CN114755344B - 测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定鼠麹草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法。该方法包括下述步骤：采用一测多评法，通过超高效液相色谱检测供试品溶液即可；其中，供试品溶液为含有鼠麹草提取物的溶液；超高效液相色谱检测中，采用梯度洗脱方式：流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈。本发明提供的检测方法可以实现多指标成分含量测定，合理性强，具有更加简便且重复性好、稳定性高、耐用性高和检测可靠的特点，大大节省了资源、降低了检测成本。

Description

测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法
技术领域
本发明涉及一种测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法。
背景技术
在中药多指标质量评价中，多采用指纹图谱技术来体现中药的整体性，但难以从量化的角度明确地体现中药的整体性。研究表明，鼠麴草提取物中的二咖啡酰奎宁酸对于体外的XO活性表现出强有力的抑制作用，对于体内也具有显著的抗高尿酸血症及抗痛风性关节炎活性。由于二咖啡酰奎宁酸类化合物在鼠麴草提取物中种类多且结构差异小，在常规色谱中难以分离并获取，且市面上常常缺货且价格昂贵。然而，目前鼠麴草提取物中此类有效成分含量测定使用的是传统多指标质量控制，即外标法测定，其需要大量的对照品。因此，实现鼠麴草中二咖啡酰奎宁酸类化合物的定量检测难度大、成本高。
一测多评法是通过测定中药中一种代表性成分的含量，依据校对校正因子推算该中药中多种待测成分含量，并控制计算值与实测值复合定量方法学要求的一种多指标同步质量控制方法。一测多评法常用于同类型化学成分或紫外吸收相近的不同类型化学成分的定量分析，尤其在药典标准中，多用于同类型化学成分的定量检测。CN109991328A公开了以绿原酸（单咖啡酰奎宁酸类）为内参，建立咖啡酸、异毛蕊花糖苷（咖啡酸糖酯类）和异泽兰黄素（黄酮类）的相对校正因子。然而，其内标物质与被测成分既不是同类型化合物也不具有相近的紫外吸收，合理性较差。
目前，还没有报道如何通过一测多评法测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸的含量。因此，如何提供一种测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其合理性强，可以更加简便且重复性好、稳定性高、耐用性高和检测可靠，还能够节省资源、降低成本的研究是很有必要的。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是解决现有技术中测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸的含量时，操作复杂且成本高的缺陷，从而提供了一种测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法。本发明提供的检测方法可以实现多指标成分含量测定，合理性强，具有更加简便且重复性好、稳定性高、耐用性高和检测可靠的特点，大大节省了资源、降低了检测成本。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其包括下述步骤：采用一测多评法，通过超高效液相色谱检测供试品溶液即可；
其中，所述供试品溶液为含有鼠麴草提取物的溶液；
所述超高效液相色谱检测中，采用梯度洗脱方式：流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈；
所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
上述百分比为流动相A或流动相B的体积与“流动相A和流动相B”总体积之比。
本发明中，所述鼠麴草提取物的制备方法可为本领域常规，优选地，参照CN201610108995.2的实施例4，将“水饱和正丁醇相”替换为“将水饱和正丁醇相与乙酸乙酯相合并”。
本发明中，所述二咖啡酰奎宁酸的种类可为本领域常规，优选为1,3-二咖啡酰奎宁酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸中的一种或多种。
本发明中，所述供试品溶液的制备方法可为本领域常规，优选地，将所述鼠麴草提取物溶解于溶剂中制得。
其中，所述溶剂可为本领域常规能够溶解鼠麴草提取物的溶剂，例如醇类溶剂。所述醇类溶剂优选地为甲醇。
其中，所述溶解后还可包括过滤的操作。
所述过滤的滤膜孔径可为0.22~0.45 μm，例如0.45 μm。所述过滤可以除去不溶于甲醇的杂质，避免堵塞色谱柱及检测仪器。
