CN109507336B - 一种检测丙谷二肽中有机溶剂残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种检测丙谷二肽原料药中有机溶剂残留的方法，该方法以叔丁醇为内标物，采用静态顶空气相色谱内标法测定丙谷二肽产品中待测有机溶剂的残留量，其中气相色谱柱采用羟基硅油溶胶凝胶色谱柱。本发明以叔丁醇作为内标，叔丁醇能与待测有机溶剂完全溶解，不与待测有机溶剂发生化学作用，不干扰待测组分的分离和待测组份的峰位；且以叔丁醇作为内标物，保留时间合理，有效提高了丙谷二肽有机溶剂残留分析结果的准确度与精密度；采用的羟基硅油溶胶凝胶色谱柱对待测有机溶剂和叔丁醇的色谱分离保留时间短，分离效率高，各峰保留时间与峰面积重现性好，为准确、快速分析结果提供了进一步保障。

Description

一种检测丙谷二肽中有机溶剂残留的方法

技术领域

本发明涉及药物分析检测技术领域，具体涉及一种检测丙谷二肽中有机溶剂残留的方法。

背景技术

药品中残留的有机溶剂是影响药品质量的重要指标。为保证用药安全，各国对新药研究过程中的质量控制均有严格的规定，对药物原料或制剂中有机溶剂残留量必须进行检测。常用的检测方法为气相色谱法，其根据进样方式不同可以采用溶液直接进样和顶空进样。溶液直接进样法简单方便，但是存在溶剂干扰、色谱柱污染和检出限过高等缺点。近年来，固相微萃取技术也被应用于测定药品中的残留溶剂，但测试成本较高，在重现性等方面还需要进一步完善。所以顶空进样气相色谱法成为检测有机溶剂残留的重要途径。

丙谷二肽(L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)是一种静脉营养注射剂，在临床上用作谷氨酰胺的替代药物。由于在制备丙谷二肽原料药时，在重结晶提纯过程中，需要溶解剂以及溶析剂，生产过程中会有有机溶剂残留。《中华人民共和国药典2015版》对丙谷二肽原料药中的甲醇、乙醇、四氢呋喃与甲苯溶剂残留值作出了限定并给出了检测有机溶剂残留的方法。根据药典所述的检测方法，其采用的是顶空进样单点外标法定量气相色谱分析法，该分析方法采用自动顶空进样时测定方法简便，分析结果可靠。然而，采用单点外标法定量分析，对样品前处理条件的一致性及样品进样量的准确度要求非常严格，采用全自动顶空进样时，全自动顶空进样器价格昂贵，也不利于产品中控的快速与稳健分析；采用手动顶空进样或半自动顶空进样时，分析结果的精密度与准确度会受到较大影响，从而影响了数据的可靠性，尤其是溶剂残留处于临界值时，分析结果的可靠性对产品质量的控制意义重大。

发明内容

本发明目的在于提供一种检测丙谷二肽中有机溶剂残留的方法，能准确、快速的检测出丙谷二肽样品中待测有机溶剂的残留量。

为达到上述技术目的，本发明的技术方案提供一种检测丙谷二肽中有机溶剂残留的方法，以叔丁醇为内标物，采用静态顶空气相色谱内标法测定丙谷二肽产品中待测有机溶剂的残留量，其中气相色谱柱采用羟基硅油溶胶凝胶色谱柱。

与现有技术相比，本发明的有益效果包括：本技术方案以叔丁醇作为内标，叔丁醇能与待测有机溶剂完全溶解，不与待测有机溶剂发生化学作用，不干扰待测组分的分离和待测组分的峰位；且以叔丁醇作为内标物，保留时间合理，有效提高了丙谷二肽有机溶剂残留分析结果的准确度与精密度；采用5米的羟基硅油溶胶凝胶色谱柱对待测有机溶剂和叔丁醇的色谱分离保留时间短，分离效率高，各峰保留时间与峰面积重现性好，为准确、快速分析结果提供了进一步保障。选用该柱型采用内标法测定丙谷二肽溶剂残留未见文献报道，该分析方法可应用于丙谷二肽原料药中溶剂残留的快速、稳健分析。

