CN117147736B - 一种D-葡萄糖-δ-内酯有关物质的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物分析技术领域，提供了一种D‑葡萄糖‑δ‑内酯有关物质的检测方法，该方法专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、稳定性以及耐用性均良好，可有效同时检测D‑葡萄糖‑δ‑内酯中含有的多种杂质，以实现对恩格列净的质量控制。

Description

一种D-葡萄糖-δ-内酯有关物质的检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种高效分离并检测D-葡萄糖-δ-内酯中有关物质的高效液相色谱法。
背景技术
D-葡萄糖-δ-内酯（简称GDL）是一种重要的有机化合物，在食品、化妆品、医药等领域有广泛的应用。在食品领域可作为一种食品添加剂，主要为发酵剂、酸味剂、色调保持剂和蛋白质凝固剂。在化妆品领域可作为一种保湿剂，用于保持皮肤湿润，防止皮肤干燥和老化。近年来，GDL又被作为医药中间体广泛应用于钠-葡萄糖协同转运体-2（SGLT2）抑制剂的合成过程中，如卡格列净、达格列净及恩格列净。
恩格列净是一种选择性SGLT2抑制剂，用于治疗2型糖尿病，改善血糖控制；用于降低患2型糖尿病合并心血管疾病成人患者的心血管死亡风险。D-葡萄糖-δ-内酯为制备恩格列净原料药的关键起始物料或中间体（CAS号：90-80-2），结构式如下：
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在恩格列净生产工艺中，D-葡萄糖-δ-内酯可与D-葡萄糖酸（CAS号：526-95-4）相互转化，均可参与反应至终产品。D-葡萄糖-δ-内酯中含有的除D-葡萄糖酸外的其他杂质可能残留或衍生传递至终产品恩格列净原料药中，对制剂药品安全性产生风险，依据D-葡萄糖-δ-内酯的化学结构及制备工艺。对其可能含有的物质分析如下：
D-葡萄糖-δ-内酯分子极性强，因结构中缺乏生色官能团，无法用常规的紫外检测器。目前各国药典未收载其质量标准，国内外现有技术均为测定D-葡萄糖-δ-内酯含量，测定方法主要包括以下几种：
1、柱前衍生后再检测，如文献“气相色谱-质谱法测定食品中的葡萄糖酸-δ-内酯”，前处理繁琐，反应副产物较多；
2、采用HPLC-RID（示差折光检测器）法、HPLC-ELSD（蒸发光散射检测器）法，如文献“高效液相色谱法测定食品中的葡萄糖酸-δ-内酯”、“高效液相色谱分析糖、糖酸和葡萄糖酸-δ-内酯”，灵敏度较差，平衡时间、运行时间长；
3、采用HPLC-UV法，如CN113156002A公开了一种葡萄糖酸钙中5种有关物质的检测方法，研究杂质中包含D-葡萄糖-δ-内酯，但并未研究D-葡萄糖-δ-内酯中含有的杂质，且在210nm检测波长下使用烷基磺酸钠作为流动相，基线噪音大，杂峰多。
4、少数文献使用HPLC-CAD（电喷雾检测器）法检测样品中微量的D-葡萄糖-δ-内酯，如文献“高效液相色谱法测定卡格列净中葡萄糖酸-δ-内酯的含量”，定量方式多为外标法，线性范围窄，无法满足杂质定量需求；用甲酸铵溶液或三乙胺溶液为流动相，基线噪音大，杂峰多，方法灵敏度不佳。
综上所述，D-葡萄糖-δ-内酯有关物质的检测，现有技术在实践中存在诸多缺陷，不足以满足D-葡萄糖-δ-内酯的质量控制需求。因此，亟需建立出一种D-葡萄糖-δ-内酯有关物质的检测方法，可有效检测D-葡萄糖-δ-内酯中含有的杂质，以实现对恩格列净的质量控制。
发明内容
本发明解决了现有技术的不足，提供了一种D-葡萄糖-δ-内酯（下文可称为化合物（VI））有关物质的检测方法，可有效检测D-葡萄糖-δ-内酯中含有的杂质，该方法专属性、线性、灵敏度、准确度、精密度、稳定性以及耐用性均良好。
本发明提供了一种D-葡萄糖-δ-内酯有关物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）供试品溶液：取本品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成供试品溶液；
（2）杂质贮备液：分别取杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8各适量，分别加溶剂溶解并稀释制成杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8对应的贮备液；
（3）杂质定位溶液：取杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8贮备液适量，用溶剂分别稀释制成各杂质定位溶液；
