CN109725099A - 一种缬氨酸的高效液相检测方法 - Google Patents

一种缬氨酸的高效液相检测方法 Download PDF

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何连顺
李斌水
糙吉
马静
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Abstract

本发明涉及柱色谱技术领域，尤其涉及一种缬氨酸的高效液相检测方法。其色谱条件为：色谱柱：氨基键合硅胶色谱柱；流动相：体积比为25‑29:71‑75的磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为48‑52mmol/L，pH值为2.5‑2.7；流速：0.7‑1.0mL/min；柱温：25‑35℃；检测波长：205nm；进行高效液相色谱分析，测定含有缬氨酸的溶液中缬氨酸的含量。在本发明提供的检测条件下，缬氨酸与各杂质以及各杂质之间的分离均较好，出峰时间较为合适，预处理步骤简单，缬氨酸不需要衍生，检测时间短。

Description

一种缬氨酸的高效液相检测方法
技术领域
本发明涉及柱色谱技术领域，尤其涉及一种缬氨酸的高效液相检测方法。
背景技术
酮缬氨酸钙在体内利用非必需氨基酸的氮转化为缬氨酸而发挥作用。缬氨酸为人体8种必需氨基酸之一，属于支链氨基酸。缬氨酸是组成蛋白质的20种氨基酸之一，化学名称为2-氨基-3-甲基丁酸，属于支链氨基酸，也是人体必需的8种氨基酸和生糖氨基酸，它与其他两种高浓度氨基酸(异亮氨酸和亮氨酸)一起工作促进身体正常生长，修复组织，调节血糖，并提供需要的能量。
缬氨酸是制备酮缬氨酸钙的起始原料，由于生产前需对原料药进行质量检测。现有技术中公开了在线衍生-液相色谱的检测方法，但该方法检测时间长，一个样品需35min，且需梯度洗脱，缬氨酸检测预处理步骤复杂，对高效液相色谱仪、配制流动相的试剂要求较高。因此，需要建立快速准确的缬氨酸定量检测方法，以满足生产过程中质量控制的需要。
发明内容
针对现有缬氨酸检测预处理步骤复杂、检测时间长的问题，本发明提供一种缬氨酸的高效液相检测方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种缬氨酸的高效液相检测方法，在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析，测定含有缬氨酸的溶液中缬氨酸的含量：
色谱柱：氨基键合硅胶色谱柱；
流动相：体积比为25-29:71-75的磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为48-52mmol/L，pH值为2.5-2.7；
流速：0.7-1.0mL/min；
柱温：25-35℃；
检测波长：205nm。
相对于现有技术，本发明采取氨基键合硅胶色谱柱，以磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合溶液为流动相，采取本发明提供的检测条件，实现了不需要衍生操作和复杂的样品前处理，测定简便。
相对于现有技术，本发明提供的缬氨酸的高效液相色谱检测方法，具有准确度高，稳定性好的特点。在本发明提供的检测条件下，缬氨酸与各杂质以及各杂质之间的分离均较好，出峰时间较为合适，预处理步骤简单，缬氨酸不需要衍生，检测时间短，而且本发明提供的方法具有较高的灵敏度，因此本发明提供的方法能够较好地实现对缬氨酸品质的测定，而且有利于满足生产过程中对质量控制的需要。
具体的，优选的，在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析，测定含有缬氨酸的溶液中缬氨酸的含量：
色谱柱：氨基键合硅胶色谱柱；
流动相：体积比为26-28:72-74的磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为49-51mmol/L，pH值为2.6-2.7；
流速：0.7-0.8mL/min；
柱温：28-32℃；
检测波长：205nm。
优选的，在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析，测定含有缬氨酸的溶液中缬氨酸的含量：色谱柱：氨基键合硅胶色谱柱；
流动相：体积比为27:73的磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为50mmol/L，pH值为2.62；
流速：0.7mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：205nm。
优选的，所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二铵溶液。
优选的，进样体积为20μL。
优选的，所述的缬氨酸的高效液相检测方法，至少包括以下步骤：
步骤a、配制缬氨酸标准溶液；
步骤b、采用高效液相色谱分别对标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，并采用外标法绘制缬氨酸含量-峰面积的标准曲线回归方程；
步骤c、将含有缬氨酸的溶液稀释，利用液相色谱仪进行液相色谱分析，采用与标准溶液完全相同的色谱条件，并同时记录峰面积，根据步骤b的标准曲线回归方程计算得出所述含有缬氨酸的溶液中缬氨酸的含量。
优选的，步骤a中，将缬氨酸对照品溶于流动相中，得到缬氨酸标准储备液，再将所述缬氨酸标准储备液稀释成若干不同质量浓度的缬氨酸标准溶液。
优选的，所述缬氨酸标准溶液的浓度分别为120μg/L、160μg/L、200μg/L、240μg/L和280μg/L。
优选的，所述缬氨酸标准储备液的浓度为2.00mg/mL。
优选的，步骤c中，将含有缬氨酸的溶液采用160-170倍体积的流动相稀释。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的缬氨酸标准溶液的液相色谱图；
图2是本发明实施例提供的含有缬氨酸的溶液的液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供一种缬氨酸的高效液相检测方法，在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析，测定含有缬氨酸的溶液中缬氨酸的含量：
色谱柱：岛津氨基键合硅胶色谱柱，5μm 4.6*250mm；
流动相：体积比为27:73的磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为50mmol/L，pH值为2.62；
