CN112305088B - 一种注射用4-脱甲氧柔红霉素有关物质的分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种注射用4‑脱甲氧柔红霉素有关物质的分析方法，采用本发明的方法可以实现注射用化合物L中各杂质的完全分离，且主成分与各杂质的分离度均大于1.5，各杂质间的分离度均大于1.5，理论板数按主成分计不低于2000。杂质的检测灵敏度非常高，利用本发明的方法可以快速准确地、以高灵敏度进行化合物L有关物质的定量分析，从而保证本品的质量可控性。

Description

一种注射用4-脱甲氧柔红霉素有关物质的分析方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种注射用4-脱甲氧柔红霉素有关物质的高效液相色谱分析方法。
背景技术
蒽环类化合物是一类广泛应用于治疗血液系统恶性肿瘤和实体肿瘤的物质，其中(7S,9S)-9-乙酰基-7,8,9,10-四氢-6,7,9,11-四羟-7-O-(2,3,6-三脱氧-3-氨基-α-L-来苏-已-吡喃糖)-5,12-骈四苯盐酸盐，即4-脱甲氧柔红霉素(下文称为化合物L)，是治疗复发性和难治性的成人急性髓细胞白血病(AML)的一线用药，由法玛西亚普强公司开发生产，1990年09月27日经FDA批准上市，2004年由CFDA批准上市。相较于盐酸柔红霉素，化合物L具有毒副作用更小、疗效更好、耐药性更低等优点。
在化合物L合成及储存过程中会产生A、B、C、D、E五个杂质(结构见下表)，其中杂质A既是合成过程中的工艺产物又是酸降解和高温降解的主要产物，杂质B为化合物L与辅料乳糖相互作用产生的降解杂质，C是碱降解的主要产物，杂质D和杂质E为合成过程中主要的工艺杂质。因此，对这五个有关物质的定量控制具有重要意义。
Figure BDA0002145197600000011
Figure BDA0002145197600000021
美国药典公开了以水-乙腈-甲醇-磷酸(540:290:170:2)(每1000ml中含1g十二烷基硫酸钠，并用2N氢氧化钠调节pH至3.6±0.1)为流动相，用高效液相色谱法测定化合物L中含量及有关物质的方法。
日本药典公开了以缓冲液(10.2g磷酸二氢钾溶解于750ml水中，加入1ml磷酸)-四氢呋喃(750:250)(每500ml中含0.72g十二烷基硫酸钠，0.5mlN,N-二甲基正辛胺，并用2N氢氧化钠调节pH至4.0)为流动相，用高效液相色谱法测定化合物L含量及有关物质的方法。
国家药典委员会征求意见稿公开了以0.1％磷酸溶液-甲醇(57:43)为流动相用高效液相色谱法测定注射用化合物L含量及有关物质的方法。
但上述分析方法均无法有效同时分离化合物L供试品中存在的杂质A-E，因此，开发一种能够同时分离测定化合物L及其杂质的方法对于控制注射用化合物L的质量，提高药品疗效、降低毒副作用是非常必要的。
发明内容
一方面，本发明提供了一种注射用化合物L有关物质的分析方法，其特征在于：所述方法是高效液相色谱法，该方法采用反相色谱柱，流动相A选自磷酸水溶液，流动相B选自甲醇和乙腈的混合溶液，按照等度或梯度洗脱。
在一些实施方案中，所述磷酸水溶液的浓度为0.05～0.5％；在一些典型的实施方案中，所述磷酸缓冲液的浓度为0.05～0.2％；在一些更为典型的实施方案中，所述磷酸缓冲液的浓度为0.09～0.11％；在一些最为典型的实施方案中，所述磷酸缓冲液的浓度为0.1％。
在一些实施方案中，所述甲醇和乙腈的混合溶液，其中甲醇与乙腈的体积比25～75：25～75；在一些典型的实施方案中，甲醇与乙腈的体积比为45～55：45～55；在一些更为典型的实施方案中，甲醇与乙腈的体积比为50：50。
在一些实施方案中，所述流动相A与流动相B的体积比为10～80：20～90，按照等度或梯度洗脱；在一些典型的实施方案中，所述流动相A与流动相B的体积比为15～70：30～85，按照等度或梯度洗脱；在一些更为典型的实施方案中，所述流动相A与流动相B按照下表梯度洗脱：
Figure BDA0002145197600000031
在一些实施方案中，所述流动相的流速为0.5～2.0ml/min；在一些典型的实施方案中，所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min；在一些更为典型的实施方案中，所述流动相的流速为0.9～1.1ml/min；在一些最为典型的实施方案中，所述流动相的流速为1.0ml/min。
在一些实施方案中，所述反相色谱柱采用非极性固定相作为填料；在一些典型的实施方案中，所述反相色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料；在一些更为典型的实施方案中，所述反相色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料，且其规格为4.6mm×250mm，5μm。
