CN117269342A - 一种同时测定维生素b2中多种遗传毒杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药品检测技术领域，更具体而言，涉及一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法。所述多种遗传毒杂质为杂质G、杂质I和杂质J；所述检测方法使用高效液相色谱仪进行，流动相为磷酸盐缓冲液与乙腈的混合溶液，采用等度洗脱。本发明根据产品结构特点及化合物性质，提供了一种采用高效液相色谱仪即可同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法。采用等度色谱条件，进一步能同时测定上述3种遗传毒杂质并分离，各杂质之间及各杂质与维生素B2均可有效分离，通过对条件的优化，使得对各组分检测的灵敏度和准确度进一步得到提升，并满足各杂质的限度要求，检测成本和操作难度大大降低。
Description
技术领域
本发明涉及药品检测技术领域，更具体而言，涉及一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法。
背景技术
维生素B2又名核黄素，是人体必需的13种维生素之一，参与细胞的生长代谢，对人体正常的生理功能有非常重要的调控作用，是机体组织代谢和修复必须要的营养素，可促进细胞再生，促使皮肤、指甲、毛发的正常生长，预防和消除炎症，增进视力。常用于口角炎、唇炎、舌炎、眼结膜炎和阴囊炎等疾病的防治。
杂质G、杂质I、杂质J分别为维生素B2的合成中间体和起始物料，其结构中含苯肼、苯胺类警示结构，按ICHM7指导原则要求，应按潜在致突变杂质进行研究和控制，基于TTC计算可接受摄入量，各杂质每日最大摄入量1.5μg，按照维生素B2的日最大服用剂量为30mg计算，上述杂质在维生素B2中控制限度应为不得过50ppm，该限度远低于普通杂质的控制限度，对检测方法灵敏度有较高要求，而各国药典、及公开文献中均未对上述杂质进行控制，现有技术中常采用的高效液相色谱法对维生素B2中杂质G、杂质I和杂质J进行检测时，维生素B2中的未知杂质可能对上述杂质的检测造成干扰，流动相组成、比例的选择对杂质的分离有较大影响。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个方面的目的在于，提供一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，所述多种遗传毒杂质为杂质G、杂质I和杂质J；所述检测方法使用高效液相色谱仪进行，流动相为磷酸盐缓冲液与乙腈的混合溶液，采用等度洗脱；
所述杂质化学结构式如下所示：
。
优选的，所述检测方法具体操作步骤如下：
S1.制备供试品溶液：取维生素B2精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成供试品溶液；
S2.制备对照品溶液：分别取杂质G对照品、杂质I对照品和杂质J对照品精密称定，用溶剂定量稀释制成各杂质对照品溶液；
S3.制备混合溶液：取维生素B2对照品加溶剂溶解，再精密加入杂质G对照品、杂质I对照品和杂质J对照品，定量稀释制成混合溶液；
S4.制备杂质定位溶液：取杂质G对照品精密称定，加溶剂溶解制成杂质G定位溶液；取杂质I对照品精密称定，加溶剂溶解制成杂质I定位溶液；取杂质J对照品精密称定，加溶剂溶解制成杂质J定位溶液；
S5.调节仪器：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相，调节柱温，调节流动相流速，调节检测波长，采用等度洗脱；
S6.测定：精密量取S2～S4制成的各溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
优选的，所述溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液-水，氢氧化钠-水质量比为10：90。
优选的，所述S1供试品溶液中维生素B2的浓度为1.8～2.2mg/ml。
优选的，所述S2对照品溶液中杂质G对照品、杂质I对照品和杂质J对照品的浓度均为0.08～0.12μg/ml。
优选的，所述S3中混合溶液维生素B2对照品的浓度为1.8～2.2mg/ml，杂质G对照品、杂质I对照品和杂质J对照品浓度均为0.08～0.12μg/ml。
优选的，所述S4中杂质G对照品、杂质I对照品和杂质J对照品定位溶液浓度均为0.1μg/ml。
优选的，所述S5中色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，规格为Shim-packGIST C18 4.6mm×250mm，5μm。
优选的，所述流动相为10mmol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈，磷酸二氢钾溶液-乙腈质量比为65～61：35～39，调节柱温为25～35℃，调节流动相流速为0.9～1.1ml/min，调节检测波长225～235nm进行检测。
优选的，所述磷酸二氢钾溶液用三乙胺调节pH至6.8。
本发明所具有的有益效果如下：
本发明根据产品结构特点及化合物性质，提供了一种采用高效液相色谱仪即可同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法。采用等度色谱条件，进一步能同时测定上述3种遗传毒杂质并分离，各杂质之间及各杂质与维生素B2均可有效分离，选择各杂质均适合的检测波长，使各杂质的响应值符合要求，确保准确定量，通过对条件的优化，使得对各组分检测的灵敏度和准确度进一步得到提升，并满足各杂质的限度要求，检测成本和操作难度大大降低。
本发明方法采用设备简单、分析速度快、检测成本低、专属性好、灵敏度高，能够快速、简便、准确地控制3个遗传毒杂质的含量，降低药物安全风险，有利于维生素B2的安全推广与应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明实施例一中混合溶液的色谱图；
图2是本发明实施例一中对照品溶液的色谱图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
本实施例提供一种采用高效液相色谱仪同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，采用以下条件进行测定：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的规格为Shim-packGIST C184.6mm×250mm，5μm；流动相为10mmol/L磷酸二氢钾溶液（用三乙胺调节pH至6.8）-乙腈（63:37）；调节柱温为25～35℃，调节流动相流速为0.9～1.1ml/min；检测波长：230nm；采用等度洗脱。
供试品溶液：取为维生素B2适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成1.8～2.2mg/ml的供试品溶液。
对照品溶液：取各杂质对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成0.08～0.12μg/ml的各杂质对照品溶液。
混合溶液：取维生素B2对照品适量，加少量溶剂使溶解，再精密加入杂质G对照品、杂质I对照品、杂质J对照品，定量稀释制成混合溶液；其中，维生素B2对照品的浓度为1.8～2.2mg/ml，杂质G对照品、杂质I对照品、杂质J对照品的浓度均为0.08～0.12μg/ml。
各杂质定位溶液：取杂质G对照品，精密称定，加溶剂溶解制成杂质G定位溶液浓度为0.1μg/ml；取杂质I对照品，精密称定，加溶剂溶解制成杂质I定位溶液浓度为0.1μg/ml；取杂质J对照品，精密称定，加溶剂溶解制成杂质J定位溶液浓度为0.1μg/ml。
各溶液的具体配制过程及本发明方法的实验验证过程及结果见实验例一至四。
实施例一
专属性试验
供试品溶液的配制：取维生素B2约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
对照品溶液的配制：取各杂质对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成0.1μg/ml的溶液，作为各杂质对照品溶液。
混合溶液的配制：取维生素B2对照品约20mg，加少量溶剂使溶解，再精密加入杂质G对照品、杂质I对照品、杂质J对照品各适量，加溶剂稀释制成每1ml中含维生素B2对照品2mg，杂质G对照品、杂质I对照品、杂质J对照品各0.1μg的溶液，作为混合溶液。
各杂质定位溶液的配制：取杂质G对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释得到0.1μg/ml的溶液，作为杂质G定位溶液；取杂质I对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释得到0.1μg/ml的溶液，作为杂质I定位溶液；取杂质J对照品适量，精密称定，加溶剂溶解并稀释得到0.1μg/ml的溶液，作为杂质J定位溶液。
测定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，流动相为10mmol/L磷酸二氢钾溶液（用三乙胺调节pH至6.8）-乙腈（63:37），柱温为30℃，流速为每分钟1ml，检测波长为230nm，采用等度洗脱。
精密量取上述制备对照品溶液、混合溶液及各杂质定位溶液各50μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果如下表1所示，混合溶液、对照品溶液色谱图如图1和图2所示。
表1.专属性-定位试验结果1
结论：溶剂不干扰供试品溶液中各已知杂质测定，各杂质峰之间、各杂质与主峰之间均分离良好，理论塔板数均满足有关物质测定的要求。
实施例二
线性与范围试验
线性溶液的制备：取杂质G对照品、杂质I对照品和杂质J对照品各适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml分别含1μg的溶液，作为各杂质贮备溶液，精密量取适量，用溶剂依次稀释制成系列限度浓度200%至定量限的一系列线性溶液。
精密量取上述各溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；结果如下表2所示。
表2.线性与范围试验结果
结论：（1）杂质G：在0.024~0.188μg/ml（相当于检测浓度的0.0012%~0.0094%）浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y=132902.4845x-742.3963，r=0.9990，截距相当于100%浓度响应值的百分比为：6.71%。
（2）杂质I：在0.005~0.214μg/ml（相当于检测浓度的0.0003%~0.0107%）浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y=246127.6534x+725.3488，r=0.9998，截距相当于100%浓度响应值的百分比为：2.68%。
（3）杂质J：在0.005~0.202μg/ml（相当于检测浓度的0.0003%~0.0101%）浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y=174681.7092x+1253.1320，r=0.9988，截距相当于100%浓度响应值的百分比为：6.68%。
实施例三
定量限与检测限
定量限和检测限是根据信噪比来确定。信噪比约为10的浓度作为定量限。信噪比约为3的浓度作为检测限。
定量限：精密量取线性项下各杂质贮备液适量，置加溶剂定量稀释制成每1ml中约含杂质G 0.024μg、杂质I 0.005μg、杂质J 0.005μg的溶液，作为定量限溶液。连续进样6次。
检测限：精密量取定量限溶液4ml，置10ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。
精密量取上述各溶液50μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；结果如下表3和表4所示。
表3.定量限&检测限测定结果
表4.定量限重复性测定结果
由上表数据可知，各杂质定量限低于限度浓度，各检测限低于定量限，满足检测要求，定量限溶液重复进样6次，保留时间的相对标准偏差均小于1%，峰面积的相对标准偏差均小于10%，此方法检测灵敏度高，满足检测要求。
实施例四
回收率试验
对照品溶液：