（4）分离度溶液：取D-葡萄糖-δ-内酯及杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8贮备液各适量，加溶剂溶解并稀释制成分离度溶液；
（5）取分离度溶液、杂质定位溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
其中，所述溶剂为乙腈-水（70∶30），冰浴保存；
步骤（5）中，采用高效液相色谱仪进行分析，色谱条件具体如下：
检测器：电喷雾式检测器，采集频率为5赫兹，过滤常数为3.6秒，幂律函数1.0，雾化器温度为35℃；
色谱柱：以两性离子键合硅胶为填充剂，优选Agilent Poroshell HILIC-Z，4.6mm×100mm，2.7μm，或效能相当的色谱柱；
流动相：流动相A：三氟醋酸溶液，浓度为0.045%～0.055%，优选0.05%；流动相B：乙腈，梯度洗脱；
流速：1.0ml/min；
柱温：5~15℃，优选10℃；
进样体积：10µl；
所述梯度洗脱的条件为：
，
优选梯度洗脱条件为：
。
本发明进一步提供了一种D-葡萄糖-δ-内酯有关物质的检测方法，包括以下步骤：
（1）供试品溶液：取本品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含5mg的溶液；
（2）杂质贮备液：分别取杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8各适量，分别加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8对应的贮备液；
（3）杂质定位溶液：取杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8贮备液适量，用溶剂分别稀释制成每1ml中含杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8 50μg的溶液，作为杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8的定位溶液；
（4）分离度溶液：取D-葡萄糖-δ-内酯及杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8贮备液适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含D-葡萄糖-δ-内酯约5mg，Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8均约50μg的溶液，作为分离度溶液；
（5）取分离度溶液、杂质定位溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
其中，所述溶剂为乙腈-水（70∶30），冰浴保存；
步骤（5）中，采用高效液相色谱仪进行分析，色谱条件具体如下：
检测器：电喷雾式检测器，采集频率为5赫兹，过滤常数为3.6秒，幂律函数1.0，雾化器温度为35℃；
色谱柱：以两性离子键合硅胶为填充剂的色谱柱，优选Agilent PoroshellHILIC-Z，4.6mm×100mm，2.7μm，或与其效能相当的色谱柱；
流动相：以为流动相A：三氟醋酸溶液，浓度为0.045%～0.055%，优选0.05%；流动相B：乙腈；梯度洗脱；
流速：1.0ml/min；
柱温：5~15℃，优选10℃；
进样体积：10µl；
所述梯度洗脱的条件为：
，
优选梯度洗脱条件为：
。
进一步的，本发明提供了一种D-葡萄糖-δ-内酯有关物质的检测方法，所述方法在恩格列净质量控制中的用途。
本发明的有益技术效果为：
（1）本发明采用电喷雾式检测器，以两性离子键合硅胶为填充剂的色谱柱，优选Agilent Poroshell HILIC-Z，4.6mm×100mm，2.7μm，可直接检测样品，无需衍生或添加离子对试剂，避免了基线干扰，灵敏度高，实现了D-葡萄糖-δ-内酯及其杂质良好的保留。
（2）以三氟醋酸溶液、乙腈混合溶液作为流动相进行梯度洗脱，通过条件筛选呈现出良好的峰形，实现了D-葡萄糖-δ-内酯与相关杂质的分离，且基线噪音小，杂峰较少，方法灵敏度高，定量限可达0.12μg/ml，约为供试品溶液浓度的0.025%；运行时间短，不需长时间平衡。
（3）溶液配制使用冰浴保存的溶剂，可有效延缓低浓度下D-葡萄糖-δ-内酯转化为D-葡萄糖酸，避免峰转化对峰面积的影响，保证方法重现性及标准曲线良好的线性。
（4）本发明所用杂质定量方式为标准曲线法，线性范围宽，可满足杂质含量为定量限至2.0%范围内的定量需求，方法准确度高。
附图说明
图1为实施例1条件（2）中的D-葡萄糖酸溶液色谱图（柱温50℃）。
图2为实施例1条件（2）中的D-葡萄糖酸溶液色谱图（柱温10℃）。
