CN101658550A - 夏枯草口服液含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种夏枯草口服液含量测定方法，包括如下步骤：照高效液相色谱法测定迷迭香酸；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，甲醇－0.5％甲酸(40∶60)为流动相；检测波长330nm。理论板数应不低于3000；精密称取迷迭香酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本发明被检组份含量高、稳定性好，有利于对产品质量进行控制。
Description
技术领域
本发明属于中药制剂领域，特别涉及夏枯草口服液含量测定方法。
背景技术
夏枯草口服液是处方夏枯草800g，制法：取夏枯草800g，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至约800ml，静置24小时，滤过，滤液加蔗糖250g及苯甲酸钠3g，加热使溶解，加水调整总量至1000ml，搅匀，冷藏24小时，滤过，灌封，每支装10ml，灭菌，即得。夏枯草口服液现有质量标准为国家药品标准WS3-224(Z-224)-2003(Z)，标准中含量测定项下规定用紫外分光光度法检测总黄酮含量与及用高效液相色谱法检测金丝桃苷含量。在检测过程中，发现高效液相色谱法检测金丝桃苷存在以下缺点：一、夏枯草口服液中金丝桃苷含量太低，一般仅为0.11-0.20mg/10ml左右，而标准规定为应不得少于0.10mg/10ml，作为夏枯草口服液含量测定的指标成分不恰当；二、本品中总黄酮含量较高，金丝桃苷属其中的一种，结构相对复杂，含量又低，在液相色谱中分离较困难，所以常导致样品中金丝桃苷色谱峰的分离度仅为1.0左右，从而影响检测结果的准确性，不利于产品质量的控制。
而夏枯草中富含迷迭香酸，迷迭香酸具有很强的紫外线吸收能力和极强的抗氧化性及良好的热稳定性，其抗氧化活性强于绿原酸、阿魏酸、咖啡酸、维生素E等，具有抗血栓及血小板凝集作用，能增强血浆纤维蛋白溶解活性。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点而提供的一种被检组份含量高、稳定性好，有利于对产品质量进行控制的夏枯草口服液含量测定方法。
本发明的一种夏枯草口服液含量测定方法，包括如下步骤：
(1)迷迭香酸测定：照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部VI D)测定；
(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.5％甲酸(40∶60)为流动相；检测波长330nm。理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于3000；
(3)对照品溶液的制备：精密称取迷迭香酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
(4)供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得：
(5)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述夏枯草口服液含量测定方法，其中：夏枯草口服液每支(10ml)含夏枯草以迷迭香酸(C18H16O8)计，不得少于4.0mg。
上述夏枯草口服液含量测定方法，还包括总黄酮测定的以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品20mg，置10ml量瓶中，加甲醇5ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.2mg)；
(2)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml与6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水稀释至刻度，摇匀，放置15分钟，同时以相应的试剂作空白；照分光光度法(中国药典2005年版一部附录V A)，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(3)测定法：精密量取本品10ml，加水10ml，摇匀。用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇10ml使溶解，定量转移至100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6ml”起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得。
上述夏枯草口服液含量测定方法，其中：夏枯草口服液每支(10ml)含总黄酮以芦丁(C27H30O16)计，不得少于50.0mg。
本发明与现有技术相比，由以上技术方案可知，对夏枯草口服液中含量高的迷迭香酸含量测定、检测方法科学、迷迭香酸峰与其它峰有良好的分离。稳定性好，有利于对产品质量进行控制。在同一体系中对总黄酮、迷迭香酸同时进行含量测定，使得夏枯草口服液质量更容易控制。
附图说明
图1为迷迭香酸对照品线性关系图之一；
图2为迷迭香酸对照品线性关系图之二。
具体实施方式
以下通过实验例来进一步说明本发明方法的有益效果。
1、仪器及设备Agilent 1100型高效液相色谱仪，VWD检测器，Agilent化学工作站。超声波清洗器CX-250型(频率：29-34KHz，功率：≥250W，北京医疗设备二厂)；电子天平(十万分之一)AE240型(Mettler公司)。
2、对照品及试药
对照品：迷迭香酸对照品(批号：06111725)供含量测定用，纯度按面积归一化法检测为97％，购于上海同田生化技术有限公司。
试剂：甲醇为色谱纯及分析纯；甲酸为分析纯；水为重蒸馏水。
试药：夏枯草口服液样品由贵阳新天药业股份有限公司提供。
3、对照品溶液的制备
对照品溶液①精密称取迷迭香酸对照品24.46mg，置50ml量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含0.475mg的溶液(纯度以97％计)。
对照品溶液②精密吸取上述对照品溶液20ml置50ml的量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含0.19mg的溶液。
4、色谱条件试验
4.1色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(Agilent C18，250mm×4.6mm，5μm)
4.2流速：1.0ml/min
4.3检测波长：330nm(参照药物分析杂志Chin J Pharm Anal 2006，3夏枯草中迷迭香酸含量分析方法研究)
4.4柱温：25℃
4.5流动相：原文献中流动相为甲醇-1％甲酸(40∶60)，在实际检测中发现该流动相pH值低于2，超过色谱柱pH适用范围，对柱子损伤较大，所以将其改为甲醇-0.5％甲酸(40∶60)
