh) * 2012-08-31 2012-12-26 石家庄中硕药业集团有限公司 一种甘氨酸含量的测定方法
WO2014037977A1 (ja) * 2012-09-05 2014-03-13 国立大学法人東北大学 個別化治療診断のためのマーカータンパク質絶対量の定量方法
CN103197022A (zh) * 2013-04-25 2013-07-10 山西省食品质量安全监督检验研究所 一种检测食醋中所含氨基酸的方法
CN104198643A (zh) * 2014-09-21 2014-12-10 上海海洋大学 一种同时测定三种芳香族氨基酸含量的方法
CN106556651A (zh) * 2015-09-30 2017-04-05 深圳翰宇药业股份有限公司 检测丙氨酸、赖氨酸、谷氨酸和/或酪氨酸的方法
CN107192783A (zh) * 2017-07-31 2017-09-22 中国中医科学院医学实验中心 液相色谱质谱联用直接检测生物组织非均匀样本中氨基酸的方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LANDIS W. DONER ET AL.: "High-performance liquid chromatographic separation of ascorbic acid, erythorbic acid, dehydroascorbic acid, dehydroerythorbic acid, diketogulonic acid, and diketogluconic acid", 《ANALYTICAL BIOCHEMISTRY》 *
YOUNG-ME SONG ET AL.: "Improved Phosphotyrosine Analysis by TLC and HPLC", 《ARCHIVES OF PHARMACAL RESEARCH》 *
刘利聪等: "高效液相色谱法检测转化液中β-丙氨酸含量", 《工业技术创新》 *
徐晖等: "HPLC测定注射用甲硫氨酸维生素B_1中甲硫氨酸的含量", 《华西药学杂志》 *
王荣梅: "高效液相色谱法测定盐酸精氨酸注射液的含量", 《中国生化药物杂志》 *
纪宇: "HPLC法直接测定复方氨基酸注射液中的6种氨基酸", 《中国药品标准》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110320287B (zh) 2022-08-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107907603B (zh) 一种测定氨基酸类注射液色氨酸有关物质的测定方法
CN104965041A (zh) 一种帕瑞昔布钠异构体的高效液相色谱检测方法
CN103487518B (zh) 注射用盐酸克林霉素杂质的检测方法及含量测定方法
CN103076409B (zh) 奥拉西坦及其杂质的分析检测方法
CN112946099B (zh) 一种氨基酸葡萄糖注射液中有关物质的检测方法
CN110849980A (zh) 一种l-丙氨酸异丙酯中对映异构体含量的检测方法
CN111323527B (zh) 一种用复合二维液相色谱同时测定多种精神药物的方法
CN110243963A (zh) 一种人血浆中卡托普利的lc-ms/ms检测方法
CN109725099A (zh) 一种缬氨酸的高效液相检测方法
CN111220733A (zh) 高效毛细管电泳测定l-肌肽的方法及其应用于聚普瑞锌的质量评价
CN110320287A (zh) 一种酪氨酸含量和有关物质的分析方法
CN108072717B (zh) 一种精氨酸溶液的检测方法
CN102636582B (zh) 测定三氮脒颗粒中三氮脒和安替比林含量的方法
CN114563495A (zh) 一种乙酰半胱氨酸及其有关物质的检测方法
CN110095554B (zh) 高效液相色谱分析米力农有关物质的方法
CN114518413A (zh) 一种卡托普利原料药中脯氨酸的含量测定方法
CN108918694B (zh) 一种msx残留的hplc柱前衍生化检测方法
CN110455955A (zh) 一种精氨酸中杂质的检测方法
CN111323492A (zh) 一种复合色谱柱以及一种二维液相色谱系统
CN112858511B (zh) 维生素冻干粉针剂中n-(4-氨基苯甲酰)-l-谷氨酸的检测方法
CN115236255B (zh) 一种洛索洛芬钠有关物质检测方法
CN117420224B (zh) 一种反相高效液相色谱法检测人促红素注射液中人血白蛋白含量的方法
CN114200050B (zh) 一种对溴苯甲醚中的有关物质含量的hplc检测方法
CN112198236B (zh) 一种瓜氨酸原料中瓜氨酸含量的检测方法
CN103163227A (zh) 一种测定非布司他及其制剂有关物质的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: 300457 Tianjin Binhai New Area Development Zone West District Xinye nine Street North, Xinhuan West Road East.

Applicant after: Tianjin Pharmaceutical Research Institute Co.,Ltd.

Address before: 300457 Tianjin Binhai New Area Development Zone West District Xinye nine Street North, Xinhuan West Road East.

Applicant before: TIANJIN PHARMACEUTICALS Group Corp.

SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant