CN109632997B - 一种百合药材中王百合苷b的提取及测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种百合药材中王百合苷B的提取及测定方法。本发明的百合药材中王百合苷B的提取方法包括：取百合药材粉末，加入稀乙醇，超声处理，所得提取液即为含王百合苷B的提取液。本发明的测定百合药材中王百合苷B含量的方法包括：取待测百合药材样品粉末，按照提取方法制得含王百合苷B的提取液；采用Waters高效液相色谱仪检测所述提取液中王百合苷B的含量。本发明的方法可有效提取并准确测定百合药材中王百合苷B的含量。
Description
技术领域
本发明是关于一种百合药材中王百合苷B的提取及测定方法，具体地说，是一种百合药材中王百合苷B的提取方法以及利用高效液相色谱测定百合药材中王百合苷B含量的方法。
背景技术
百合为百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker或细叶百合Lilium pumilum DC.的干燥肉质鳞叶，最早记载于《神农本草经》，被列为中品。百合鳞茎含有皂苷、酚性甘油苷、生物碱、多糖、氨基酸、磷脂以及微量元素等多种成分。百合主要含酚性甘油酯类化合物，其中包括1-O-阿魏酰甘油、1-O-p-香豆酰甘油、王百合苷D、王百合苷C、王百合苷A、王百合苷E、王百合苷B，具有抗氧化、抗肿瘤、抗增殖、免疫调节及雌激素活性等作用。
目前《中国药典》2015年版未制定百合含量测定指标，在2018年发布的《中国药典》2015年版第一增补本新增加了百合多糖的含量测定。
现有技术文献“江苏产宜兴百合活性研究与质量评价”(胡文彦.江苏产宜兴百合活性研究与质量评价[D].江苏大学,中国,江苏,2007)公开了一种同时测定百合(卷丹)药材中王百合苷C和王百合苷A含量的方法，其中采用HPLC-MS/MS联用方法，从所得提取液中分离鉴别出王百合苷C和王百合苷A等化合物，结果显示王百合苷C和王百合苷A进样量分别在0.10～2.62μg和0.31～7.86μg范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为100.6％(RSD＝1.37％)、102.5％(RSD＝1.16％)，该方法的色谱条件为：色谱柱AlltimaC18(4.6mm*250mm，5μm)，流动相水-甲醇(73∶27)。流速1.0ml/min，检测波长325nm，柱温30℃，进样量为10μl。该文献并没有记载如何有效提取及测定王百合苷B的方法。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种百合药材中王百合苷B的提取方法，以有效提取中百合药材中的王百合苷B成分。
本发明的另一目的在于提供一种测定百合药材中王百合苷B含量的方法。
为达上述目的，一方面，本发明提供了一种百合药材中王百合苷B的提取方法，该方法包括：
取百合药材粉末，加入稀乙醇，超声处理，所得提取液即为含王百合苷B的提取液。
根据本发明的具体实施方案，本发明的百合药材中王百合苷B的提取方法中，所述百合药材粉末为过三号筛的粉末。
根据本发明的具体实施方案，本发明的百合药材中王百合苷B的提取方法中，所述稀乙醇为乙醇含量49.5％～50.5％(ml/ml)的乙醇水溶液。
根据本发明的具体实施方案，本发明的百合药材中王百合苷B的提取方法中，所述百合药材粉末与稀乙醇的比例为：2g百合粉末：稀乙醇15～50ml。具体地，所述百合药材粉末与稀乙醇的比例可以为2g百合粉末：稀乙醇15ml，2g百合粉末：稀乙醇25ml，或者2g百合粉末：稀乙醇50ml。
根据本发明的具体实施方案，本发明的百合药材中王百合苷B的提取方法中，超声处理的条件为：功率300W，频率45KHz，超声处理30分钟。
根据本发明的具体实施方案，本发明的百合药材中王百合苷B的提取方法还包括超声处理后进行过滤取滤液的过程。超声处理后可以在超声处理后可根据需要补充适量的稀乙醇以定量，再进行过滤取滤液。
另一方面，本发明还提供了一种测定百合药材中王百合苷B含量的方法，该方法包括：
按照本发明所述的提取方法制得含王百合苷B的提取液；
采用Waters高效液相色谱仪检测所述提取液中王百合苷B的含量。
根据本发明的具体实施方案，本发明的测定百合药材中王百合苷B含量的方法中，高效液相色谱仪检测过程中，以Waters XBridgeC18、Thermo AcclainC18或Waters XSelectCSHC18为色谱柱；优选地，色谱柱规格为：4.6mm*250mm，5μm。
根据本发明的具体实施方案，本发明的测定百合药材中王百合苷B含量的方法中，高效液相色谱仪检测时，流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液(18～20∶82～80)，流速0.8～1.2ml/min，检测波长312nm，柱温28～32℃。
根据本发明的具体实施方案，本发明的测定百合药材中王百合苷B含量的方法中，高效液相色谱仪检测时，进样量为10μl。
根据本发明的具体实施方案，本发明的测定百合药材中王百合苷B含量的方法还包括制备王百合苷B的标准曲线，对照该标准曲线计算所测百合药材中王百合苷B的含量。
综上所述，本发明提供了百合药材中王百合苷B的提取及测定方法，本发明的方法，提取液稳定性好，测定方法耐用性良好，精密度良好，可有效提取并准确测定百合药材中王百合苷B的含量。