在一些实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用二极管阵列检测器、紫外检测器、示差折光检测器或蒸发光散射检测器；在一些典型的实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用紫外吸收检测器；在一些更为典型的实施方案中，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用紫外吸收检测器，且其检测波长为254nm。
在一些实施方案中，所述色谱柱的柱温为20～50℃；在一些典型的实施方案中，所述色谱柱的柱温为30～40℃；在一些更为典型的实施方案中，所述色谱柱的柱温为33～37℃；在一些最为典型的实施方案中，所述色谱柱的柱温为35℃。
在一些实施方案中，所述进样器的温度为0～15℃；在一些典型的实施方案中，所述进样器的温度为2～8℃；在一些更为典型的实施方案中，所述进样器的温度为2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃；在一些最为典型的实施方案中，所述进样器的温度为4℃。
一方面，本发明提供了一种化合物L有关物质的分析方法，其特征在于：
所述分析方法是在高效液相色谱仪上进行的；
检测器是紫外吸收检测器，检测波长是254nm；
色谱柱是采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料的反相色谱柱，柱温为35℃；
进样器温度为4℃；
按照下表梯度洗脱，其中流动相A为0.1％的磷酸水溶液，流动相B为体积比为50％：50％的甲醇和乙腈的混合溶液
Figure BDA0002145197600000041
流动相的流速为1.0ml/min；
分别注入化合物L的供试品溶液、对照溶液和/或系统适应性溶液；
所述系统适用性溶液包含化合物L和选自杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E中的一种或两种以上混合物；
通过主成分自身对照法计算化合物L、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E的含量。
在一些实施方案中，化合物L、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E的含量计算按照加入校正因子进行计算；在一些典型的实施方案中，化合物L与其他单个杂质的校正因子为1.0，杂质A的校正因子为0.7、杂质B的校正因子为2.4、杂质C的校正因子为1.0、杂质D的校正因子为1.6、杂质E的校正因子为1.4。
在一些特定的实施方案中，本发明提供了一种注射用化合物L有关物质的分析方法，其特征在于：
(1)化合物L定位溶液配制：取化合物L对照品，精密称定，用流动相A：流动相B(65:35，V:V)的混合溶液溶解并稀释，定容，摇匀，即得；
(2)杂质A定位溶液配制：取杂质A对照品适量，精密称定，用流动相A：流动相B(65:35，V:V)的混合溶液溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述杂质A，其结构式为：
Figure BDA0002145197600000042
(3)杂质B定位溶液配制：取杂质B对照品适量，精密称定，用流动相A：流动相B(65:35，V:V)的混合溶液溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述杂质B，其结构式为：
Figure BDA0002145197600000051
(4)杂质C定位溶液配制：取杂质C对照品适量，精密称定，用流动相A：流动相B(65:35，V:V)的混合溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得，
其中，所述杂质C，其结构式为：
Figure BDA0002145197600000052
(5)杂质D定位溶液配制：取杂质D对照品适量，精密称定，用流动相A：流动相B(65:35，V:V)的混合溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得，
其中，所述杂质D，其结构式为：
Figure BDA0002145197600000053
(6)杂质E定位溶液配制：取杂质E对照品适量，精密称定，用流动相A：流动相B(65:35，V:V)的混合溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得，
其中，所述杂质E，其结构式为：
Figure BDA0002145197600000054
(7)系统适用性溶液配制：取化合物L、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E各适量，精密称定，用流动相A：流动相B(65:35，V:V)的混合溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得；