流速：0.7mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：205nm；
进样体积为20μL；
包括以下步骤：
步骤a、配制流动相，调节pH，过滤，脱气；
步骤b、调节高效液相色谱仪，平衡色谱柱；
步骤c、取缬氨酸对照品100.0mg于50mL容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，样品分别吸取0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL和1.4mL至10mL容量瓶用流动相溶解并稀释至刻度，得到浓度分别为120μg/L、160μg/L、200μg/L、240μg/L和280μg/L的缬氨酸标准溶液；
步骤d、调节高效液相色谱仪，平衡色谱柱，采用液相色谱仪对上述缬氨酸标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，色谱图如图1所示，图中保留时间为21.9min处为缬氨酸的峰，其余为杂质峰，峰面积如下表1所示，并采用外标法绘制缬氨酸含量-峰面积的标准曲线，得出标准曲线回归方程，y＝677724x-705.2，R2＝0.9998；
表1标准溶液浓度μg/mL与峰面积数值记录表
标准浓度μg/mL 峰面积
120 80927.54
160 106917.2
200 135053.9
240 163589.7
280 189032.5
步骤e、将含有缬氨酸的生物转化液0.5mL，用流动相稀释至50mL，利用液相色谱仪进行液相色谱分析，采用与标准溶液完全相同的测定条件，并记录峰面积，根据步骤d的标准曲线回归方程y＝677724x-705.2，R2＝0.9998，计算得出所述缬氨酸的含量为47.4g/L(外标法测得含量为47.52g/L)。
从图2中可以看出，保留时间21.455min为缬氨酸的峰，其余的为杂峰，主峰的出峰时间适宜、理论塔板数大于5000，且与杂峰分离度良好。
实施例2
为验证上述实施例1的可行性和准确性，进行精密度试验，试验采用浓度为200μg/L配制的缬氨酸标准溶液，连续进样6次，采用与实施例1完全相同的色谱条件，测定结果表2所示。
表2精密度试验结果
序号 缬氨酸峰面积
1 134917.2
2 135202.5
3 135200.2
4 135359.4
5 135151.5
6 135158.5
平均值 135164.9
RSD％ 0.11
从表2中可以看出，出峰面积的RSD小于2％，因此仪器稳定性良好。
实施例3
为验证上述实施例1中缬氨酸的生物转化液的稳定性，进行稳定性试验，将含有缬氨酸的生物转化液0.3mL，用流动相稀释至50mL稀释后，分别放置4h、8h、12h、24h后再进样，采用与实施例1完全相同的色谱条件，测定结果表3所示。
表3稳定性检测结果
放置时间/h 缬氨酸峰面积
4 134917.2
8 135205.3
12 135312.3
24 134989.5
平均值 135106.1
RSD％ 0.14
从表3中可以看出，待检测的含有缬氨酸的溶液稳定，稀释后可以放置24h再进行检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种缬氨酸的高效液相检测方法，其特征在于：在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析，测定含有缬氨酸的溶液中缬氨酸的含量：
色谱柱：氨基键合硅胶色谱柱；
流动相：体积比为25-29:71-75的磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为48-52mmol/L，pH值为2.5-2.7；
流速：0.7-1.0mL/min；
柱温：25-35℃；
检测波长：205nm。
2.如权利要求1所述的缬氨酸的高效液相检测方法，其特征在于：在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析，测定含有缬氨酸的溶液中缬氨酸的含量：
色谱柱：氨基键合硅胶色谱柱；
流动相：体积比为26-28:72-74的磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为49-51mmol/L，pH值为2.6-2.7；
流速：0.7-0.8mL/min；
柱温：28-32℃；
检测波长：205nm。
3.如权利要求2所述的缬氨酸的高效液相检测方法，其特征在于：在以下色谱条件下进行高效液相色谱分析，测定含有缬氨酸的溶液中缬氨酸的含量：
色谱柱：氨基键合硅胶色谱柱；
流动相：体积比为27:73的磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合溶液，其中磷酸盐缓冲溶液的浓度为50mmol/L，pH值为2.62；
流速：0.7mL/min；
柱温：30℃；
检测波长：205nm。
4.如权利要求1-3任一项所述的缬氨酸的高效液相检测方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲溶液为磷酸氢二铵溶液。
5.如权利要求1-3任一项所述的缬氨酸的高效液相检测方法，其特征在于：进样体积为20μL。
6.如权利要求1-3任一项所述的缬氨酸的高效液相检测方法，其特征在于：所述检测方法至少包括以下步骤：
步骤a、配制缬氨酸标准溶液；
步骤b、采用高效液相色谱分别对标准溶液进行液相色谱分析，记录分析得到的峰面积，并采用外标法绘制缬氨酸含量-峰面积的标准曲线回归方程；
步骤c、将含有缬氨酸的溶液稀释，利用液相色谱仪进行液相色谱分析，采用与标准溶液完全相同的色谱条件，并同时记录峰面积，根据步骤b的标准曲线回归方程计算得出所述含有缬氨酸的溶液中缬氨酸的含量。
7.如权利要求6所述的缬氨酸的高效液相检测方法，其特征在于：步骤a中，将缬氨酸对照品溶于流动相中，得到缬氨酸标准储备液，再将所述缬氨酸标准储备液稀释成若干不同质量浓度的缬氨酸标准溶液。
8.如权利要求7所述的缬氨酸的高效液相检测方法，其特征在于：所述缬氨酸标准溶液的浓度分别为120μg/L、160μg/L、200μg/L、240μg/L和280μg/L。
9.如权利要求7所述的缬氨酸的高效液相检测方法，其特征在于：所述缬氨酸标准储备液的浓度为2.00mg/mL。
10.如权利要求6所述的缬氨酸的高效液相检测方法，其特征在于：步骤c中，将含有缬氨酸的溶液采用160-170倍体积的流动相稀释。
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