图3为实施例1条件（3）中的D-葡萄糖酸溶液色谱图。
图4为实施例1条件（3）中的供试品溶液色谱图。
图5为实施例1条件（3）中的分离度溶液色谱图。
图6为实施例2中的分离度溶液色谱图。
图7为实施例3中的系统适用性试验色谱图。
图8为实施例4中D-葡萄糖-δ-内酯线性图。
图9为实施例4中杂质Ⅵ-6线性图。
图10为实施例5中D-葡萄糖-δ-内酯定量限溶液色谱图。
图11为实施例5中杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-8、杂质Ⅵ-4及杂质Ⅵ-7定量限溶液色谱图。
图12为实施例5中D-葡萄糖-δ-内酯检测限溶液色谱图。
图13为实施例5中杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-8、杂质Ⅵ-4及杂质Ⅵ-7检测限溶液色谱图。
图14为实施例6中加样回收率试验重叠图。
图15为实施例7中精密度试验重叠图。
图16为实施例8中稳定性试验重叠图。
图17为实施例9中耐用性试验不同色谱柱系统适用性溶液重叠图。
图18为实施例9中耐用性试验不同色谱柱供试品溶液重叠图。
图19为实施例9中耐用性试验不同梯度系统适用性溶液重叠图。
图20为实施例9中耐用性试验不同梯度供试品溶液重叠图。
图21为实施例9中耐用性试验不同柱温系统适用性溶液重叠图。
图22为实施例9中耐用性试验不同柱温供试品溶液重叠图。
图23为实施例9中耐用性试验不同三氟醋酸浓度系统适用性溶液重叠图。
图24为实施例9中耐用性试验不同三氟醋酸浓度供试品溶液重叠图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的具体实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
仪器与试剂
仪器：赛默飞高效液相色谱仪，CAD检测器（采集频率为5赫兹，过滤常数为3.6秒，幂律函数1.0，雾化器温度为35℃）；流速：1.0ml/min；进样体积：10μl。
试剂：
溶剂：乙腈-水（70∶30），冰浴保存；
供试品溶液：临用新制。取本品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含5mg的溶液；
D-葡萄糖酸溶液：取D-葡萄糖酸约10mg，置10ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀；
杂质贮备液：分别取杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8各适量，分别加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为各杂质对应的贮备液；
分离度溶液：取D-葡萄糖-δ-内酯及上述杂质贮备液各适量，加溶剂溶解并稀释制成每1ml中含D-葡萄糖-δ-内酯约5mg，各杂质均约50μg的溶液，作为分离度溶液。
系统适用性溶液：临用新制。取本品约50mg，置10ml量瓶中，加0.01mol/L氢氧化钠溶液1ml，室温放置5分钟，加0.01mol/L盐酸溶液1ml，用乙腈稀释至刻度，摇匀；
系列标准曲线用溶液：取本品适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，精密量取适量，用冰浴保存的乙腈分别定量稀释制成每1ml中各约含5μg（临用新制）、25μg、50μg、100μg、150μg的溶液。
实施例1 色谱条件选择
（1）色谱柱选择
D-葡萄糖-δ-内酯及目标杂质含有糖类结构，目前对于糖类化合物的检测多使用氨基柱，存在柱流失严重、耐用性差的特点。另外，因D-葡萄糖-δ-内酯及目标杂质极性均较大，水溶性良好，故耐纯水相且保留能力强的C18-AQ色谱柱及亲水作用色谱的HILIC色谱柱有一定优势。
在本发明研究过程中，考察了CAPCELL PAK NH2 UG80,4.6mm×250mm,5μm色谱柱，SHIMADZU Shim-pack GIST C18-AQ，4.6mm×250mm，5μm色谱柱，Agilent PoroshellHILIC-Z，4.6mm×100mm，2.7μm色谱柱，最终确定Agilent Poroshell HILIC-Z，4.6mm×100mm，2.7μm色谱柱在保留、分离及重现性方面优势明显，且流动相中有机相比例高，有助于样品在检测器中的雾化，峰响应更好。
（2）柱温选择
柱温筛选：10℃、50℃；
按以下色谱条件为基准条件进行筛选：
仪器：高效液相色谱仪，CAD检测器；
色谱柱：Agilent Poroshell HILIC-Z，4.6mm×100mm，2.7μm；
流动相A：水；
流动相B：0.2%（ml/ml）甲酸乙腈溶液；