(8)供试品溶液配制：取化合物L供试品适量，精密称定，用流动相A：流动相B(65:35，V:V)的混合溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得；
(9)对照溶液配制：精密量取供试品溶液适量，用流动相A：流动相B(65:35，V:V)的混合溶液稀释M倍，作为对照溶液；
(10)液相条件：采用Welch Ultimate AQ-C18，规格为4.6mm×250mm，5μm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱温为35℃；检测器是紫外吸收检测器，检测波长是254nm；进样器温度为4℃；流动相A为0.1％的磷酸水溶液；流动相B为体积比为50％：50％的甲醇和乙腈的混合溶液，流动相流速为1.0ml/min，按下表梯度洗脱：
Figure BDA0002145197600000061
(11)样品测定：将化合物L的定位溶液、杂质A的定位溶液、杂质B的定位溶液、杂质C的定位溶液、杂质D的定位溶液、杂质E的定位溶液、系统适用性溶液﹑供试品溶液和对照溶液适量，分别注入液相色谱仪，记录各溶液的色谱图；
(12)含量计算：根据各色谱图，通过加校正因子或不加校正因子的主成分自身对照法计算样品中各杂质含量：
Figure BDA0002145197600000062
其中，At为供试品溶液色谱图中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D或杂质E各自的峰面积；A为对照溶液中主峰的峰面积，即化合物L的峰面积；f为校正因子；M为稀释的倍数。
在一些实施方案中，供试品溶液中色谱图中如有杂质峰，杂质A的含量不高于0.5％，优选为不高于0.1％；杂质B的含量不高于0.5％，优选为不高于0.1％；杂质C的含量不高于0.2％，优选为不高于0.1％；杂质D的含量不高于0.2％，优选为不高于0.5％；杂质E的含量不高于0.2％，优选为不高于0.1％；各杂质总含量不高于1.0％，优选为不高于0.5％。
文本中，化合物L的结构为
Figure BDA0002145197600000063
文本中，杂质A结构为
Figure BDA0002145197600000064
可以通过直接购买或按照已经公开的文献制备得到。
文本中，杂质B结构为
Figure BDA0002145197600000071
可以通过直接购买或按照已经公开的文献制备得到。
文本中，杂质C结构为
Figure BDA0002145197600000072
可以通过直接购买或按照已经公开的文献制备得到。
文本中，杂质D结构为
Figure BDA0002145197600000073
可以通过直接购买或按照已经公开的文献制备得到。
文本中，杂质E结构为
Figure BDA0002145197600000074
可以通过直接购买或按照已公开的文献制备得到。
本文中，除非另有说明，以“供试品溶液配制”的化合物L包括但不限于新制备或经储存的包含化合物L的原料药和制剂组合物。
本文中，有关物质也表述为杂质。
本文中，适量是指在高效液相色谱仪的检测限范围内，其中，化合物L、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E的检测限依次为21、10、46、12、32、25ng/mL，定量限依次为62、31、137、36、97、75ng/mL。
定位溶液浓度为100ng/ml-0.5mg/ml；优选为1.0μg/ml-0.1mg/ml；更优选为2.0μg/ml-50μg/ml。
系统适用性溶中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D或杂质E的浓度为：100ng/ml-0.5mg/ml；优选为0.2μg/ml-0.05mg/ml；更优选为0.5μg/ml-5μg/ml。
系统适用性溶中化合物L的浓度为：1μg/ml-10mg/ml；优选为10μg/ml-1mg/ml；更优选为0.1mg/ml-0.4mg/ml。
供试品溶液中，化合物L的浓度为0.01mg/ml～10mg/ml，优选为0.1mg/ml～1mg/ml，更优选为0.2mg/ml～0.4mg/ml。
对照溶液中，化合物L的浓度为0.1μg/ml～20μg/ml；优选为0.2μg/ml～2μg/ml；更优选为0.3μg/ml～1μg/ml，相应的，稀释的倍数M可根据供试品中化合物L的浓度与所需对照溶液中化合物L的浓度之比计算得到。
本发明中，色谱柱Welch Ultimate AQ-C18可以用其他效能相当的色谱柱代替。
本发明中校正因子的计算可通过精密称取主成分(化合物L)对照品和杂质对照品各适量，分别配制成不同浓度的溶液，HPLC检测，绘制主成分浓度和杂质浓度对其峰面积的回归曲线，以主成分回归直线斜率与杂质回归直线斜率的比计算校正因子。
0.1％磷酸缓冲液的配制：精确量取磷酸溶液1ml，加水至1000ml，即得。