附图说明

图1为甲醇、乙醇、叔丁醇、四氢呋喃、甲苯的分离色谱图；

图2为甲醇和叔丁醇的线性回归曲线；

图3为乙醇和叔丁醇的线性回归曲线；

图4为四氢呋喃和叔丁醇的线性回归曲线；

图5为甲苯和叔丁醇的线性回归曲线。

具体实施方式

1.仪器与试剂

(1)仪器:Agilent 7820A；FID检测器；；DJ-200T顶空进样器；HS-16A自动顶空进样器；

(2)试剂：除了乙醇为色谱纯外，其他的试剂均为分析纯。

2.色谱条件

色谱柱：羟基硅油溶胶凝胶柱(5m×0.25mm×0.30um)；柱温：初始50℃，维持0.4min；按40℃/min程序升温至70℃，保持15min；进样口温度：200℃；检测温度：250℃；进样方式：顶空进样。

其中羟基硅油溶胶凝胶柱的制备方法如下：

将200mg端羟基聚二甲基硅氧烷、10mg含氢硅油、200μL甲基三甲氧基硅烷、200μL二氯甲烷及100μL三氟乙酸依次加入到2mL的PV管中，振荡混合均匀。将其放入离心器中以10000r/min的速率离心1min，将上清液用0.43MP的氮气压入至毛细管内，让溶液在管内停留20min，然后用同样压力的氮气将溶液压出管。继续通氮气60min使涂层干燥并与石英毛细管内表面键合。将该柱放入气相色谱仪内，一端放空，另一端与进样器连接，在通入氮气的条件下，以1℃/min速率缓慢升温加热至270℃，并在该温度下维持300min。采用动态法制柱，柱效以十二烷120℃测定可达2100塔板/米，制得的羟基硅油溶胶凝胶柱可以应用于公司研发部门丙谷二肽产品溶剂残留的快速、稳健中控分析。

3.溶液配制

(1)内标液的配制：精密称取叔丁醇2.50g，置于已有少量N、N-二甲基甲酰胺的100ml容量瓶中，加N、N-二甲基甲酰胺定容至100ml，得内标液的储备液；

精密量取内标液的储备液1.0ml，置于50ml容量瓶中，加N、N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀，制成浓度为每1ml中含叔丁醇0.0005g的溶液，作为内标液，内标液中叔丁醇的浓度为500ppm。

(2)待测有机溶剂的标准溶液配制：精密称取甲醇1.50g、乙醇2.50g、四氢呋喃0.36g、甲苯0.45g，分别加N,N-二甲基甲酰胺溶解于100ml容量瓶中，得标准溶液储备液；

分别精密量取甲醇、乙醇、四氢呋喃、甲苯储备液1.0ml，分别置于50ml容量瓶中，加N、N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀，制成浓度为每1ml中含甲醇0.0003g、乙醇0.0005g、四氢呋喃0.000072g、甲苯0.00009g的溶液，即分别制得甲醇、乙醇、四氢呋喃和甲苯的标准溶液，且甲醇标准溶液中甲醇的浓度为300ppm，乙醇标准溶液中乙醇的浓度为500ppm，四氢呋喃标准溶液中四氢呋喃的浓度为72ppm，甲苯标准溶液中甲苯的浓度为90ppm。

(3)标准混合溶液的配制：分别精密量取内标液，甲醇、乙醇、四氢呋喃和甲苯的标准溶液各1ml，混合均匀，制得标准混合溶液。

配制各种溶液均选用浓度为30～100％的N、N-二甲基甲酰胺作为溶剂，优选为浓度为100％的N、N-二甲基甲酰胺作为溶剂，由于水对标准溶液中溶质的力学作用远远大于N、N-二甲基甲酰胺对溶质的影响，所以为了减小误差，优选纯N、N-二甲基甲酰胺作为溶剂。

4.样品测试

(1)色谱峰定性试验：

精密量取2ml标准混合溶液，置于20ml顶空瓶中，采用静态顶空气相色谱法测定标准混合溶液。

标准混合溶液的色谱图见图1，其中：1代表甲醇，2代表乙醇，3代表叔丁醇，4代表四氢呋喃，5代表甲苯。由图1可以看出：叔丁醇与甲醇、乙醇、四氢呋喃、甲苯能实现较好的分离；由标准混合溶液的色谱图可以确定这5种物质的保留时间，对色谱峰进行定性，另外这5种物质的保留时间比较短，测完这5种物质时间不到2min。叔丁醇在甲醇、乙醇、四氢呋喃和甲苯之间出峰，其保留时间介于乙醇与四氢呋喃之间，不干扰待测组分的分离。相邻两峰基线分离，峰形对称性好。

