CN112630354A - 一种测定氨基酸类药物中两种氯代烷基因毒杂质的方法 - Google Patents

一种测定氨基酸类药物中两种氯代烷基因毒杂质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种气相质谱联用分析仪测定一种氨基酸类化学原料药中氯代叔丁烷和1‑氯丁烷两种基因毒杂质的方法，目的在于严格控制该类化学原料药中可能存在的氯代叔丁烷和1‑氯丁烷这两种基因毒杂质，所采用的气相质谱联用分析仪检测灵敏度高，检测结果准确可靠，严格监测原料中这两种基因毒杂质的含量，以提高药物制剂的安全性。开发的检测方法如下：采用气质联用色谱仪，DB‑624毛细管气相色谱柱，采用程序升温，以顶空进样的方式，选择SIM模式，采集m/z＝43作为氯代叔丁烷定量离子，m/z＝77作为1‑氯丁烷定量离子，以对照品外标法对供试品中这两种基因毒性杂质进行定量检测。本发明检测快速，灵敏度高，准确度好，检测结果准确可靠。

Description

一种测定氨基酸类药物中两种氯代烷基因毒杂质的方法
技术领域
本发明涉及一种用气相质谱联用分析仪测定一种氨基酸类化学原料药中氯代叔丁烷和1-氯丁烷这两种基因毒杂质的检测方法，适用于该氨基酸类化学原料药或其他类似化合物中这两种基因毒性杂质的定量分析，属于药物分析技术领域。
背景技术
该氨基酸类化学原料药为一种新型抗肿瘤化合物，药物经口服或注射等方法引入体内，选择性的聚集在癌细胞中，经外部中子照射病变部位，药物发生细胞内核反应，利用由此产生的α例子和7Li离子在细胞范围内杀死癌细胞，达到抗肿瘤疗效。临床实验结果表明该氨基酸类化学原料药用于治疗脑胶质瘤和黑色素瘤的疗效确切，有希望成为治疗肿瘤的新型药物。
该氨基酸类化学原料药未被国内外药典收载，为化学合成，合成路线较为复杂，须使用多种有机试剂及催化剂，因反应过程中会使用盐酸、格氏试剂(含叔丁基氯化镁)，推测可能会生成氯代叔丁烷和1-氯丁烷这两种有基因毒性的杂质，根据最大日服剂量计算得出这两种杂质的限度分别为2μg/g，限度较低，常规气相检测方法无法满足灵敏度需求，因此开发了检测灵敏度更高的气相质谱联用仪进行定量检测的方法，以便于严格的监测该类化学原料药物中这两种基因毒性杂质的含量，以便于提高该类药物制剂的安全性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种采用气相质谱联用仪测定一种氨基酸类化学原料药中氯代叔丁烷和1-氯丁烷这两种基因毒杂质的检测方法，本方法灵敏度高、准确度高、重现性好。
本发明的测定方法如下步骤所示：
(1)供试品溶液的制备：取本氨基酸类化学原料药约0.1g，精密称定，置20ml顶空瓶中，加二甲基亚砜2ml，摇匀，密封，超声，作为供试品溶液。
(2)对照品溶液的制备：称取氯代叔丁烷和1-氯丁烷对照品适量，加二甲基亚砜溶解并定量稀释成每1ml中含氯代叔丁烷和1-氯丁烷分别为0.1μg的混合溶液，量取该混合溶液2ml置20ml顶空瓶中，密封，作为对照品溶液。
(3)色谱条件
仪器：气相质谱联用分析仪，检测器为单重四极杆检测器；
色谱柱：DB-624毛细管色谱柱(30m*0.32mm*1.8μm)；
升温程序：40℃保持10min，40℃/min升温至240℃保持3min；
流速：2ml/min；
MS Sourse：250℃；
MS Quad：150℃；
SIM模式：m/z＝43(氯代叔丁烷定量离子)，77(1-氯丁烷定量离子)；
Gian factor：1.00；
采集时间范围：0～12min；
进样口温度及分流比：200℃，2∶1；
顶空平衡温度及时间：90℃，30min；
定量阀温度：100℃；
传输线温度：110℃；
进样量：1ml；
气相循环时间：25min
进样时间：1min
(4)样品检测
系统适用性试验：精密取对照品溶液进样5次，记录色谱图，提取m/z为77和43的离子峰，m/z为77的离子峰为氯代叔丁烷，m/z为43的保留时间约5.9min的离子峰为1-氯丁烷。计算5针中氯代叔丁烷与1-氯丁烷的峰面积RSD，应≤5％，表明系统适用性符合要求。
取供试品溶液进样测定，记录色谱图，外标法以峰面积计算供试品中氯代叔丁烷与1-氯丁烷的含量。
计算公式如下：
Figure BSA0000232173570000021
式中：
Figure BSA0000232173570000022
AT：供试品溶液中待测成分的峰面积；
MT：供试品的称样量，mg。
AS：对照品溶液中成分的峰面积；
MS：对照品溶液中成分的称样量，mg；
VS：对照品溶液中成分的稀释倍数，为1000000；
有益效果
(1)本方法采用气相质谱联用分析仪，可达到氯代叔丁烷与1-氯丁烷的良好分离，通过选取定量离子以对照品外标法准确测定一种氨基酸类或结构相似的化学原料药中这两种基因毒性杂质的含量。
(2)本检测方法的专属性、线性、精密度、准确度、溶液稳定性等方面均经详细验证，且各项验证结果均符合相关法规和指导原则的要求，实际检测效果良好。具体通过以下方法实施。
(3)本法采用气相质谱联用分析仪进行检测，方法灵敏度高，氯代叔丁烷的检测限为0.001μg/ml，1-氯丁烷的检测限为0.007μg/ml，检测结果可靠，可以保证该化学原料药的高安全性。
附图说明
图1：空白溶剂中(m/z＝43)气质色谱图
图2：空白溶剂中(m/z＝77)气质色谱图
图3：氯代叔丁烷对照品(m/z＝43)气质色谱图
图4：1-氯丁烷对照品(m/z＝77)气质色谱图
图5：加标后供试品溶液的氯代叔丁烷(m/z＝43)气质色谱图
图6：加标后供试品溶液的1-氯丁烷(m/z＝77)气质色谱图
具体实施方式
检测方法进行了方法验证，验证内容包括专属性、定量限和检测限、线性和范围、准确度、精密度、耐用性，验证结果均符合要求，表明方法准确可靠，可用于该氨基酸类化学原料药中氯代叔丁烷和1-氯丁烷这两种基因毒杂质的检测。