本发明创造性的建立了一套新的化合物L有关物质的分析方法，采用本发明的方法可以实现注射用化合物L中各杂质的完全分离，且主成分与各杂质的分离度均大于1.5，各杂质间的分离度均大于1.5，理论板数按主成分计不低于2000。杂质的检测灵敏度非常高，利用本发明的方法可以快速准确地、以高灵敏度进行化合物L有关物质的定量分析，从而保证本品的质量可控性。
附图说明
图1：实施例1系统适用性溶液测定的图谱；
图2：实施例1注射用化合物L供试品溶液测定的图谱；
图3：参考例1系统适用性溶液测定的图谱；
图4：参考例2系统适用性溶液测定的图谱；
图5：参考例3系统适用性溶液测定的图谱；
图6：参考例4系统适用性溶液测定的图谱。
具体实施方式
下面的实施例可以使本专业的技术人员更全面地理解本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。本发明的方法也并不限于上述5个有关物质，任何采用本发明方法分离测定化合物L与上述杂质中的1-5个杂质的任意组合均落入本发明范围内。
实施例1
仪器与试药：Waters e2695高效液相色谱仪(配PDA检测器)；所有试剂均为HPLC级。
色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：254nm
流速：1.0mL/min
柱温：35℃
进样量：20μL
进样器温度：4℃
流动相：流动相A为0.1％磷酸溶液，流动相B为甲醇-乙腈(50:50)，洗脱梯度如下：
Figure BDA0002145197600000091
空白溶剂配制：精密量取0.1％磷酸溶液500mL，甲醇250mL，乙腈250mL，混匀，即得。
定位溶液配制：分别精密量取各杂质对照品及化合物L对照品，用流动相A：流动相B(65:35，V/V)的混合溶液分别稀释制成每1mL中约含杂质A为10μg的定位溶液，每1mL中约含杂质B为10μg的定位溶液，每1mL中约含杂质C为10μg的定位溶液，每1mL中约含杂质D为10μg的定位溶液，每1mL中约含杂质E为10μg的定位溶液，每1mL中约含化合物L为10μg的定位溶液，
系统适用性溶液配制：分别精密量取各杂质对照品及化合物L对照品，用流动相A：流动相B(65:35，V/V)的混合溶液稀释制成每1mL含化合物L约0.3mg、杂质A约3μg、杂质B约3μg、杂质C约3μg、杂质D和杂质E约3μg的混合溶液。
化合物L供试品溶液配制：取注射用化合物L适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含化合物L0.3mg的溶液，即得。
测定：取空白溶液、各定位溶液、自身对照溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果显示空白溶液对测定无干扰；杂质E、杂质B、化合物L、杂质D、杂质A、杂质C依次出峰，保留时间分别为17.310min、20.851min、22.091min、23.782min、34.262min、44.897min。
取系统适用性溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图1，化合物L峰与杂质B峰、杂质D峰间的分离度分别为2.2、3.0，杂质E和杂质B相邻峰间的分离度为9.7，杂质D、A、C相邻峰间的分离度依次为44.5、20.1。
取注射用化合物L供试品溶液20μL注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果见图2，按加校正因子的自身对照法计算，杂质A、B、C、D均未检出，杂质E含量为0.07％，其它单个杂质未检出，杂质总和为0.07％。所以本法可用于注射用化合物L的质量控制。
实施例2强制降解试验
对注射用化合物L进行强制降解试验，考察所产生的降解产物与主峰的分离情况，并采用紫外吸收检测器进行主峰纯度检查以验证本方法专属性是否达到要求。
(1)溶液强制降解试验
酸降解溶液：取本品约165mg(相当于化合物L15mg)，置50mL量瓶中，加1mol/L盐酸溶液2mL，水浴80℃破坏5分钟后取出，加入1mol/L氢氧化钠溶液2mL使之中和，放冷，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
碱降解溶液：取本品约165mg(相当于化合物L15mg)，置50mL量瓶中，加入1mol/L氢氧化钠溶液1mL，室温放置15分钟后，加入1mol/L盐酸溶液1mL使之中和，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
氧化降解溶液：取本品约165mg(相当于化合物L15mg)，置50mL量瓶中，加入10％H2O2溶液2mL，室温破坏6小时后，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。
水降解溶液：取本品约165mg(相当于化合物L15mg)，置50ml量瓶中，加溶剂稀释至刻度，摇匀，在90℃水浴中破坏2小时后取出，冷却至室温，即得。
(2)固态强制降解试验
高温降解溶液：取放入60℃高温试验箱破坏15天的本品约165mg(相当于化合物L15mg)，置50mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