(2)线性试验：

精密量取甲醇、乙醇、四氢呋喃和甲苯的标准溶液，分别取60ul、80ul、100ul、120ul和140ul上述4种标准溶液置于4只20ml的顶空瓶中，再分别向4只顶空瓶中加50ul内标液，加纯N、N-二甲基甲酰胺稀释至2ml，摇匀，作为一系列线性试验溶液。顶空进样，分别以甲醇与叔丁醇浓度比、乙醇与叔丁醇浓度比、四氢呋喃与叔丁醇浓度比、甲苯与叔丁醇浓度比为横坐标，甲醇与叔丁醇峰面积比、乙醇与叔丁醇峰面积比、四氢呋喃与叔丁醇峰面积比、甲苯与叔丁醇峰面积比为纵坐标建立线性回归方程；用峰面积比及溶液浓度作标准曲线，对进样量的要求降到最低，减少了系统误差：采用一系列浓度梯度建立标准曲线的回归方程，测量的是峰面积比，使测量结果更准确。测定结果见表1以及图2～5。

表1各物质的线性回归方程

虽然本发明的图2～5中，x₁为0.72～1.68，x₂为1.2～2.8，x₃为0.1728～0.4032以及x₄为0.216～0.504，但本发明的检测方法对其他浓度比的情况也适用，只要峰面积比和浓度比满足上述线性回归方程即可。

(3)样品有机溶剂残留定量分析：

精密称量0.1g丙谷二肽样品，放置在20ml的顶空瓶中，向顶空瓶中加入1.0ml的N,N-二甲基甲酰胺，再加入1.0ml内标液(由于样品溶解后体积变化比较小，体积的变化忽略不计)，混合均匀后，顶空进样，记录色谱图。由色谱图上的保留时间，可以确定色谱峰对应的物质，然后按照内标法以峰面积比和线性回归方程计算出样品中残留的甲醇、乙醇、四氢呋喃以及甲苯与叔丁醇的浓度比，由于叔丁醇的浓度是已知的，由此可以计算出残留的甲醇、乙醇、四氢呋喃以及甲苯的浓度，进而计算出样品中甲醇、乙醇、四氢呋喃以及甲苯的残留量。

(4)加标回收试验：

向已知甲醇、乙醇、四氢呋喃或甲苯含量的丙谷二肽样品中加入稀释到不同倍数的甲醇、乙醇、四氢呋喃或甲苯的标准品溶液(用N,N-二甲基甲酰胺稀释)，摇匀后，混合液备用；精密量取一定量的混合液，顶空进样，记录色谱图。将色谱图上得出的峰面积比，代入相应的标准曲线，可以计算出相应的物质的量，由下式计算回收率，从而验证方案的可行性：

加标回收率％＝(加标试样测定值－试样测定值)/加标量×100％

待测有机溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃和甲苯中的至少一种，本例的丙谷二肽样品中残留的有机溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃和甲苯，所以本例的待测有机溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃和甲苯，若丙谷二肽样品中残留的有机溶剂为这几个物质中的一种或多种或其他有机溶剂，则选择这几个物质中的一种或多种或其他有机溶剂作为待测有机溶剂，具体的操作方法均同上，此处不再一一详细说明。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1：

(1)配制内标液：精密称取叔丁醇2.50g，置于已有少量N、N-二甲基甲酰胺的100ml容量瓶中加N、N-二甲基甲酰胺定容至100ml，得内标液的储备液；精密量取内标液的储备液1.0ml，置于50ml容量瓶中，加N、N-二甲基甲酰胺至刻度，摇匀，制成浓度为每1ml中含叔丁醇0.0005g的溶液，作为内标液；

(2)样品中有机溶剂残留定量分析：精密称量某批号0.1g丙谷二肽产品5份平行样，分别放置在5个20ml的顶空瓶中，向每个顶空瓶中分别加入1.0ml的N,N-二甲基甲酰胺，再在每个顶空瓶中分别加入1.0ml内标液，混合均匀后，采用手动顶空进样的方式进样；检测条件：色谱柱：羟基硅油溶胶凝胶柱(5m×0.25mm×0.30um)；柱温：初始50℃，维持0.4min；按40℃/min程序升温至70℃，保持15min；进样口温度：200℃；检测温度：250℃。顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为20分钟，记录5份平行样的色谱图；