本发明中，所述供试品溶液的浓度可为0.001~0.01g/mL，例如0.003 g/mL。
本发明中，所述一测多评法可通过下述步骤：
（1）通过所述超高效液相色谱检测对照品溶液，计算得到相对校正因子；
（2）通过所述超高效液相色谱检测所述供试品溶液，根据标准曲线或外标法公式、以及所述相对校正因子计算得到所述二咖啡酰奎宁酸的含量。
步骤（1）中，所述对照品溶液中的对照品可为1,3-二咖啡酰奎宁酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸中的一种或多种。
步骤（1）中，所述对照品溶液可通过本领域常规方法制得，例如可以先配置一特定浓度的标准品溶液，再通过稀释获得特定浓度的对照品溶液。
其中，稀释倍数优选为0、2、4、8、16和32倍。
其中，所述标准品溶液的制备方法可为本领域常规，优选地，将二咖啡酰奎宁酸溶解于溶剂中制得。
所述溶剂可为本领域常规能够溶解鼠麴草提取物的溶剂，例如醇类溶剂。所述醇类溶剂优选地为甲醇。
其中，所述标准品溶液的浓度可为0.025~1.4 mg/mL。
当所述对照品为1,3-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度可为0.025~0.25mg/mL，例如0.0767 mg/mL。
当所述对照品为1,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度可为0.14~1.4mg/mL，例如0.4136 mg/mL。
当所述对照品为3,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度可为0.13~1.3mg/mL，例如0.3977 mg/mL。
当所述对照品为4,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度可为0.09~0.9mg/mL，例如0.2772 mg/mL。
步骤（1）中，所述相对校正因子可通过下述步骤制得：
S1：取一种对照品溶液作为内参对照品溶液，其它对照品溶液为待测对照品溶液；
S2：将所述内参对照品溶液作为内标物，分别将所述待测对照品溶液进样，进行所述超高效液相色谱检测；
S3：根据测得的峰面积和相应的对照品溶液的浓度，按照相对校正因子计算公式fsi=(As/Cs)/(Ai/Ci)获得相对校正因子；其中，As为内参对照品的峰面积，Cs为内参对照品溶液的浓度，Ai为待测对照品的峰面积，Ci为待测对照品溶液的浓度。
S3中，当1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液作为内参对照品溶液时，1,5-二咖啡酰奎宁酸的相对校正因子可为2.327。
S3中，当1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液作为内参对照品溶液时，3,5-二咖啡酰奎宁酸的相对校正因子可为1.757。
S3中，当1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液作为内参对照品溶液时，4,5-二咖啡酰奎宁酸的相对校正因子可为2.129。
步骤（2）中，所述标准曲线可通过下述步骤制得：将所述对照品溶液进样，进行所述超高效液相色谱检测，根据测得的峰面积和相应的所述对照品溶液的浓度，得到回归方程，获得标准曲线。所述标准曲线中，优选以所述峰面积为纵坐标，所述对照品溶液的浓度为横坐标。
当所述对照品为1,3-二咖啡酰奎宁酸时，所述回归方程优选为y=135.590x-0.0250，其中，线性范围为2.4~75.6 µg/mL，R2=1，x为1,3-二咖啡酰奎宁酸溶液的浓度（mg/mL），y为相应的峰面积。
当所述对照品为1,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述回归方程优选为y=57.717x-0.0807，其中，线性范围为12.3~392 µg/mL，R2=0.9999，x为1,5-二咖啡酰奎宁酸溶液的浓度（mg/mL），y为相应的峰面积。
当所述对照品为3,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述回归方程优选为y=76.505x-0.0960，其中，线性范围为11.9~382 µg/mL，R2=0.9999，x为3,5-二咖啡酰奎宁酸溶液的浓度（mg/mL），y为相应的峰面积。
当所述对照品为4,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述回归方程优选为y=64.054x-0.0827，其中，线性范围为8.8~282.9 µg/mL，R2=0.9999，x为4,5-二咖啡酰奎宁酸溶液的浓度（mg/mL），y为相应的峰面积。