光照降解溶液：取放入光照试验箱破坏15天的本品约165mg(相当于化合物L15mg)，置50mL量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
测定：精密量取各强制降解溶液20μL注入高效液相色谱仪，按照实施例1所述液相条件检测，记录色谱图，按峰面积归一化算法计算，结果见下表所示：
Figure BDA0002145197600000101
Figure BDA0002145197600000111
本品固态条件下较为稳定，在光照条件下未发生降解，在高温条件下仅产生了少量的杂质A和杂质B；本品溶液在水、酸、碱、氧化条件下均不稳定，杂质个数和杂质总量均有一定程度增加；各破坏条件下降解产物与主峰能够完全分离，破坏前后物料平衡系数均在90％～110％之间，各破坏条件下主峰峰纯度满足测定要求。本方法专属性好。
实施例3耐用性试验
在实施例1的检测色谱条件的基础上改变流速、柱温、磷酸浓度、有机相比例等条件，或使用不同批次色谱柱，考察检测方法的耐用性。
溶液配制及测定方法参照实施例1，色谱条件见下表所示：
Figure BDA0002145197600000112
结果如下所示：
Figure BDA0002145197600000121
结论：在不同色谱条件下，化合物L峰与相邻色谱峰均能达到基线分离，各杂质峰间的分离度均符合要求，本品方法耐用性良好。
实施例4灵敏度试验
分别取化合物L及各杂质对照品贮备液适量，用溶剂溶解并制成适宜浓度的溶液，a按照实施例1所述的色谱条件条件测定，记录色谱图，以S/N＝10计算定量限，S/N＝3计算检测限。结果显示化合物L、A、B、C、D、E的检测限依次为21、10、46、12、32、25ng/mL，定量限依次为62、31、137、36、97、75ng/mL。
参考例1
仪器与试剂：Waters e2695高效液相色谱仪仪(配PDA检测器)；所有试剂均为HPLC级。
色谱柱：Agilent Zorbax TMS(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：254nm
流速：1.0mL/min
柱温：35℃
进样量：20μL
进样器温度：4℃
流动相：水-乙腈-甲醇-磷酸(540:290:170:2)，每1000mL中含1g十二烷基硫酸钠，并用2mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至3.6。
溶剂：流动相
系统适用性溶液配制方法照实施例1进行，系统适用性溶液的图谱见图3，从图中可以看出，化合物L与杂质D出峰重合，杂质C由于极性较小未得以出峰，主峰拖尾，不适合有关物质的检测。
参考例2
仪器：Waters e2695高效液相色谱仪
色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：254nm
流速：1.0mL/min
柱温：30℃
进样量：20μL
流动相：0.1％磷酸溶液-甲醇(43:57)
溶剂：流动相
溶液配制方法及测定方法照实施例1进行，系统适用性溶液的图谱见图4，从图中可以看出，化合物L与杂质B出峰重合，杂质C由于极性较小未得以出峰，不适合有关物质的检测，需要优化色谱条件。
参考例3
仪器：Waters e2695高效液相色谱仪
色谱柱：Welch Ultimate AQ-C18(4.6mm×250mm，5μm)
检测波长：254nm
流速：1.0mL/min
柱温：35℃
进样量：20μL
流动相：称取磷酸二氢钾10.2g，溶于适量水中，加1ml磷酸，用水稀释至750ml，再加250ml四氢呋喃，混匀。每500ml中含0.72g十二烷基硫酸钠、0.5mlN,N-二甲基正辛胺，并用2mol/L氢氧化钠调节pH至4.0。
溶剂：流动相
溶液配制方法及测定方法照实施例3进行，系统适用性溶液的图谱见图5，从图中可以看出，杂质B和杂质E分离度＜1.5，杂质A和杂质D分离度＜1.5，杂质C由于极性较小未得以出峰，不适合有关物质的检测。
参考例4专利CN104211738B方法重现
仪器：Waters e2695高效液相色谱仪
色谱柱：Nova Pak C18(3.9mm×150mm，4μm)
检测波长：254nm
流速：1.0mL/min
柱温：35℃
进样量：20μL
流动相：流动相A为0.05mol/L磷酸二氢钠-四氢呋喃(80:20)(每1000ml中含十二烷基硫酸钠1.44g，磷酸1ml，以2mol/L氢氧化钠调节pH至4.0)，流动相B为0.05mol/L磷酸二氢钠-四氢呋喃(40:60)(每1000ml中含十二烷基硫酸钠1.44g，磷酸1ml，以2mol/L氢氧化钠调节pH至4.0)，梯度洗脱如下：
Figure BDA0002145197600000141
溶剂：初始比例流动相
溶液配制方法及测定方法照实施例3进行，系统适用性溶液的图谱见图6，从图中可以看出，杂质B和杂质E分离度＜1.5，杂质A和杂质D分离度＜1.5，杂质C峰宽较宽，灵敏度低，不适合有关物质的检测。