实施例1.专属性
氯代叔丁烷定位溶液：称取氯代叔丁烷约100mg，置100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，混匀，取1ml置100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，混匀，得到对照品储备液。量取对照品储备液1ml置100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀；量取2ml置顶空瓶中，密封，即得。
1-氯丁烷定位溶液：称取1-氯丁烷约100mg，置100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，混匀，取1ml置100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，混匀，得到对照品储备液。量取对照品储备液1ml置100ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀；量取2ml置顶空瓶中，密封，即得。
混合溶液：取混合对照品溶液，即得。
供试品溶液：称取供试品约0.1g，精密称定，置顶空瓶中，加二甲基亚砜2ml，密封，超声，即得。
空白溶液：取二甲基亚砜2ml，置顶空瓶中，密封，即得。
分别取空白溶液、各定位溶液、供试品溶液进样测定，结果表明空白无干扰，供试品溶液无干扰，两峰间分离度大于1.5，专属性良好。
实施例2.定量限和检测限
取混合对照品溶液进行稀释，信噪比≥10∶1的溶液浓度即为其定量限；平行配制6份，计算峰面积的RSD值≤15.0％。
取定量限溶液进行稀释，信噪比≥3∶1的溶液浓度即为其检测限。
结果表明：氯代叔丁烷的定量限浓度为0.004μg/ml，检测限浓度为0.001μg/ml；1-氯丁烷的定量限浓度为0.02μg/ml，检测限浓度为0.007μg/ml；定量限浓度6针的峰面积RSD均小于15％，符合要求。
实施例3.线性和范围
配制对照品储备液，分别取对照品储备液0.2ml、0.5ml、0.8ml、1ml、1.5ml置10ml量瓶中，加二甲基亚砜稀释至刻度，得到序号为2、3、4、5、6的系列线性溶液。
分别精密量取各成分定量限溶液(序号1)及线性溶液2ml置顶空瓶中，密封，分别进样，记录色谱图，以峰面积对浓度做线性回归。
结果表明：氯代叔丁烷的线性方程为y＝201406.6510x-1781.7312，r＝0.9994，线性范围为0.004～1.5μg/ml；1-氯丁烷的线性方程为y＝87593.1284x+654.2421，r＝0.9995，线性范围为0.02～1.6μg/ml，表明在考察范围内线性关系良好。
实施例4.准确度
混合对照品溶液配制：配制100％限度浓度溶液作为对照品溶液。
150％对照品溶液配制：配制150％限度浓度溶液。
定量限溶液配制：配制各成分定量限溶液。
回收率溶液配制：取供试品约0.1g，精密称定，置顶空瓶中，平行称取12份，分别编号为1～12。1～3号加二甲基亚砜2ml、4～6号加定量限溶液2ml、7～9号加混合对照品溶液2ml、10～12号加150％对照品溶液2ml，密封，超声，摇匀，即得不加标、定量限、100％、150％回收率溶液。
分别取对照品溶液和回收率溶液进样，记录各残留溶剂峰面积，按外标法以峰面积计算含量，计算回收率。
结果表明：氯代叔丁烷与1-氯丁烷在加标定量限、加标100％限度浓度、加标150％限度浓度时，回收率均在75-125％之间，符合要求，方法准确度良好。
实施例5.精密度
①重复性
加标供试品溶液配制：称取供试品约0.1g，精密称定，置顶空瓶中，加入浓度分别为0.1μg/ml的混合对照品溶液2ml，密封，超声，即得。平行配制6份。
取混合对照品溶液1连续进样5次，计算5针峰面积的RSD值，应≤5.0％，再取混合对照品溶液2进样2次，加标供试品溶液分别进样1次，记录氯代叔丁烷与1-氯丁烷峰面积，按外标法以峰面积计算含量。
结果表明：加标供试品中氯代叔丁烷与1-氯丁烷的含量均为0.0002％，方法重复性良好。
②中间精密度
更换实验员，于不同时间，进行重复性试验。计算共12份加标供试品中氯代叔丁烷与1-氯丁烷的含量。
结果表明：12份加标供试品中氯代叔丁烷与1-氯丁烷的含量均为0.0002％，方法精密度良好。
实施例6.耐用性
①溶液稳定性
配制加标供试品溶液，将对照品溶液和加标供试品溶液室温放置，分别于不同时间点取对照品溶液和加标供试品溶液进样检测，记录色谱图，计算峰面积的RSD值，考察48小时内对照品溶液与供试品溶液的稳定性。
结果表明：对照品溶液与加标供试品溶液中氯代叔丁烷与1-氯丁烷的峰面积RSD在48h内RSD均小于10％，表明溶液在48h内稳定。
②调整试验条件
加标供试品溶液：称取供试品约0.1g，精密称定，加上述对照品溶液2ml，密封，摇匀，超声20min，即得。
调整试验条件：流速1.8ml/min、2.2ml/min，进样口温度190℃、210℃，顶空温度88℃、92℃，平衡时间28min、32min，初始温度38℃、42℃，更换不同批号色谱柱。分别取对照品溶液与加标供试品溶液分别顶空进样，记录色谱图，外标法以峰面积计算供试品溶液中各成分含量。
结果表明：在不同条件下，氯代叔丁烷与1-氯丁烷的含量均为0.0002％，表明对载气流速、进样口温度、顶空温度、顶空平衡时间、起始柱温及同类型不同批号色谱柱的耐用性良好。
实施该发明主要的技术参数
1.气相质谱联用分析仪，单重四极杆质谱检测器；
2.氯代叔丁烷定量离子m/z＝43，1-氯丁烷定量离子m/z＝77；
3.柱温采取程序升温方式(40℃保持10min，40℃/min升温至240℃保持3min)；
4.以二甲基亚砜为溶剂，顶空进样方式。