步骤（2）中，所述外标法公式为：cx=cr*Ax/Ar，cx为供试品溶液中二咖啡酰奎宁酸的浓度；cr为标准品溶液中二咖啡酰奎宁酸的浓度；Ax为供试品中二咖啡酰奎宁酸的峰面积；Ar为标准品中二咖啡酰奎宁酸的峰面积。
步骤（2）中，优选地，根据所述标准曲线和所述相对校正因子计算得到所述二咖啡酰奎宁酸的含量。
本发明中，优选地，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
更优选地，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
。
本发明中，所述超高效液相色谱检测中，色谱柱可为Waters Acquity UPLC HSST3 column，其规格为2.1 mm × 150 mm, 1.8 µm。若使用其他类型的色谱柱会使得1,5-二咖啡酰奎宁酸和3,5-二咖啡酰奎宁酸的分离度小于1.5，不符合标准。
本发明中，所述超高效液相色谱检测中，所述甲酸水溶液的浓度可为0.05~0.2%，例如0.1%，百分比为甲酸占水的体积百分比。采用该浓度的甲酸水溶液可以防止色谱峰拖尾，优化色谱峰。
本发明中，所述超高效液相色谱检测中，流速可为0.2~0.4 mL/min，例如0.3 mL/min。
本发明中，所述超高效液相色谱检测中，柱温可为40~50℃，例如40℃。所述柱温若过低，会造成出峰时间延长且分离效果较差；若过高，会导致分离度减小，分离效果变差。
本发明中，所述超高效液相色谱检测中，检测波长可为本领域常规，优选为280-360 nm，例如280 nm。
本发明中，所述超高效液相色谱检测中，进样量可为1~5 μL，例如1 μL。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各优选实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
（1）本发明首次提出建立一测多评法用于测定二咖啡酰奎宁酸成分含量，采用的测定方法能够仅通过一种对照品即可实现多指标成分含量及大类成分含量的测定，更全面、简便地对鼠麴草提取物进行质量控制，同时避免购买价格高昂对照品，大大节省了资源，既提高了工作效率又降低了成本。
（2）本发明建立的含量测定方法符合方法学验证的要求，建立了鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸同类成分的一测多评法，其合理性强，重复性好，稳定性高、耐用性高，实验结果对提高质量标准控制、建立科学而合理的质量评价方法以及提高临床用药有效性和安全性具有重要意义。
附图说明
图1为实施例1中2.3.1项下，标准品溶液稀释2倍制得的对照品溶液进样的色谱图。
图2为实施例1中2.3.2项下，供试品溶液进样的色谱图。
图3为对比例1中供试品溶液进样的色谱图。
其中，1：1,3-二咖啡酰奎宁酸；2：1,5-二咖啡酰奎宁酸；3：3,5-二咖啡酰奎宁酸；4：4,5-二咖啡酰奎宁酸。
具体实施方法
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
下述实施例和对比例中，涉及的鼠麴草提取物的制备方法参照CN201610108995.2的实施例4，将“水饱和正丁醇相”替换为“将水饱和正丁醇相与乙酸乙酯相合并”。
下述实施例中，外标法通过下述公式计算得到咖啡酸含量：cx=cr*Ax/Ar，其中，cx为供试品溶液中二咖啡酰奎宁酸的浓度；cr为标准品溶液中二咖啡酰奎宁酸的浓度；Ax为供试品中二咖啡酰奎宁酸的峰面积；Ar为标准品中二咖啡酰奎宁酸的峰面积。
实施例1
1 仪器与试药
1.1 Thermo Vanquish超高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司）；色谱柱Waters Acquity UPLC HSS T3 column (2.1 mm × 150 mm, 1.8 μm)；XS-205Du电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）；KQ-500E超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。
1.2 鼠麴草于2020年4月采于中国浙江省衢州市后溪村（北纬28.796度，东经118.786度）；1,3-二咖啡酰奎宁酸（批号111717-201402，含量以94.5%计）、3,5-二咖啡先奎宁酸（批号111782-201807，含量以94.3%计）购自中国食品药品检定研究所；1,5-二咖啡酰奎宁酸（批号ST00910120，含量以98%计）、4,5-二咖啡酰奎宁酸（批号RS06601020，含量以91.3%计）购自上海诗丹德生物技术有限公司。色谱级乙腈、质谱级甲酸（美国Fisher公司）。其他试剂均为分析纯。
2 实验方法与结果
2.1 超高效液相色谱条件
