CN108614058A - 测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的顶空气相色谱法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的顶空气相色谱法，采用DB‑624毛细管柱，氢火焰离子化检测器，进样口温度为150℃，检测器为温度为250℃，载气为高纯氮气，载气流速为2.2mL/min，分流比为10∶1，顶空加热温度为80℃，平衡时间为35min；此外，由于甘氨酸易溶于水，并且这12种溶剂在水中具有一定溶解度，故本发明使用含水溶剂。该法可实现同时测定甘氨酸原料药中甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正丙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、环己烷、正丁醇和甲苯等12种有机溶剂残留量，具有操作简单、快速灵敏、结果准确的特点，为有效控制甘氨酸原料质量和保证用药安全提供参考。

Description

测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的顶空气相色谱法

技术领域

本发明属于甘氨酸原料药质量检测技术领域，尤其涉及一种测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的顶空气相色谱法。

背景技术

甘氨酸，又名氨基乙酸，是一种结构最简单的、具有特殊甜味的氨基酸，并作为重要的精细化工原料，在食品、医药、饲料等领域应用广泛。甘氨酸是生产氨基酸的基本原料，在医药行业中可用作氨基酸制剂、抗胃酸冲剂，以及其他赋形剂。甘氨酸的工业生产方法主要有三种：天然蛋白质水解法、氯乙酸氨解法和St recker法，目前国内普遍采用氯乙酸氨解法，国外则以Strecker法为主。在甘氨酸原料药的合成中，可能会用到甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丙醇、四氢呋喃、环己烷、正丁醇和甲苯等12种有机溶剂，但是目前国内尚没有关于测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的报道。根据人用药物注册技术要求国际协调会(ICH)和《中国药典》2015年版(四部)通则0861“残留溶剂测定法”的规定，上述12种溶剂均有残留量限度要求，因此有必要对甘氨酸原料药中上述12种有机溶剂的残留量进行控制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种操作简单、快速灵敏，结果准确的测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的顶空气相色谱法，为有效控制甘氨酸原料质量和保证用药安全提供参考。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的顶空气相色谱法，采用DB-624毛细管柱，氢火焰离子化检测器，进样口温度为150℃，检测器为温度为250℃，载气为高纯氮气，载气流速为2.2mL/min，分流比为5：1，顶空加热温度为80℃，平衡时间为35min。

DB-624毛细管柱的升温程序为45℃保持2min，然后以5℃/min升温至65℃保持5min，再以40℃/min升温至200℃保持3min。

溶液的制备采用含50％二甲亚砜的水溶剂。

溶液的制备按以下进行操作：

混合对照品溶液精密称取各对照品适量，用50％二甲亚砜溶液(V/V)定量稀释制成每1mL中含有甲醇3mg、乙醇5mg、丙酮5mg、异丙醇5mg、乙腈0.41mg、二氯甲烷0.6mg、正丙醇5mg、乙酸乙酯5mg、四氢呋喃0.72mg、环己烷3mg、正丁醇5mg、甲苯0.89mg的混合对照品贮备液；精密量取5mL混合对照品贮备液，置于100mL量瓶中，加50％二甲亚砜溶液定容，摇匀，即得混合对照品溶液，同时作为回收率的中质量对照品溶液；精密量取4mL混合对照品贮备液，置于100mL量瓶中，加50％二甲亚砜溶液定容，摇匀，即得回收率的低质量对照品溶液；精密量取6mL混合对照品贮备液，置于100mL量瓶中，加50％二甲亚砜溶液定容，摇匀，即得回收率的高质量对照品溶液。

空白溶液精密量取50％二甲亚砜溶液2mL，置于顶空瓶中，密封，即得；

供试品溶液取样品约0.1g，精密称定，置于顶空瓶中，精密加50％二甲亚砜溶液2mL，密封，振摇，使溶解，即得。

针对甘氨酸原料药缺少有机溶剂残留量检测项的问题，发明人结合甘氨酸生产工艺建立了测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的顶空气相色谱法，采用DB-624毛细管柱，氢火焰离子化检测器，进样口温度为150℃，检测器为温度为250℃，载气为高纯氮气，载气流速为2.2mL/min，分流比为10∶1，顶空加热温度为80℃，平衡时间为35min；此外，由于甘氨酸易溶于水，并且这12种溶剂在水中易容，故本发明使用含水溶剂。该法可实现同时测定甘氨酸原料药中甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正丙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃、环己烷、正丁醇和甲苯等12种有机溶剂残留量，具有操作简单、快速灵敏、结果准确的特点，为有效控制甘氨酸原料质量和保证用药安全提供参考。

附图说明

图1是本发明的气相色谱，图中：A.混合对照品溶液；B.空白溶液；C.供试品溶液；1.甲醇；2.乙醇；3.丙酮；4.异丙醇；5.乙腈；6.二氯甲烷；7.正丙醇；8.乙酸乙酯；9.四氢呋喃；10.环己烷；11.正丁醇；12.甲苯。

具体实施方式

一、仪器与材料

1.1仪器

岛津GC-2010型气相色谱仪，包括氢火焰离子化检测器和HSS 8650顶空进样器(日本岛津公司)，XS205型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)。