附图说明
图1为按照现有技术检测王百合苷B对照品溶液的色谱图。
图2为按照现有技术检测百合样品溶液的色谱图。
图3为按照本发明的方法检测王百合苷B对照品溶液的色谱图。
图4为按照本发明的方法检测百合样品溶液的色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此。
实施例1
1材料
1.1仪器及试剂
仪器：Waters高效液相色谱仪(Acquity Arc，Waters公司)；Waters高效液相色谱仪(e2695，Waters公司)；Thermo AcclainC18(4.6mm*250mm，5μm)色谱柱，Waters XSelectCSH(4.6mm*250mm，5μm)色谱柱，Waters XBridgeC18(4.6mm*250mm，5μm)色谱柱，万分之一天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)，百万分之一天平(XP26，梅特勒-托利多公司)；数控超声波清洗器(KQ500D，昆山市超声仪器有限公司)；恒温水浴锅(HWS28型，上海一恒科技有限公司)；超纯水系统(Milli-QDirect，默克股份有限公司)。
试剂：乙醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)、甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)；磷酸(天津市科密欧化学试剂有限公司，色谱纯)、乙腈(默克股份有限公司，色谱纯)、水为超纯水(Milli-QDirect超纯水系统，默克股份有限公司)。
试药：王百合苷B对照品(批号：114420-66-5，含量＞98.0％，南京世洲生物技术有限公司)。
2方法与结果
2.1百合药材王百合苷B含量测定方法学建立
2.1.1色谱条件
色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以乙腈-0.1％磷酸溶液(19∶81)为流动相，流速为1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为312nm。理论板数按王百合苷B峰计算应不低于150000。
2.1.2对照品溶液制备
对照品溶液的制备：王百合苷B对照品适量，加甲醇制成每mL含王百合苷B120μg的对照品溶液。
2.1.3供试品溶液制备
供试品溶液的制备：取本品粉末(过三号筛)约2.0g，精密称定，加入稀乙醇25ml，称定重量，超声处理(功率300W，频率45kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得。
2.2含量测定方法学验证
2.2.1专属性试验峰纯度试验百合供试品溶液、空白溶剂(稀乙醇)、参照物溶液，注入液相色谱仪，按上述条件测定，以DAD检测器进行190～400nm扫描检测，计算峰纯度，王百合苷B未检测到杂质峰，纯度因子在计算出的阈值限值内，在该色谱条件下，王百合苷B纯度和专属性均符合要求。
2.2.2标准曲线的制备精密称定王百合苷B对照品6.563mg，置10ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含643.1740μg的对照品母液。精密量取浓度为643.1740μg/ml的对照品母液用1ml，分别置于2ml、5ml、10ml、25ml、50ml量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得，浓度分别为每1ml含321.5870μg、128.6348μg、64.3174μg、25.7270μg、12.8635μg的对照品溶液。按上述色谱条件测定，以王百合苷B的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线：y＝2998538783x-107432.6177，其相关系数r＝0.9995，表明王百合苷B在进样浓度12.8635～643.1740μg/ml的范围内进样质量与峰面积线性关系良好。
2.2.3精密度试验取王百合苷B对照品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次，计算王百合苷B峰面积的RSD为2.52％，表明仪器精密度良好。
2.2.4重复性试验取本品粉末(过三号筛)约2.0g，平行制备6份供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果百合药材中王百合苷B含量分别为2.123，2.125，2.074，2.094，2.110，2.115mg/g，RSD为0.93％，表明该方法的重复性良好。
2.2.5稳定性试验取同一份百合药材供试品溶液，分别于供试品溶液制备后0，2，4，8，12，18，24h按“2.1.1”项下色谱条件测定，结果王百合苷B峰面积的RSD为0.3％，表明百合药材供试品溶液在制备后24h内稳定性良好。