色谱柱为T3柱；以0.1%甲酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B组成的梯度洗脱液进行梯度洗脱；流速为0.3 mL/min；柱温为40℃；检测波长为280 nm；进样量为1 μL；梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱流动相比例与时间关系
由表1可知，所述的梯度洗脱的洗脱程序为：从初始状态到9 min的时间段内，流动相A的体积百分比为从92%随时间线性降低至87%，流动相B的体积百分比为从8%随时间线性升高为13%；在9 min到9.01 min的时间段内，流动相A的体积百分比瞬间改变为78%，流动相B的体积百分比瞬间改变为22%；在9.01 min到33 min的时间段内，流动相A的体积百分比随时间线性降低到77%，流动相B的体积百分比随时间线性升高到23%；在33 min到35 min的时间段内，流动相A的体积百分比随时间线性降低到55%，流动相B的体积百分比随时间线性升高到45%；在35 min到37 min的时间段内，流动相A的体积百分比随时间线性降低到25%，流动相B的体积百分比随时间线性升高到75%；在37 min到37.01 min的时间段内，流动相A的体积百分比瞬间改变为92%，流动相B的体积百分比瞬间改变为8%；在37.01 min到40 min的时间段内，流动相A的体积百分比维持在92%，流动相B的体积百分比维持在8%。所述流动相A和所述流动相B的体积百分比以所述流动相总体积为基准。
2.2 溶液配制
2.2.1 标准品溶液配制
精密称量1,3-二咖啡酰奎宁酸2.03 mg，1,5-二咖啡酰奎宁酸10.55 mg，3,5-二咖啡酰奎宁酸10.41 mg，4,5-二咖啡酰奎宁酸7.35 mg，分别加入25 mL容量瓶中，加适量甲醇超声溶解后定容至刻度，摇匀即得标准品溶液。四种标准品溶液的浓度依次为0.0767 mg/mL、0.4136 mg/mL、0.3977 mg/mL、0.2772 mg/mL。
2.2.2 供试品溶液配制
精密称取鼠麴草提取物0.03 g，置于10 mL容量瓶中，加适量甲醇超声分散后定容至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤取滤液即可。供试品溶液的浓度为0.003 g/mL。
2.3 方法学考察
2.3.1 线性回归范围考察
以“2.2.1”项制得的1,3-二咖啡酰奎宁酸标准品溶液为例，分别加甲醇稀释至0、2、4、8、16和32倍制成不同浓度的对照品溶液。按“2.1”项下的超高效液相色谱条件测定，以峰面积为纵坐标，对照品溶液的浓度为横坐标，绘制线性回归方程。图1为标准品溶液稀释2倍制得的对照品溶液进样的色谱图，其中，1号峰位置在11.383 min，2号峰位置在14.238min，3号峰位置在14.442 min，4号峰位置在15.448 min。
同理，按照如上方法，分别绘制1,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸的线性回归方程。
结果显示见表2。
表2 线性范围考察
表2可以看到，本次实验中线性范围考察良好。
2.3.2 精密度试验
取一份“2.2.2”项制得的供试品溶液，按照“2.1”项下的超高效液相色谱条件连续进样六次，记录样品图谱以及峰面积。图2为供试品溶液第一次进样的色谱图，其中，1号峰位置在11.387 min，2号峰位置在14.282 min，3号峰位置在14.477 min，4号峰位置在15.502 min。
结果显示：1,3-二咖啡酰奎宁酸平均峰面积为0.64，RSD为0.44%；1,5-二咖啡酰奎宁酸平均峰面积为8.8，RSD为1.11%；3,5-二咖啡酰奎宁酸平均峰面积为9.52，RSD为1.32%；4,5-二咖啡酰奎宁酸平均峰面积为6.12，RSD为1.36%。由此可以表明，本仪器的精密度良好。
2.3.3 重复性试验
取六份“2.2.2”项制得的供试品溶液，分别按照“2.1”项下的超高效液相色谱条件进行测定，记录样品图谱以及峰面积，并通过“2.3.1”项得到的标准曲线计算得到四种二咖啡酰奎宁酸的浓度，得到四种二咖啡酰奎宁酸的含量。
结果显示：1,3-二咖啡酰奎宁酸平均含量为2.14 mg/g，RSD为0.71%；1,5-二咖啡酰奎宁酸平均含量为60.36 mg/g，RSD为0.93%；3,5-二咖啡酰奎宁酸平均含量为42.46 mg/g，RSD为2.71%；4,5-二咖啡酰奎宁酸平均含量为19.6 mg/g，RSD为2.76%。由此可以表明，本测试方法的重复性良好。
2.3.4 稳定性试验
取一份“2.2.2”项制得的供试品溶液，按照“2.1”项下的超高效液相色谱条件，在1、2、4、6、8、12和24 h进行测定，记录样品图谱以及峰面积，并通过“2.3.1”项得到的标准曲线计算四种二咖啡酰奎宁酸的浓度，得到四种二咖啡酰奎宁酸的含量，考察供试品溶液的稳定性。