Claims (1)

1.一种测定氨基酸类药物中两种氯代烷基因毒杂质的方法，其特征在于用气相质谱联用分析仪能快速、准确的测定一种氨基酸类化学原料药中氯代叔丁烷、1-氯丁烷这两种基因毒性杂质的含量，该方法检测灵敏度高，检测结果准确可靠，该测定方法包括如下步骤：
(1)供试品溶液的制备
取本氨基酸类化学原料药约0.1g，精密称定，置20ml顶空瓶中，加二甲基亚砜2ml，摇匀，密封，超声，作为供试品溶液；
(2)对照品溶液的制备
称取氯代叔丁烷和1-氯丁烷对照品适量，加二甲基亚砜溶解并定量稀释成每1ml中含氯代叔丁烷和1-氯丁烷分别为0.1μg的混合溶液，量取该混合溶液2ml，置20ml顶空瓶中，密封，作为对照品溶液；
(3)色谱条件
仪器：气相质谱联用分析仪，检测器为单重四极杆检测器；
色谱柱：DB-624毛细管色谱柱(30m*0.32mm*1.8μm)；
升温程序：40℃保持10min，40℃/min升温至240℃保持3min；
流速：2ml/min；
MS Sourse：250℃；
MS Quad：150℃；
SIM模式：m/z＝43(氯代叔丁烷定量离子)，77(1-氯丁烷定量离子)；
Gian factor：1.00；
采集时间范围：0～12min；
进样口温度及分流比：200℃，2∶1；
顶空平衡温度及时间：90℃，30min；
定量阀温度：100℃；
传输线温度：110℃；
进样量：1ml；
气相循环时间：25min
进样时间：1min
(4)样品检测
系统适用性试验：精密取对照品溶液进样5次，记录色谱图，提取m/z为77和43的离子峰，m/z为77的离子峰为氯代叔丁烷，m/z为43的保留时间约5.9min离子峰为1-氯丁烷，计算5针中氯代叔丁烷与1-氯丁烷的峰面积RSD，应≤5％，表明系统适用性符合要求；
取供试品溶液进样测定，记录色谱图，外标法以峰面积计算供试品中氯代叔丁烷与1-氯丁烷的含量；
计算公式如下：
Figure FSA0000232173560000021
式中：
Figure FSA0000232173560000022
AT：供试品溶液中待测成分的峰面积；
MT：供试品的称样量，mg；
AS：对照品溶液中成分的峰面积；
MS：对照品溶液中成分的称样量，mg；
VS：对照品溶液中成分的稀释倍数。
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