Claims (20)

1.一种注射用化合物L的有关物质的分析方法，其特征在于：所述方法是高效液相色谱法，该方法采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料的反相色谱柱，流动相A选自磷酸水溶液，流动相B选自甲醇和乙腈的混合溶液，其中化合物L为(7S,9S)-9-乙酰基-7,8,9,10-四氢-6,7,9,11-四羟-7-O-(2,3,6-三脱氧-3-氨基-α-L-来苏-己-吡喃糖)-5,12-骈四苯盐酸盐；有关物质选自杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E中的一种或两种以上混合物，
其中杂质A的结构式为
Figure FDA0003636841450000011
杂质B的结构式为
Figure FDA0003636841450000012
杂质C的结构式为
Figure FDA0003636841450000013
杂质D的结构式为
Figure FDA0003636841450000014
杂质E的结构式为
Figure FDA0003636841450000015
所述磷酸水溶液的浓度为0.05～0.5％；所述甲醇和乙腈的混合溶液，其中甲醇与乙腈的体积比为45～55：55～45；所述流动相A与流动相B按照下表梯度洗脱：
Figure FDA0003636841450000016
Figure FDA0003636841450000021
，
流动相的流速为0.5～2.0ml/min；色谱柱的柱温为20～50℃；进样器的温度为0～15℃。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述磷酸水溶液的浓度为0.05～0.2％。
3.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述磷酸水溶液的浓度为0.09～0.11％。
4.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述磷酸水溶液的浓度为0.1％。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，甲醇和乙腈的体积比为50：50。
6.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.8～1.2ml/min。
7.如权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述流动相的流速为0.9～1.1ml/min。
8.如权利要求6所述的分析方法，其特征在于，所述流动相的流速为1.0ml/min。
9.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，其规格为4.6mm×250mm，5μm。
10.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述分析方法在高效液相色谱仪上进行，采用紫外检测器、示差折光检测器或蒸发光散射检测器。
11.如权利要求10所述的分析方法，其特征在于，采用紫外吸收检测器。
12.如权利要求10所述的分析方法，其特征在于，采用紫外吸收检测器，且其检测波长为254nm。
13.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为30～40℃。
14.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温33～37℃。
15.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述色谱柱的柱温为35℃。
16.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述进样器的温度为2～8℃。
17.如权利要求16所述的分析方法，其特征在于，所述进样器的温度为2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃或8℃。
18.如权利要求17所述的分析方法，其特征在于，所述进样器的温度为4℃。
19.一种化合物L有关物质的分析方法，其特征在于，
所述分析方法是在高效液相色谱仪上进行的；
检测器是紫外吸收检测器，检测波长是254nm；
色谱柱是采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填料的反相色谱柱，柱温为35℃；
进样器温度为4℃；
按照下表梯度洗脱，其中流动相A为0.1％的磷酸水溶液，流动相B为体积比为50％：50％的甲醇和乙腈的混合溶液
Figure FDA0003636841450000031
流动相的流速为1.0ml/min；
分别注入化合物L的供试品溶液、对照溶液和系统适应性溶液；