1.2材料

甘氨酸原料药(南宁某公司，批号：8978170204、8889750801、8971170209)，甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯(均购自德国Merck公司，含量均为99.9％，批号分别为10894707725、AS1131-001、SA2SF11417、151040、1645868228、160447、1567531)，正丙醇、二氯甲烷、环己烷、正丁醇(均购自国药集团化学试剂有限公司，含量均为99.5％，批号分别为20170506、20161110、20160718、20140213)，水为超纯水。

二、方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：DB-624毛细管柱(30m×0.53mm，3.0μm)；升温程序：45℃保持2min，然后以5℃/min升温至65℃保持5min，再以40℃/min升温至200℃保持3min；进样口温度：150℃；检测器：氢火焰离子化检测器；检测器温度：250℃；载气：氮气；氮气流速：2.2mL/min；分流比：5∶1；顶空进样量：1.0mL；顶空平衡温度：80℃；平衡时间：35min。

2.2溶液制备

2.2.1混合对照品溶液精密称取各对照品适量，用50％二甲亚砜溶液定量稀释制成每1mL中含有甲醇3mg、乙醇5mg、丙酮5mg、异丙醇5mg、乙腈0.41mg、二氯甲烷0.6mg、正丙醇5mg、乙酸乙酯5mg、四氢呋喃0.72mg、环己烷3mg、正丁醇5mg、甲苯0.89mg的混合对照品贮备液。精密量取5mL混合对照品贮备液，置于100mL量瓶中，加50％二甲亚砜溶液定容，摇匀，即得混合对照品溶液(同时作为回收率的中质量对照品溶液)。精密量取4mL混合对照品贮备液，置于100mL量瓶中，加50％二甲亚砜溶液定容，摇匀，即得回收率的低质量对照品溶液。精密量取6mL混合对照品贮备液，置于100mL量瓶中，加50％二甲亚砜溶液定容，摇匀，即得回收率的高质量对照品溶液。

2.2.2空白溶液精密量取50％二甲亚砜溶液2mL，置于顶空瓶中，密封，即得。

2.2.3供试品溶液取样品约0.1g，精密称定，置于顶空瓶中，精密加50％二甲亚砜溶液2mL，密封，振摇，使溶解，即得。

2.3系统适用性试验

取“2.2”项下混合对照品溶液、空白溶液和供试品溶液各2mL，各置顶空瓶中，按“2.1”项下色谱条件测试，记录色谱图。如图1所示，结果表明，在该色谱条件下，各成分峰均能达到基线分离，分离度>2.0；理论板数以乙腈峰计为51226，溶剂对样品测定无干扰，溶剂峰和主峰分离良好。

2.4线性和范围

精密吸取“2.2.1”项下混合对照品贮备液各0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL，置于不同10mL量瓶中，加50％二甲亚砜定容，摇匀，制成系列混合对照品溶液。取上述系列混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测有机溶剂质量浓度(x，μg/mL)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

表1回归方程与线性范围

2.5仪器精密度及重复性

取“2.2.1”项下混合对照品溶液2mL置顶空瓶中，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，记录峰面积。结果甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丙醇、四氢呋喃、环己烷、正丁醇和甲苯峰面积的RSD分别为2.1％、2.3％、1.5％、1.9％、2.2％、2.6％、1.8％、1.7％、2.0％、2.1％、2.0％、2.2％(n＝5)。取供试品约0.1g，精密称定，置顶空瓶中，精密加50％二甲亚砜溶液2mL使溶解，重复测定6次，结果除乙醇、丙酮、异丙醇外，其他残留溶剂均未检出。乙醇、丙酮、异丙醇测定值的RSD分别为1.2％、1.8％、1.4％(n＝6)。

2.6定量限(LOQ)与检测限(LOD)考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，逐级稀释，分别进样，以信噪比为10左右计算定量限，以信噪比为3左右计算检测限，结果见表2。

表2 LOQ与LOD测定结果

2.7稳定性试验

精密称取0.1g供试品，加入“2.2.1”项下的混合对照品溶液2mL使溶解，密封，摇匀，同法制备7份。分别于0、2、4、8、12、18、24h时进样测定，记录峰面积，结果甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丙醇、四氢呋喃、环己烷、正丁醇和甲苯峰面积的RSD分别为1.1％、1.3％、2.2％、1.2％、1.2％、1.6％、0.9％、1.8％、1.8％、1.5％、2.0％、1.1％(n＝7)，表明混合对照品溶液在室温下放置24h内稳定性良好。

2.8加样回收率试验

精密称取样品(批号：8978170204)约0.1g，共9份，分别置于顶空瓶内，分别精密加入“2.2.1”项下回收率低、中、高质量的混合对照品溶液2mL，每个水平浓度各3份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丙醇、四氢呋喃、环己烷、正丁醇和甲苯的平均加样回收率分别99.5％、100.5％、98.8％、99.0％、97.6％、98.9％、101.2％、101.9％、100.7％、100.8％、97.9％、101.1％，RSD均＜5％。