流速：1.0ml/min；进样体积：10μl；
梯度洗脱程序：
。
取D-葡萄糖酸溶液[每1ml约含D-葡萄糖酸80μg] 10µl，分别于不同柱温条件下，注入液相色谱仪，记录色谱图。
结果：色谱图中峰1为D-葡萄糖酸，其余色谱峰为D-葡萄糖酸降解产物峰。对比两柱温下D-葡萄糖酸峰形，柱温50℃条件下，D-葡萄糖酸峰保留时间5.963分钟，峰后有鼓包，理论板数10844，峰形差，见图1；柱温10℃条件下，D-葡萄糖酸峰保留时间6.767分钟，鼓包明显减小，理论板数37305，峰形改善，见图2，故后续采用10℃柱温，调整流动相继续优化峰形。
（3）流动相选择
i. 调整流动相A为水，流动相B为0.2%（ml/ml）三氟醋酸乙腈溶液
精密量取供试品溶液与D-葡萄糖酸溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
结果：色谱图中峰1为D-葡萄糖酸，其余色谱峰为D-葡萄糖酸降解产物峰。D-葡萄糖酸溶液中D-葡萄糖酸峰保留时间6.072分钟，峰高219.38pA，峰面积23.033 pA *min，拖尾因子0.98，峰形良好，流动相采用三氟醋酸可有效改善D-葡萄糖酸峰形；供试品溶液中D-葡萄糖-δ-内酯保留时间3.882分钟，D-葡萄糖酸峰保留时间6.056分钟，两峰之间有平台，为改善基线，调整流动相，结果见图3、4。试验表明三氟醋酸浓度越大，流动相酸性越强平台越明显，需降低三氟醋酸浓度以改善基线。
ii. 调整流动相A为0.05%（ml/ml）三氟醋酸溶液，流动相B为乙腈，按下表进行梯度洗脱：
。
精密量取分离度溶液10µl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
结果：D-葡萄糖-δ-内酯（化合物（VI））峰保留时间为4.086分钟，与最近相邻杂质间分离度为8.30，D-葡萄糖酸峰保留时间6.952分钟，两峰之间基线平缓，色谱图中6.692分钟峰为杂质引入，其他各杂质间最小分离度为2.05，分离良好，见图5。
（4）溶剂选择
根据本品性质及供试品溶液稳定性试验结果，溶剂体系中含有水时D-葡萄糖-δ-内酯易转化为杂质Ⅵ-6与D-葡萄糖酸，且D-葡萄糖-δ-内酯于纯乙腈中无法完全溶解，故供试品溶液临用新制，配制对照溶液1、2，考察稀释剂对溶液稳定性的影响。
对照溶液1：精密量取供试品溶液适量，用溶剂（冰浴保存）定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液。
对照溶液2：精密量取供试品溶液适量，用冰浴保存的乙腈定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液。
因常规情况下低浓度转化速率更快，故考察供试品溶液放置不同时间后配制对照溶液的峰面积变化情况。
对照溶液3～5：分别于供试品溶液配制后0、0.5、1小时时，精密量取供试品溶液适量，用冰浴保存的乙腈定量稀释制成每1ml中约含5μg的溶液。
取对照溶液1、2，于进样器（10℃）内放置，分别于0、0.5、1小时，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算主峰面积的变化率；取对照溶液3～5各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算主峰面积的变化率。结果表明：由对照溶液1、2考察结果可知，采用冰浴保存的乙腈配制的溶液稳定性明显优于溶剂，说明乙腈做稀释剂能延缓D-葡萄糖-δ-内酯转化，故规定冰浴保存的乙腈作为标准曲线溶液稀释剂；由对照溶液3～5与对照溶液2对比结果可知，供试品溶液浓度大转化速率相对更慢，放置1小时后配制对照溶液，峰面积变化率明显低于对照溶液放置1小时，见表1。
综上，将采用乙腈作为标准曲线溶液稀释剂，且标准曲线溶液及供试品溶液稀释剂规定为冰浴保存。
表1 D-葡萄糖-δ-内酯有关物质检查对照溶液的稳定性试验结果
实施例2 分离度试验
各杂质定位溶液：分别取杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8各适量，分别加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含1mg的溶液，作为各杂质对应的贮备液；取各杂质贮备液适量，用溶剂分别稀释制成每1ml中含各杂质50μg的溶液，作为各杂质定位溶液。
取分离度溶液及定位溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果：主峰与相邻杂质及各杂质间分离度均大于1.5，具体结果见表2、图6。
表2 分离度试验结果
实施例3 系统适用性试验