取杂质G、杂质I、杂质J对照品各适量，精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含杂质G、杂质I、杂质J各约1μg/ml的溶液，作为杂质对照品储备液。精密量取杂质对照品储备液1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；平行配制2份。
供试品溶液的配制：
1）50%准确度溶液：取供试品约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加少量溶剂使溶解，加入杂质对照品储备液0.5ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；平行配制3份。
2）100%准确度溶液：取供试品约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加少量溶剂使溶解，再加入杂质对照品储备液1ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；平行配制6份。
3）150%准确度溶液：取供试品约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加少量溶剂使溶解，加入杂质对照品储备液1.5ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；平行配制3份。
本底溶液的配制：
取供试品约20mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
精密量取上述溶液各50μl，分别注入液相色谱仪，结果如下表5、表6和表7所示。
表5.有关物质方法验证-杂质G回收率结果
表6.有关物质方法验证-杂质I回收率结果
表7.有关物质方法验证-杂质J回收率结果
结论：杂质回收率试验结果显示，杂质G、杂质I和杂质J的12份准确度样品的回收率均在80%～120%之间，由表3至表5可知，各杂质回收率满足本品对各已知杂质的测定要求，表明本方法准确度良好。
实施例五
耐用性试验
取实验例一中的供试品溶液与对照品溶液，分别于柱温25℃、35℃；流速0.9ml/min、1.1ml/min及不同色谱柱条件下进行试验，与标准条件进行对比，结果如表8和表9所示。
表8.耐用性试验-理论板数对比
表9.耐用性试验-检测结果对比表
结论：微调色谱条件下，对照品溶液中理论板数均符合要求；检测结果基本一致。表明本方法耐用性良好。
以上所述仅为本发明优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述多种遗传毒杂质为杂质G、杂质I和杂质J；所述检测方法使用高效液相色谱仪进行，流动相为磷酸盐缓冲液与乙腈的混合溶液，采用等度洗脱；
所述杂质化学结构式如下所示：
。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述检测方法具体操作步骤如下：
S1.制备供试品溶液：取维生素B2精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成供试品溶液；
S2.制备对照品溶液：分别取杂质G对照品、杂质I对照品和杂质J对照品精密称定，用溶剂定量稀释制成各杂质对照品溶液；
S3.制备混合溶液：取维生素B2对照品加溶剂溶解，再精密加入杂质G对照品、杂质I对照品和杂质J对照品，定量稀释制成混合溶液；
S4.制备杂质定位溶液：取杂质G对照品精密称定，加溶剂溶解制成杂质G定位溶液；取杂质I对照品精密称定，加溶剂溶解制成杂质I定位溶液；取杂质J对照品精密称定，加溶剂溶解制成杂质J定位溶液；
S5.调节仪器：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相，调节柱温，调节流动相流速，调节检测波长，采用等度洗脱；
S6.测定：精密量取S2～S4制成的各溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
3.根据权利要求2所述的一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述溶剂为0.1mol/L氢氧化钠溶液-水，氢氧化钠-水质量比为10：90。
4.根据权利要求2所述的一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S1供试品溶液中维生素B2的浓度为1.8～2.2mg/ml。
5.根据权利要求2所述的一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S2对照品溶液中杂质G对照品、杂质I对照品和杂质J对照品的浓度均为0.08～0.12μg/ml。
6.根据权利要求2所述的一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S3中混合溶液维生素B2对照品的浓度为1.8～2.2mg/ml，杂质G对照品、杂质I对照品和杂质J对照品浓度均为0.08～0.12μg/ml。
7.根据权利要求2所述的一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S4中杂质G对照品、杂质I对照品和杂质J对照品定位溶液浓度均为0.1μg/ml。
8.根据权利要求2所述的一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S5中色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，规格为Shim-packGIST C184.6mm×250mm，5μm。
9.根据权利要求2所述的一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述流动相为10mmol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈，磷酸二氢钾溶液-乙腈质量比为65～61：35～39，调节柱温为25～35℃，调节流动相流速为0.9～1.1ml/min，调节检测波长225～235nm进行检测。
10.根据权利要求9所述的一种同时测定维生素B2中多种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述磷酸二氢钾溶液用三乙胺调节pH至6.8。
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