2.9样品有机溶剂残留量测定

取3批样品(批号：8978170204、8889750801、8971170209)各0.1g，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算有机溶剂残留量。结果见表3。

表3样品测定结果(n＝3)

三、讨论

3.1顶空平衡温度与平衡时间的选择

以水为溶剂时顶空瓶加热温度为70～85℃，顶空瓶加热时间为30～65分钟。顶空瓶温度过高会引起水蒸气膨胀，压力升高，易引起瓶子爆裂及仪器气密性等问题。本发明曾考察了在顶空温度为80℃下不同的顶空平衡时间(15、25、35、45、55、65min)时的色谱峰面积，结果当平衡时间超过35min后其峰面积基本不再增加，说明在35min时各待测有机溶剂已经在气液两相间达到平衡，故选择35min作为顶空平衡时间。同时考察在顶空平衡时间为35min时不同的平衡温度(70℃、80℃、85℃)时的色谱峰面积，结果三个温度下峰面积相差不大。考虑到温度过高，可能引起顶空瓶的密封性下降及挥发性物质的热降解影响测定结果，且待测有机溶剂在80℃条件下能全部能检出，故选择80℃作为顶空平衡温度。故最终选择衡温度为80℃，平衡时间为35min。

3.2溶剂及进样方式的选择

虽然甘氨酸在水中易溶，但考虑到上述12种有机溶剂中二氯甲烷不溶于水，甲苯微溶于水，因此选择50％二甲亚砜作为溶解介质。试验结果显示，甘氨酸在50％二甲亚砜中能完全溶解，且空白溶剂对测定无干扰。

与溶液直接进样相比，顶空进样具有更加简便、干净、快速的优点，避免了样品对进样口及色谱柱的污染，也减小了样品主成分对分离测定的干扰。

3.3色谱柱的选择

本发明考察了不同的毛细管柱(HP-INNOWAX、DB-624、HP-5)对色谱分离的影响，结果显示采用DB-624毛细管柱分离效果最好，且灵敏度高，待测有机溶剂能达到基线分离，峰型对称美观，故本试验选用DB-624毛细管柱。

本发明建立顶空气相色谱法测定甘氨酸原料药中有机残留溶剂甲醇、乙醇、丙酮、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丙醇、四氢呋喃、环己烷、正丁醇、甲苯。并对方法的系统适用性、精密度、线性关系、检出限与定量限、回收率等进行了考察。根据中国药典2015年版四部通则0861要求，甲醇、环己烷的限量不得过0.3％，乙醇、丙酮、异丙醇、正丙醇、乙酸乙酯、正丁醇的限量不得过0.5％，乙腈的限量不得过0.041％，二氯甲烷的限量不得过0.06％，四氢呋喃的限量不得过0.072％，甲苯的限量不得过0.089％。上述结果表明，这三批甘氨酸原料药中的12种溶剂残留量均符合我国药典中的相关限度标准，证明该法能够满足药典中相应残留溶剂的限量标准要求，可为甘氨酸残留溶剂检测项目提供技术参考。

Claims (4)

1.一种测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的顶空气相色谱法，其特征在于：采用DB-624毛细管柱，氢火焰离子化检测器，进样口温度为150℃，检测器为温度为250℃，载气为高纯氮气，载气流速为2.2mL/min，分流比为5∶1，顶空加热温度为80℃，平衡时间为35min。

2.根据权利要求1所述的测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的顶空气相色谱法，其特征在于：所述DB-624毛细管柱的升温程序为45℃保持2min，然后以5℃/min升温至65℃保持5min，再以40℃/min升温至200℃保持3min。

3.根据权利要求1所述的测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的顶空气相色谱法，其特征在于溶液的制备采用含50％二甲亚砜的水溶剂。

4.根据权利要求3所述的测定甘氨酸原料药中有机溶剂残留量的顶空气相色谱法，其特征在于溶液的制备按以下进行操作：

混合对照品溶液精密称取各对照品适量，用50％二甲亚砜溶液定量稀释制成每1mL中含有甲醇3mg、乙醇5mg、丙酮5mg、异丙醇5mg、乙腈0.41mg、二氯甲烷0.6mg、正丙醇5mg、乙酸乙酯5mg、四氢呋喃0.72mg、环己烷3mg、正丁醇5mg、甲苯0.89mg的混合对照品贮备液；精密量取5mL混合对照品贮备液，置于100mL量瓶中，加50％二甲亚砜溶液定容，摇匀，即得混合对照品溶液，同时作为回收率的中质量对照品溶液；精密量取4mL混合对照品贮备液，置于100mL量瓶中，加50％二甲亚砜溶液定容，摇匀，即得回收率的低质量对照品溶液；精密量取6mL混合对照品贮备液，置于100mL量瓶中，加50％二甲亚砜溶液定容，摇匀，即得回收率的高质量对照品溶液。

空白溶液精密量取50％二甲亚砜溶液2mL，置于顶空瓶中，密封，即得；

供试品溶液取样品约0.1g，精密称定，置于顶空瓶中，精密加50％二甲亚砜溶液2mL，密封，振摇，使溶解，即得。