2.2.6准确度试验采用加样回收法，精密称量25.338mg王百合苷B对照品置25ml量瓶中，加甲醇制成每1ml含993.2496μg母液。精密吸取上述母液1.0ml、2.0ml、3.0ml于具塞锥形瓶中，每组分别平行3份，共9份，挥干溶剂；再取百合药材粉末(过3号筛)，分别取约1g于上述9个具塞锥形瓶中，加入稀乙醇25ml，超声处理(功率300W，频率45kHz)30分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，分别进样，测定供试品溶液中王百合苷B含量，计算加样回收率，结果见表1。
表1：百合药材含量测定加样回收率结果
结果显示，王百合苷B的加样回收率范围为101.77～105.72％，平均加样回收率为103.84％，RSD为1.62％，说明该方法准确度良好。
2.2.7耐用性试验同一百合药材供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件，分别考察了色谱柱Waters XSelect CSH C18(4.6mm*250mm，5μm)、Thermo Acclain C18(4.6mm*250mm，5μm)、Waters XBridge C18(4.6mm*250mm，5μm)，流速(0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min、)、柱温(28℃、30℃、32℃)、流动性比例(18∶82、19∶81、20∶80)对百合中王百合苷B含量的影响，测定结果见表2、表3、表4及表5。结果RSD均<3.0％，该分析方法耐用性良好。
表2：不同色谱柱耐用性考察结果
| 色谱柱 | 含量(mg/g) |
| Thermo Aclain | 2.102 |
| Waters CSH | 2.079 |
| Waters XBridge | 2.140 |
| RSD(％) | 1.47 |
表3：不同流速耐用性考察结果
| 流速(ml/min) | 含量(mg/g) |
| 0.8 | 2.196 |
| 1.0 | 2.141 |
| 1.2 | 2.114 |
| RSD(％) | 1.93 |
表4：不同柱温耐用性考察结果
| 柱温(℃) | 含量(mg/g) |
| 28 | 2.048 |
| 30 | 2.141 |
| 35 | 2.027 |
| RSD(％) | 2.92 |
表5：不同流动相比例耐用性考察结果
2.2.8中间精密度试验选择不同的测定时间、不同的高效液相色谱仪、不同实验人员(B)，取本品粉末(过三号筛)约2.0g，平行6份，精密称定，按“2.1.3”项下供试品溶液制备方法，制备供试品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件测定，测定供试品溶液中王百合苷B含量，结果表明不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，王百合苷B含量见表6，结果RSD为2.11％，该分析方法中间精密度良好。
表6
3样品测定
已收集的18批百合药材样品的含量测定结果见表7：
表7：18批百合药材王百合苷B含量
实验结果显示，18批百合药材王百合苷B含量范围为1.099mg/g～2.541mg/g，该方法可用于百合药材王百合苷B的含量测定。
对比例1
采用WatersXBridgeC18(4.6mm*250mm，5μm)色谱柱，按现有技术文献“江苏产宜兴百合活性研究与质量评价”(胡文彦.江苏产宜兴百合活性研究与质量评价[D].江苏大学,中国,江苏,2007)的条件检测提取液中王百合苷B，发现在该色谱条件下，王百合苷B色谱峰响应很低，见图1、图2。
而本发明中，改变流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液(19∶81)，流速1.0ml/min，检测波长312nm，柱温30℃，进样量为10μl，王百合苷B的响应值较高，见图3、图4。用DAD检测器进行190～400nm扫描检测，王百合苷B色谱峰最大吸收波长为312nm。
综上所述，本发明建立了百合中王百合苷B的含量测定方法，为百合质量控制提供依据。
Claims (3)
1.一种测定百合药材中王百合苷B含量的方法，该方法包括：
供试品溶液的制备：取待测百合药材样品粉末约2.0g，过三号筛，精密称定，加入稀乙醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，功率300W，频率45kHz，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液即得；
采用Waters高效液相色谱仪检测所述供试品溶液中王百合苷B的含量；
其中，高效液相色谱仪检测过程中，以Waters XBridge C18、Thermo Acclain C18或Waters XSelect CSH C18为色谱柱；色谱柱规格为：4.6mm*250mm，5μm；
高效液相色谱仪检测时，流动相为乙腈-0.1％磷酸水溶液，流动相浓度比例为18～20∶82～80，流速0.8～1.2ml/min，检测波长312nm，柱温28～32℃。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，高效液相色谱仪检测时，进样量为10μl。
3.根据权利要求1所述的方法，该方法还包括制备王百合苷B的标准曲线，对照该标准曲线计算所测百合药材中王百合苷B的含量。
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