结果显示：1,3-二咖啡酰奎宁酸平均含量为1.65 mg/g，RSD为0.91%；1,5-二咖啡酰奎宁酸平均含量为58.97 mg/g，RSD为1.23%；3,5-二咖啡酰奎宁酸平均含量为40.31 mg/g，RSD为2.02%；4,5-二咖啡酰奎宁酸平均含量为18.53 mg/g，RSD为2.79%。由此可以表明，24 h内的供试品溶液稳定性良好。
2.3.5 加样回收率试验
以1,3-二咖啡酰奎宁酸作为二咖啡酰奎宁酸为例，进行以下试验：
S1. 称取九份0.015 g鼠麴草提取物。根据2.3.4项下稳定性的结果：1,3-二咖啡酰奎宁酸平均含量为1.6524 mg/g，因此每份0.015 g鼠麴草提取物溶于10 mL溶剂时，所含被测成分量的浓度约为2.4787 µg/mL，计算公式为：1.6524 mg/g*0.015 g/10 mL*1000=2.4787 μg/mL。
S2. 配制80%、100%和120%的对照品溶液，将其浓度作为加入量，其中，对照品溶液（100%）的浓度与S1中样品所含被测成分量的浓度相当；具体地，按2.2.1项方法配制了浓度为3.2400 µg/mL的对照品溶液（120%），加入适量甲醇稀释制得100%对照品溶液（浓度为2.7000 µg/mL）和80%对照品溶液（浓度为2.1600 µg/mL）。
S3. 配制回收率溶液：
（1）回收率溶液1（溶液80%）：取三份S1中的鼠麴草提取物，分别置于10 mL容量瓶中，精密量取对照品溶液（80%）溶解并稀释至刻度，摇匀，得三份溶液；
（2）回收率溶液2（溶液100%）：取三份S1中的鼠麴草提取物，分别置于10 mL容量瓶中，精密量取对照品溶液（100%）溶解并稀释至刻度，摇匀；
（3）回收率溶液3（溶液120%）：取三份S1中的鼠麴草提取物，分别置于10 mL容量瓶中，精密量取对照品溶液（120%）溶解并稀释至刻度，摇匀。
S4. 按照“2.1”项下的超高效液相色谱条件进行分析，记录样品图谱以及峰面积，并通过“2.3.1”项得到的标准曲线计算四种二咖啡酰奎宁酸含量，进行回收率的计算。结果见表3。
同理，按照如上方法，分别对1,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸进行加样回收率试验，结果见表4、表5和表6。
表3 1,3-二咖啡酰奎宁酸加样回收试验
表4 1,5-二咖啡酰奎宁酸加样回收试验
表5 3,5-二咖啡酰奎宁酸加样回收试验
表6 4,5-二咖啡酰奎宁酸加样回收试验
由表3、表4、表5和表6可知，RSD均小于5%，表明本测试方法的准确度良好。
2.4 鼠麴草提取物中待测指标的相对校正因子的计算
精密吸取“2.3.1”项下不同浓度的1,3-二咖啡酰奎宁酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸的对照品溶液。在相同的浓度下，以1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液为内标，分别测定1,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液中1,5-二咖啡酰奎宁酸的峰面积、3,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液中3,5-二咖啡酰奎宁酸的峰面积和4,5-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液中4,5-二咖啡酰奎宁酸的峰面积。
根据计算公式fsi=(As/Cs)/(Ai/Ci)得到各待测指标的相对校正因子；式中As为1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品的峰面积，Cs为1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液的浓度，Ai为待测二咖啡酰奎宁酸对照品的峰面积，Ci为待测二咖啡酰奎宁酸对照品溶液的浓度。计算不同浓度下的相对校正因子，取平均值，结果见表7。
表7 以1,3-二咖啡酰奎宁酸为内标的相对校正因子
2.5 一测多评法与外标法含量测定结果比较
经过方法学考察和优化后，取两份“2.2.2”项制得的供试品溶液，编号分别为20200711和20201225，采用以上建立的一测多评法，对1,5-二咖啡酰奎宁酸，3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸的成分含量进行测定。为与建立的一测多评法进行比较，采用传统的外标法对上述的供试品溶液进行检测。
结果如表8所示。
表8 一测多评法与外标法所得结果比较（均值±SD，n=2，mg/g）
结果显示：两种方法测得的鼠麴草提取物中四种二咖啡酰奎宁酸成分含量经t检验比较分析发现无显著性差异（P>0.05），且RSD均小于2%，说明建立的一测多评法可用于鼠麴草提取物中多成分分析和质量控制。
