CN106338561A - 一种丙谷二肽中间体的定量检测方法 - Google Patents

一种丙谷二肽中间体的定量检测方法 Download PDF

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米造吉
刘利聪
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Abstract

本发明涉及丙谷二肽生产技术领域，公开了一种丙谷二肽中间体的定量检测方法，所述丙谷二肽中间体为苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺，包括以下步骤：称取苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的对照品和供试品，分别溶解于流动相中，制得对照品溶液和待测样品溶液，分别注入高效液相色谱仪进行检测分析，检测波长为215nm，所用色谱柱为氨基键合硅胶柱，所用流动相为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合液，体积比为35:75，所述磷酸盐缓冲溶液的pH=4，最后根据测得的色谱图，采用外标法计算出供试品中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的含量。本发明方法能够快速、准确的测定苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺含量，操作简单，检测时间短。

Description

一种丙谷二肽中间体的定量检测方法
技术领域
本发明涉及丙谷二肽生产技术领域，尤其是涉及丙谷二肽中间体的定量测定技术领域。
背景技术
丙氨酰谷氨酰胺（丙谷二肽）作为谷氨酰胺的替代药物，对严重分解代谢疾病（如烧伤、大手术，急慢性感染、骨髓移植）、肠道功能不全、免疫缺乏综合症等疾病具有良好的治疗效果。苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺是生产丙谷二肽的中间原料药，其结构式如下式所示。
其合成路线为：一定比列的1,4-二氧六环、苄氧羰基丙氨酸、N-羟基丁二酰亚胺25℃以下反应，滴加二环己基碳二亚胺后继续反应4个小时，再向反应液中加入氢氧化钠和L-谷氨酰胺进行缩合反应，析晶，抽滤，即得苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的湿粉。
苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺在用于生产丙谷二肽前需对其进行质量检测，现有技术采用C18色谱柱，0.01%磷酸和乙腈混合液作为流动相，但该方法检测时间长，一个样品需65min，且需梯度洗脱，对高校液相色谱仪、配制流动相的试剂要求较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种丙谷二肽中间体的定量检测方法，能够快速、准确的测定苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺含量，操作简单，检测时间短，适用于规模化生产中对于苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺含量的检测，也适用于实验室对于工艺改进等试验的检测分析。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种丙谷二肽中间体的定量检测方法，所述丙谷二肽中间体为苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺，包括以下步骤：
1）称取苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的对照品和供试品，分别溶解于流动相中，得对照品溶液和待测样品溶液；
2）分别将所述对照品溶液和待测样品溶液用高效液相色谱仪进行检测分析，检测波长为215nm，所用色谱柱为氨基键合硅胶柱，所用流动相为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合液，体积比为35:75，所述磷酸盐缓冲溶液的pH=4；
3）根据测得的色谱图，采用外标法计算出供试品中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的含量。
所述色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，其填料粒径为5μm。
步骤2）中色谱柱温为30℃，流动相流速：0.7ml/min。
所述外标法采用单点校正法，供试品中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的含量X（%）采用下式计算得到，
，
其中，A样为待测样品溶液色谱图中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的色谱峰的峰面积；
A对为对照品溶液色谱图中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的色谱峰的峰面积；
C对为对照品溶液中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的浓度,按下式计算得到，
，
m对为称取对照品的质量，V对为对照品溶液的体积；
C样为按照供试品质量计算得到待测样品溶液中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的浓度，
，
m样为称取对照品的质量，V样为对照品溶液的体积。
作为优选，C对=0.2mg/ml。亦即待测样品溶液在配制时，应尽量让C样在C对附近，也就是使C对趋近于0.2mg/ml，优选C样=0.2mg/ml。此浓度下，可使反应过程中有关的检出限较低的杂质峰检出。
进一步地，所述对照品溶液和待测样品溶液在高效液相色谱仪中进样采用定量环进样，进样体积为20μl。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
本发明采用高效液相色谱法能够准确测定出丙谷二肽中间体中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的含量，能够实现与其它杂质峰达到良好的分离效果。
本发明高效液相色谱法能够快速分离出丙谷二肽中间体中的苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺，出峰时间短，在5-10min，相比现有技术，工作效率显著提高，适用于规模化生产中对于苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺含量的检测，也适用于实验室对于工艺改进等试验的检测分析，能够确保丙谷二肽中间体质量可控，减小误差，节约成本，提高生产效率。
附图说明
图1是本发明实施例苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺对照品的色谱图；
图2是本发明实施例苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺供试品的色谱图。
具体实施方式
本发明公开了一种利用高效液相色谱法测定丙氨酰谷氨酰胺生产所用中间体苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺含量的方法，能够快速、准确的测定苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺含量，操作简单，检测时间短，效率高。
下面举例本发明方法作进一步说明。
以下实施例中，采用高效液相色谱仪为日本岛津LC-15C送液单元,SPD-15C紫外可见双波长检测器，色谱柱为美国GRACE氨基键合硅胶柱，其规格为250mm*4.6mm*5μm，进样体积为20μl（定量环）。需要说明的是，本领域技术人员根据本发明方法也可采用其他厂家和型号的高效液相色谱仪、氨基键合硅胶柱以及其他进样体积等，以达到本发明的目的。
供试品苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的定量测定方法，采用高效液相色谱法：
1.按流动相的配比组分：0.05mol/L磷酸二氢钾（pH=4.0）:乙腈=35:75，配制流动相，调节pH值，过滤、脱气；
2.调节高效液相色谱仪条件，开机平衡色谱柱，流动相流速为0.7ml/min，色谱柱温为30℃；
3. 供试品和对照品苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺溶液的配制，各称取供试品和对照品10.0mg于50ml容量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
4. 将对照品溶液、待测样品溶液过滤后注入高效液相色谱仪，检测波长为215nm，记录色谱图及相应的苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺峰面积，采用外标法计算供试品中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的含量。
实施例1-3
采用如上方法，分别对三个供试品及对照品进行高效液相色谱分析，其中一个对照品溶液的色谱图见图1，6.700min为苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的色谱峰，其余为杂峰；供试品溶液的色谱图见图2，6.707min为苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的色谱峰主峰，出峰时间适宜，理论塔板数大于5000且与杂质峰分离度良好。
实施例1-3测得的数据以及供试品中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的计算含量X（%）见下表。
实施例 样品（mg） C对（mg/ml） A对 A样 C样（mg/ml） X（%）
1 10.38 0.2001 5352295 4360012 0.2076 78.52
2 10.59 0.2001 5352295 4617977 0.2118 81.51
3 10.51 0.2001 5435433 4433464 0.2102 77.65
上表中，
，
A样为待测样品溶液色谱图中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的色谱峰的峰面积；
A对为对照品溶液色谱图中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的色谱峰的峰面积；
C对为对照品溶液中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的浓度,按下式计算得到，
，
m对为称取对照品的质量，V对为对照品溶液的体积，为50ml；
C样为按照供试品质量计算得到待测样品溶液中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的浓度，
，
m样为称取对照品的质量，见上表中样品列，V样为对照品溶液的体积，为50ml。