精密量取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见图7，结果表明：系列标准曲线用溶液色谱图中，以D-葡萄糖-δ-内酯（化合物（VI））峰面积与相应浓度绘制一元二次标准曲线（强制通过原点）并计算回归方程，相关系数（r）为0.9994，符合常规要求。
实施例4 线性试验
以D-葡萄糖-δ-内酯（化合物（Ⅵ））和最关键的杂质Ⅵ-6为例，开展线性试验。
临用新制。取D-葡萄糖-δ-内酯及杂质Ⅵ-6对照品各适量，精密称定，分别加溶剂溶解并稀释制成每1ml中约含0.5mg的溶液，作为对应的贮备液。精密量取贮备液适量，D-葡萄糖-δ-内酯用冰浴保存的乙腈、杂质Ⅵ-6用溶剂定量稀释制成分别约含50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml的溶液。精密量取上述溶液及定量限溶液各10ml，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积对浓度作曲线，按最小二乘法计算一元二次回归方程及相关系数。结果见表3、图8～9。结果表明：D-葡萄糖-δ-内酯在浓度为1.227～201.04mg/ml的范围内，杂质Ⅵ-6在浓度为1.251～182.04mg/ml的范围内，峰面积对浓度呈良好的相关性。
表3 D-葡萄糖-δ-内酯有关物质检查线性试验结果表
实施例5 定量限、检测限试验
取各化合物适量，加溶剂溶解并稀释制成一定浓度的溶液，D-葡萄糖-δ-内酯（化合物（VI））用冰浴保存的乙腈逐级稀释至不同浓度，其他杂质分别用溶剂逐级稀释至不同浓度，分别精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，至测得的主峰响应值不低于噪音信号的10倍高和3倍高，即为D-葡萄糖-δ-内酯（化合物（VI））及各杂质的定量限和检测限。结果见表4～5、图10～13。
表4 D-葡萄糖-δ-内酯有关物质检查定量限结果表
表5 D-葡萄糖-δ-内酯有关物质检查检测限结果表
实施例6 回收率试验
以最关键的杂质Ⅵ-6为例，开展回收率试验。
回收率空白溶液：临用新制。取D-葡萄糖-δ-内酯约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为回收率空白溶液。
杂质Ⅵ-6贮备液：临用新制。精密称取杂质Ⅵ-6对照品约12.5mg，置25ml量瓶中，加溶剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质贮备液。
回收率-定量限溶液：临用新制。取D-葡萄糖-δ-内酯约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加适量溶剂使溶解，加入杂质贮备液25μl，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为回收率-定量限溶液。平行制备3份。
回收率溶液：临用新制。取D-葡萄糖-δ-内酯约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加适量溶剂使溶解，分别加入杂质贮备液2ml、3ml，用溶剂稀释至刻度，摇匀，分别作为回收率-2.0%溶液、回收率-3.0%溶液，分别平行制备3份。
精密量取回收率溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。扣除回收率空白溶液本底值后，根据标准曲线的回归方程计算杂质Ⅵ-6的检出量，计算回收率，并计算结果的相对标准偏差。结果如表6、图14所示，D-葡萄糖-δ-内酯有关物质检查，在定量限、供试品溶液浓度的2.0%、3.0%的三个浓度下，杂质Ⅵ-6的加样回收率试验结果均良好。
表6 D-葡萄糖-δ-内酯有关物质检查加样回收率试验结果
实施例7 精密度试验
临用新制。称取D-葡萄糖-δ-内酯约50mg，置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。平行配制6份供试品溶液。精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。扣除杂质Ⅵ-6峰（相对保留时间约0.6）之前的色谱峰，D-葡萄糖酸不按杂质计，根据标准曲线的回归方程，计算并比较6次杂质Ⅵ-6、其他最大单个杂质及总杂质的测定结果（D-葡萄糖酸不按杂质计）。结果表明：杂质Ⅵ-6检出量基本一致（在0.09%～0.10%之间），RSD为5.77%；其他最大单个杂质检出量基本一致（在0.04%～0.05%之间），RSD为9.80%；总杂质检出量基本一致（在0.17%～0.18%之间），RSD为2.93%。D-葡萄糖-δ-内酯（化合物（VI））有关物质检查精密度试验结果良好，结果见表7、图15。