(3)先根据5份色谱图上的保留时间对色谱峰进行定性，得到的色谱图中仅有乙醇出峰，甲醇、四氢呋喃、甲苯均未出峰，再确定乙醇和叔丁醇的峰面积之比，根据以下线性回归方程：y₂＝0.67435x₂-0.01308(相关系数为0.9981)，可以得到乙醇和叔丁醇的浓度比，每ml内标液中含叔丁醇的含量为0.0005g，由此可以计算出乙醇的浓度及含量。

取5份丙谷二肽中残留乙醇含量的平均值，得到丙谷二肽中残留的乙醇含量为59ppm，精密度(RSD)为6.1％(n＝5)。

实施例2：

(1)内标液的配制方法与实施例1相同；

(2)样品中有机溶剂残留定量分析：精密称量某批号0.1g丙谷二肽产品5份平行样，分别放置在5个20ml的顶空瓶中，向每个顶空瓶中分别加入1.0ml的N,N-二甲基甲酰胺，再在每个顶空瓶中分别加入1.0ml内标液，混合均匀后，采用HS-16A自动顶空进样器进样；检测条件：色谱柱：羟基硅油溶胶凝胶柱(5m×0.25mm×0.30um)；柱温：初始50℃，维持0.4min；按40℃/min程序升温至70℃，保持15min；进样口温度：200℃；检测温度：250℃。顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为20分钟，记录5份平行样的色谱图；

(3)先根据5份色谱图上的保留时间对色谱峰进行定性，得到的色谱图中仅有乙醇出峰，甲醇、四氢呋喃、甲苯均未出峰，再确定乙醇和叔丁醇的峰面积之比，根据以下线性回归方程：y₂＝0.67435x₂-0.01308(相关系数为0.9981)，可以得到乙醇和叔丁醇的浓度比，每ml内标液中含叔丁醇的含量为0.0005g，由此可以计算出乙醇的浓度及含量。

取5份丙谷二肽中残留乙醇含量的平均值，得到丙谷二肽中残留的乙醇含量为64ppm，精密度(RSD)为5.2％(n＝5)。

实施例3：

(1)内标液的配制方法以及检测条件均与实施例1相同；

(2)在已知甲醇、乙醇、四氢呋喃或甲苯的丙谷二肽样品中分别加入高中低3个不同浓度的甲醇、乙醇、四氢呋喃或甲苯的标准品溶液(各物质的标准品溶液分别采用N,N-二甲基甲酰胺5、10和20倍稀释，得到高中低不同浓度的各标准品溶液)，采用与实施例1中相同的检测方法分别测定相应的甲醇、乙醇、四氢呋喃或甲苯的含量，根据测定结果以及甲醇、乙醇、四氢呋喃或甲苯的添加量，根据下式计算测定方法的加标回收率：加标回收率％＝(加标试样测定值－试样测定值)/加标量×100％

本例中丙谷二肽中甲醇、乙醇、四氢呋喃、甲苯加标回收率分别为89％，92％，107％，104％。

比较例1：

精密称量实施例1中的同批号0.1g丙谷二肽产品5份平行样，分别放置在5个20ml的顶空瓶中，向顶空瓶中分别加入1.0ml的N,N-二甲基甲酰胺，不加内标液，混合均匀后，自动进样器顶空进样，记录色谱图。色谱柱：商品柱DB-624(30m×0.53mm×3.0um)；程序升温，起始温度70℃，维持2分钟，以每分钟10℃的速率升温至120℃，再以每分钟20℃的速率升温至220℃，维持3分钟；进样口温度为200℃；检测器温度为250℃；顶空瓶平衡温度为80℃，平衡时间为20分钟。进样方式：手动顶空进样。由色谱图保留时间对色谱峰进行定性，然后按照单点外标法以标样峰面积和标样浓度之比，根据样品色谱图中的甲醇、乙醇、四氢呋喃峰以及甲苯的峰面积计算甲醇、乙醇、四氢呋喃以及甲苯浓度。由色谱图可知，该批次丙谷二肽色谱图中乙醇出峰，甲醇、甲氢呋喃、甲苯未出峰。

取5份丙谷二肽中残留乙醇含量的平均值，得到丙谷二肽中残留的乙醇含量为62ppm，精密度(RSD)11.8％为(n＝5)。

商品柱DB-624是溶剂残留测定的常用柱型。采用本发明方法中的柱型5米短柱可以实现甲醇、乙醇、四氢呋喃、甲苯与内标物叔丁醇的基线分离且峰形对称，保留时间更短。由实施例1～3与比较例1可知，与药典方法相比，本发明提供的检测方法分析速度更快，回收率符合要求，手动进样测定结果精密度更好，可以应用于企业研发部门丙谷二肽溶剂残留分析。