对比例1
将实施例1中的梯度洗脱程序改为表12，其他条件不变。
表12 梯度洗脱流动相比例与时间关系
/>
测试结果表明，根据上述梯度洗脱程序，采用一测多评法进行检测分析。图3为对比例1中供试品溶液进样的色谱图，其中1号峰与相邻的峰合成一个峰，无法独立成峰；2号峰与3号峰的分离度<1.5，不能分析二者含量；4号峰有裂分，峰形不好，因此改液相条件不可用。

Claims (14)

1.一种测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，其包括下述步骤：采用一测多评法，通过超高效液相色谱检测供试品溶液即可；
其中，所述一测多评法通过下述步骤：
（1）通过所述超高效液相色谱检测对照品溶液，计算得到相对校正因子；
所述相对校正因子通过下述步骤制得：
S1：取一种对照品溶液作为内参对照品溶液，其它对照品溶液为待测对照品溶液；
S2：将所述内参对照品溶液作为内标物，分别将所述待测对照品溶液进样，进行所述超高效液相色谱检测；
S3：根据测得的峰面积和相应的对照品溶液的浓度，按照相对校正因子计算公式fsi=(As/Cs)/(Ai/Ci)获得相对校正因子；其中，As为内参对照品的峰面积，Cs为内参对照品溶液的浓度，Ai为待测对照品的峰面积，Ci为待测对照品溶液的浓度；
S3中，当1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液作为内参对照品溶液时，1,5-二咖啡酰奎宁酸的相对校正因子为2.327；
S3中，当1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液作为内参对照品溶液时，3,5-二咖啡酰奎宁酸的相对校正因子为1.757；
S3中，当1,3-二咖啡酰奎宁酸对照品溶液作为内参对照品溶液时，4,5-二咖啡酰奎宁酸的相对校正因子为2.129；
（2）通过所述超高效液相色谱检测所述供试品溶液，根据标准曲线或外标法公式、以及所述相对校正因子计算得到所述二咖啡酰奎宁酸的含量；
其中，所述供试品溶液为含有鼠麴草提取物的溶液；
所述超高效液相色谱检测中，采用梯度洗脱方式：流动相A为甲酸水溶液，流动相B为乙腈；
所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
上述百分比为流动相A或流动相B的体积与“流动相A和流动相B”总体积之比。
2.如权利要求1所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，所述二咖啡酰奎宁酸为1,3-二咖啡酰奎宁酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸中的一种或多种；
和/或，所述供试品溶液通过将所述鼠麴草提取物溶解于溶剂中制得；
和/或，所述供试品溶液的浓度为0.001~0.01g/mL。
3.如权利要求2所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，所述溶剂为醇类溶剂；
和/或，所述溶解后还包括过滤的操作；
和/或，所述过滤的滤膜孔径为0.22~0.45 μm；
和/或，所述供试品溶液的浓度为0.003 g/mL。
4.如权利要求3所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，所述溶剂为甲醇；
和/或，所述过滤的滤膜孔径为0.45 μm。
5.如权利要求1所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述对照品溶液中的对照品为1,3-二咖啡酰奎宁酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸和4,5-二咖啡酰奎宁酸中的一种或多种；
和/或，步骤（1）中，所述对照品溶液通过先配置一特定浓度的标准品溶液，再通过稀释获得特定浓度的对照品溶液。
6.如权利要求5所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，稀释倍数为0、2、4、8、16和32倍；
和/或，所述标准品溶液通过将二咖啡酰奎宁酸溶解于溶剂中制得；
和/或，所述标准品溶液的浓度为0.025~1.4 mg/mL。
7.如权利要求6所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，所述溶剂为醇类溶剂；
和/或，当所述对照品为1,3-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度为0.025~0.25mg/mL；
和/或，当所述对照品为1,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度为0.14~1.4mg/mL；