表7 D-葡萄糖-δ-内酯有关物质检查精密度试验结果表
实施例8 稳定性试验
取供试品溶液，于室温自然光下放置，分别于0、2小时，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，与0小时比较，D-葡萄糖酸不按杂质计，计算杂质Ⅵ-6、其他最大单个杂质及总杂质的峰面积的变化率。结果表明：杂质Ⅵ-6峰面积的变化率为45.52%，其他最大单个杂质峰面积的变化率为1.04%，总杂质峰面积的变化率为23.73%，无新增杂质产生，供试品溶液在2小时内不稳定，需临用新制。结果见表8、图16。
表8 D-葡萄糖-δ-内酯有关物质检查供试品溶液的稳定性试验结果表
实施例9 耐用性试验
分别采用不同色谱柱、不同梯度、不同柱温、不同三氟醋酸浓度来测定本品的有关物质，考察方法的耐用程度。
在既定色谱条件基础上，分别采用两根同品牌不同编号的色谱柱（HF7-HILIC-002、HF7-HILIC-001），不同梯度、不同柱温，不同三氟醋酸浓度来测定本品的有关物质，比较测定结果。结果见表10、图17～24所示，采用两根同品牌不同编号的色谱柱，梯度在梯度Ⅰ～梯度Ⅲ范围内，柱温在5℃～15℃范围内，流动相A的三氟醋酸浓度在0.045%～0.055%范围内，主峰拖尾因子最大值为1.44，标准曲线回归方程的相关系数（r）最小值为0.9981，符合要求；扣除杂质Ⅵ-6峰（相对保留时间约0.6）之前的色谱峰，D-葡萄糖酸不按杂质计，根据标准曲线的回归方程分别计算杂质Ⅵ-6、其他最大单个杂质和总杂质含量，杂质谱基本相同，测定结果基本一致，方法耐用性良好。
表9 梯度耐用性表格
表10 D-葡萄糖-δ-内酯有关物质检查方法耐用性结果
注：*为同一张色谱图。

Claims (9)

1.一种D-葡萄糖-δ-内酯杂质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）供试品溶液：取D-葡萄糖-δ-内酯适量，精密称定，加溶剂溶解并定量稀释制成供试品溶液；
（2）杂质贮备液：分别取杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8各适量，分别加溶剂溶解并稀释制成杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8对应的贮备液；所述的杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8如下式所示：
；
（3）杂质定位溶液：取杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8贮备液适量，用溶剂分别稀释制成各杂质定位溶液；
（4）分离度溶液：取D-葡萄糖-δ-内酯及杂质Ⅵ-6、杂质Ⅵ-4、杂质Ⅵ-7、杂质Ⅵ-8贮备液各适量，加溶剂溶解并稀释制成分离度溶液；
（5）取分离度溶液、杂质定位溶液、供试品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；
其中，步骤（5）中，所述色谱仪的色谱条件包括：色谱柱：以两性离子键合硅胶为填充剂的色谱柱；流动相：流动相A：三氟醋酸；流动相B：乙腈，梯度洗脱；梯度洗脱条件如下：
。
2.根据权利要求1所述的D-葡萄糖-δ-内酯杂质的检测方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：
检测器：电喷雾式检测器；
流速：1.0ml/min；
柱温：5~15℃；
进样体积：10µl。
3.根据权利要求1所述的D-葡萄糖-δ-内酯杂质的检测方法，其特征在于，所述溶剂为乙腈：水=70∶30，冰浴保存。
4.根据权利要求1所述的D-葡萄糖-δ-内酯杂质的检测方法，其特征在于，所述色谱柱为Agilent Poroshell HILIC-Z，4.6mm×100mm，2.7μm。
5.根据权利要求1所述的D-葡萄糖-δ-内酯杂质的检测方法，其特征在于，所述流动相A三氟醋酸溶液的浓度为0.045%～0.055%。
6.根据权利要求5所述的D-葡萄糖-δ-内酯杂质的检测方法，其特征在于，所述流动相A三氟醋酸溶液的浓度为0.05%。
7.根据权利要求1所述的D-葡萄糖-δ-内酯杂质的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱条件为：
。
8.权利要求2所述的D-葡萄糖-δ-内酯杂质的检测方法，其特征在于，所述柱温为10℃。
9.权利要求1-8任一权利要求所述的D-葡萄糖-δ-内酯杂质的检测方法，其特征在于，所述的方法在恩格列净质量控制中的用途。
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