以上所述本发明的具体实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何根据本发明的技术构思所做出的各种其他相应的改变与变形，均应包含在本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种检测丙谷二肽原料药中有机溶剂残留的方法，其特征在于，以叔丁醇为内标物，采用静态顶空气相色谱内标法测定丙谷二肽产品中待测有机溶剂的残留量，其中气相色谱柱采用羟基硅油溶胶凝胶柱，所述待测有机溶剂为甲醇、乙醇、四氢呋喃和甲苯，其中羟基硅油溶胶凝胶柱的制备方法如下：

将200mg端羟基聚二甲基硅氧烷、10mg含氢硅油、200μL甲基三甲氧基硅烷、200μL二氯甲烷及100μL三氟乙酸依次加入到2mL的PV管中，振荡混合均匀；将其放入离心器中以10000r/min的速率离心1min，将上清液用0.43MP的氮气压入至毛细管内，让溶液在管内停留20min，然后用同样压力的氮气将溶液压出管；继续通氮气60min 使涂层干燥并与石英毛细管内表面键合；将该柱放入气相色谱仪内，一端放空，另一端与进样器连接，在通入氮气的条件下，以1℃/min速率缓慢升温加热至270℃，并在该温度下维持300min，采用动态法制柱，柱效以十二烷120℃测定可达2100塔板/米；

气相色谱检测条件为：

色谱柱：羟基硅油溶胶凝胶柱；

柱温：初始50℃，维持0.4min；按40℃/min程序升温至70℃，保持15min；

进样口温度：200℃；

检测温度：250℃；

进样方式：顶空进样。

2.根据权利要求1所述的检测丙谷二肽原料药中有机溶剂残留的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.配制溶液：以N,N-二甲基甲酰胺为溶剂，分别配制含有内标物的内标液、待测有机溶剂的标准溶液，以及含有内标液和待测有机溶剂的标准混合溶液；

S2.色谱峰定性：取标准混合溶液进样，记录色谱图，得到内标物和待测有机溶剂的保留时间；

S3.标准曲线绘制：分别取不同体积的待测有机溶剂的标准溶液，向各标准溶液中分别加入内标液，并用N、N-二甲基甲酰胺稀释，配制成一系列浓度梯度的溶液，用气相色谱法测定待测有机溶剂和内标物的峰面积，以待测有机溶剂浓度为横坐标，待测有机溶剂与内标物的峰面积比为纵坐标，建立线性回归曲线；

S4.测样品中的含量：精密称量丙谷二肽样品，并向其中加入内标液和N,N-二甲基甲酰胺，混合均匀后进样，记录色谱图，根据步骤S2中确定的保留时间，确定待测有机溶剂和内标物的色谱峰，并将待测有机溶剂与内标物的峰面积比代入步骤S3中的线性回归方程，计算丙谷二肽样品中待测有机溶剂的含量。

3.根据权利要求2所述的检测丙谷二肽原料药中有机溶剂残留的方法，其特征在于，所述N、N-二甲基甲酰胺的浓度为30~100%。

4.根据权利要求2所述的检测丙谷二肽原料药中有机溶剂残留的方法，其特征在于，所述N、N-二甲基甲酰胺的浓度为100%。

5.根据权利要求1所述的检测丙谷二肽原料药中有机溶剂残留的方法，其特征在于，羟基硅油溶胶凝胶柱的规格为5m×0.25mm×0.30μm。

6.根据权利要求1所述的检测丙谷二肽原料药中有机溶剂残留的方法，其特征在于，甲醇与叔丁醇之间的线性方程为y₁=0.67508x₁-0.07548。

7.根据权利要求1所述的检测丙谷二肽原料药中有机溶剂残留的方法，其特征在于，乙醇与叔丁醇之间的线性方程为y₂=0.67435x₂-0.01308。

8.根据权利要求1所述的检测丙谷二肽原料药中有机溶剂残留的方法，其特征在于，四氢呋喃与叔丁醇之间的线性方程为y₃=3.53594x₃-0.12055。

9.根据权利要求1所述的检测丙谷二肽原料药中有机溶剂残留的方法，其特征在于，甲苯与叔丁醇之间的线性方程为y₄=1.63062x₄-0.03328。

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