其中系统适应性溶液包含化合物L和选自杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E中的一种或两种以上混合物；
通过主成分自身对照法计算化合物L、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E的含量；
其中化合物L为(7S,9S)-9-乙酰基-7,8,9,10-四氢-6,7,9,11-四羟-7-O-(2,3,6-三脱氧-3-氨基-α-L-来苏-己-吡喃糖)-5,12-骈四苯盐酸盐，
杂质A的结构式为
Figure FDA0003636841450000032
杂质B的结构式为
Figure FDA0003636841450000033
杂质C的结构式为
Figure FDA0003636841450000034
杂质D的结构式为
Figure FDA0003636841450000041
杂质E的结构式为
Figure FDA0003636841450000042
20.一种注射用化合物L有关物质的分析方法，其特征在于：
(1)化合物L定位溶液配制：取化合物L对照品，精密称定，用体积比为65:35的流动相A与流动相B的混合溶液溶解并稀释，定容，摇匀，即得，其中化合物L为(7S,9S)-9-乙酰基-7,8,9,10-四氢-6,7,9,11-四羟-7-O-(2,3,6-三脱氧-3-氨基-α-L-来苏-己-吡喃糖)-5,12-骈四苯盐酸盐；
(2)杂质A定位溶液配制：取杂质A对照品适量，精密称定，用体积比为65:35的流动相A与流动相B的混合溶液溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述杂质A，其结构式为：
Figure FDA0003636841450000043
(3)杂质B定位溶液配制：取杂质B对照品适量，精密称定，用体积比为65:35的流动相A与流动相B的混合溶液溶解并稀释，定容，摇匀，即得，
其中，所述杂质B，其结构式为：
Figure FDA0003636841450000044
(4)杂质C定位溶液配制：取杂质C对照品适量，精密称定，用体积比为65:35的流动相A与流动相B的混合溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得，
其中，所述杂质C，其结构式为：
Figure FDA0003636841450000045
(5)杂质D定位溶液配制：取杂质D对照品适量，精密称定，用体积比为65:35的流动相A与流动相B的混合溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得，
其中，所述杂质D，其结构式为：
Figure FDA0003636841450000051
(6)杂质E定位溶液配制：取杂质E对照品适量，精密称定，用体积比为65:35的流动相A与流动相B的混合溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得，
其中，所述杂质E，其结构式为：
Figure FDA0003636841450000052
(7)系统适用性溶液配制：取化合物L、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D和杂质E各适量，精密称定，用体积比为65:35的流动相A与流动相B的混合溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得；
(8)供试品溶液配制：取化合物L供试品适量，精密称定，用体积比为65:35的流动相A与流动相B的混合溶液溶解并稀释定容，摇匀，即得；
(9)对照溶液配制：精密量取供试品溶液适量，用体积比为65:35的流动相A与流动相B的混合溶液稀释M倍，作为对照溶液；
(10)液相条件：采用Welch Ultimate AQ-C18，规格为4.6mm×250mm，5μm的十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，柱温为35℃；检测器是紫外吸收检测器，检测波长是254nm；进样器温度为4℃；流动相A为0.1％的磷酸水溶液；流动相B为体积比为50％：50％的甲醇和乙腈的混合溶液，流动相流速为1.0ml/min，按下表梯度洗脱：
Figure FDA0003636841450000053
(11)样品测定：将化合物L的定位溶液、杂质A的定位溶液、杂质B的定位溶液、杂质C的定位溶液、杂质D的定位溶液、杂质E的定位溶液、系统适用性溶液﹑供试品溶液和对照溶液适量，分别注入液相色谱仪，记录各溶液的色谱图；
(12)含量计算：根据各色谱图，通过加校正因子或不加校正因子的主成分自身对照法计算样品中各杂质含量：
Figure FDA0003636841450000061
其中，At为供试品溶液色谱图中杂质A、杂质B、杂质C、杂质D或杂质E各自的峰面积；A为对照溶液中主峰的峰面积，即化合物L的峰面积；f为校正因子；M为稀释的倍数。
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