Claims (6)

1.一种丙谷二肽中间体的定量检测方法，所述丙谷二肽中间体为苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺，其特征在于：包括以下步骤：
1）称取苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的对照品和供试品，分别溶解于流动相中，得对照品溶液和待测样品溶液；
2）分别将所述对照品溶液和待测样品溶液用高效液相色谱仪进行检测分析，检测波长为215nm，所用色谱柱为氨基键合硅胶柱，所用流动相为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液与乙腈的混合液，体积比为35:75，所述磷酸盐缓冲溶液的pH=4；
3）根据测得的色谱图，采用外标法计算出供试品中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的含量。
2.根据权利要求１所述的定量检测方法，其特征在于所述色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，其填料粒径为5μm。
3.根据权利要求2所述的定量检测方法，其特征在于步骤2）中色谱柱温为30℃，流动相流速：0.7ml/min。
4.根据权利要求１所述的定量检测方法，其特征在于所述外标法采用单点校正法，供试品中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的含量X（%）采用下式计算得到，
其中，A样为待测样品溶液色谱图中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的色谱峰的峰面积；
A对为对照品溶液色谱图中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的色谱峰的峰面积；
C对为对照品溶液中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的浓度,按下式计算得到，
，
m对为称取对照品的质量，V对为对照品溶液的体积；
C样为按照供试品质量计算得到待测样品溶液中苄氧羰基丙氨酰谷氨酰胺的浓度，
，
m样为称取对照品的质量，V样为对照品溶液的体积。
5.根据权利要求4所述的定量检测方法，其特征在于，C对=0.2mg/ml。
6.根据权利要求1所述的定量检测方法，其特征在于，所述对照品溶液和待测样品溶液在高效液相色谱仪中进样采用定量环进样，进样体积为20μl。
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