和/或，当所述对照品为3,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度为0.13~1.3mg/mL；
和/或，当所述对照品为4,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度为0.09~0.9mg/mL。
8.如权利要求7所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，所述溶剂为甲醇；
和/或，当所述对照品为1,3-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度为0.0767 mg/mL；
和/或，当所述对照品为1,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度为0.4136 mg/mL；
和/或，当所述对照品为3,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度为0.3977 mg/mL；
和/或，当所述对照品为4,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述标准品溶液的浓度为0.2772 mg/mL。
9.如权利要求1所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述标准曲线通过下述步骤制得：将所述对照品溶液进样，进行所述超高效液相色谱检测，根据测得的峰面积和相应的所述对照品溶液的浓度，得到回归方程，获得标准曲线；
和/或，步骤（2）中，根据所述标准曲线和所述相对校正因子计算得到所述二咖啡酰奎宁酸的含量。
10.如权利要求9所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，所述标准曲线中，以所述峰面积为纵坐标，所述对照品溶液的浓度为横坐标；
当所述对照品为1,3-二咖啡酰奎宁酸时，所述回归方程为y=135.590x-0.0250，其中，线性范围为2.4~75.6 µg/mL，R2=1，x为1,3-二咖啡酰奎宁酸溶液的浓度mg/mL，y为相应的峰面积；
当所述对照品为1,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述回归方程为y=57.717x-0.0807，其中，线性范围为12.3~392 µg/mL，R2=0.9999，x为1,5-二咖啡酰奎宁酸溶液的浓度mg/mL，y为相应的峰面积；
当所述对照品为3,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述回归方程为y=76.505x-0.0960，其中，线性范围为11.9~382 µg/mL，R2=0.9999，x为3,5-二咖啡酰奎宁酸溶液的浓度mg/mL，y为相应的峰面积；
当所述对照品为4,5-二咖啡酰奎宁酸时，所述回归方程为y=64.054x-0.0827，其中，线性范围为8.8~282.9 µg/mL，R2=0.9999，x为4,5-二咖啡酰奎宁酸溶液的浓度mg/mL，y为相应的峰面积。
11.如权利要求1所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
。
12.如权利要求11所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，所述流动相A和所述流动相B的梯度洗脱条件如下所述：
。
13. 如权利要求1所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测中，色谱柱为Waters Acquity UPLC HSS T3 column，其规格为2.1 mm × 150 mm, 1.8 µm；
和/或，所述超高效液相色谱检测中，所述甲酸水溶液的浓度为0.05~0.2%，百分比为甲酸占水的体积百分比；
和/或，所述超高效液相色谱检测中，流速为0.2~0.4 mL/min；
和/或，所述超高效液相色谱检测中，柱温为40~50℃；
和/或，所述超高效液相色谱检测中，检测波长为280-360 nm；
和/或，所述超高效液相色谱检测中，进样量为1~5 μL。
14.如权利要求13所述的测定鼠麴草提取物中二咖啡酰奎宁酸含量的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱检测中，所述甲酸水溶液的浓度为0.1%；
和/或，所述超高效液相色谱检测中，流速为0.3 mL/min；
和/或，所述超高效液相色谱检测中，柱温为40℃；
和/或，所述超高效液相色谱检测中，检测波长为280 nm；
和/或，所述超高效液相色谱检测中，进样量为1 μL。
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