4.6供试品溶液的制备精密量取夏枯草口服液(20081204)2ml，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果供试品图谱中在与对照品相应的时间内出现相应的色谱峰，峰形良好，迷迭香酸峰与其它峰有良好的分离，说明该条件适宜作为夏枯草口服液中迷迭香酸的含量测定。
5、供试品溶液制备溶剂选择试验
方法一：精密量取夏枯草口服液(20081204)2ml，置25ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法二：精密量取夏枯草口服液(20081204)2ml，置25ml量瓶中，加50％乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法三：精密量取夏枯草口服液(20081204)2ml，置25ml量瓶中，加乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法四：精密量取夏枯草口服液(20081204)2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
精密吸取对照品溶液(0.19mg/ml)及上述供试品溶液各10μl进样测定：
结论：从以上试验结果可以看出，各方法中，迷迭香酸峰与其它峰之间均有良好的分离，方法2、3含量无明显变化，方法4含量最高，因此将方法4列入正文，即为：精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6、系统适用性试验及色谱柱耐用性试验
6.1系统适用性试验
精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；另取阴性样品同法制成阴性样品溶液。精密吸取对照品溶液(0.19mg/ml)、阴性样品溶液和供试品溶液各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。从色谱图中可看出，供试品在与对照品保留时间相应的位置上有峰，且峰形好，而阴性样品在相应的位置上无峰，说明阴性样品对样品测定无干扰。样品在图谱中的迷迭香酸峰的理论板数为9368，与其它物质有良好的分离，峰形好，综合考虑，规定本实验的理论板数按迷迭香酸峰计算，应不得低于3000。
6.2色谱柱耐用性试验
分别取上述供试品溶液、对照品溶液各10μl注入液相色谱议，分别用Elite、迪马、汉邦品牌色谱柱进行试验，结果如下：
| 色谱柱 | 对照品峰面积 | 供试品峰面积 | 供试品理论塔板数 | 含量(mg/ml) |
| Elite | 3293.64990 | 1737.68616 | 8028 | 1.25 |
| 迪马 | 4028.22925 | 2142.56836 | 10107 | 1.26 |
| 汉邦 | 4261.63477 | 2304.59351 | 10178 | 1.28 |
结果表明，以上三种品牌的色谱柱亦能检测迷迭香酸含量，耐用性良好。
7、线性关系试验
对照品溶液①：精密量取迷迭香酸对照品溶液②(C＝0.19mg/ml)1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含0.019mg的溶液。
对照品溶液②：精密量取迷迭香酸对照品溶液①(C＝0.475mg/ml)1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含0.048mg的溶液。
对照品溶液③：取迷迭香酸对照品溶液②(C＝0.19mg/ml)5ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含0.095mg的溶液。
对照品溶液④：取对照品溶液②(C＝0.19mg/ml)即得。
对照品溶液⑤：取对照品溶液①(C＝0.475mg/ml)即得。
精密吸取上述5个对照品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，结果见下表：
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 对照品溶液浓度(mg/ml) | 0.019 | 0.048 | 0.095 | 0.19 | 0.475 |
| 峰面积 | 388.60757 | 912.34357 | 1834.39929 | 3682.57007 | 9163.59961 |
以峰面积为纵坐标，以浓度(mg/ml)为横坐标作线性关系图
参见图1，得线性方程：y＝19282x+7.0437 r＝0.9999
参见图2，得线性方程：y＝19303x r＝0.9999
结果表明，迷迭香酸在浓度为0.019～0.475mg/ml范围内具有良好的线性关系；通过拟合后二方程之间的相对偏差小于1％，说明该法适宜用外标一点法进行定量。
8、精密度试验
精密吸取迷迭香酸对照品溶液(C＝0.19mg/ml)10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，结果见下表：
实验结果表明，该方法有良好的精密度。
9、稳定性试验
精密量取本品(批号：20081204)2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。分别精密吸取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，并将供试品溶液放置0、2、4、8、12、24小时后，分别精密吸取供试品溶液10μl进样测定，记录色谱图，结果见下表：
从上述试验结果得出，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
10、重复性试验
精密量取本品(批号：20081204)2ml，置25ml，加50％稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液(浓度为0.19mg/ml)和5份供试品溶液各10μl进样测定，结果见下表：
通过上述试验结果得出，该方法的样品重现性好。
11、加样回收率试验
对照品溶液的制备：精密称取迷迭香酸对照品12.41mg，置10ml量瓶中，加50％甲醇使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得每1ml含1.204mg的溶液。(迷迭香酸对照品以97％计)
精密量取本品(20081204)1ml(平行样6份)，置25ml量瓶中，再精密加入上述迷迭香酸对照品溶液(C＝1.204mg/ml)1ml，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
精密吸取迷迭香酸对照品溶液(C＝0.19mg/ml)和上述6份供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，结果见下表：
从上述实验结果得出，该方法有良好的回收率。
12、样品含量测定及含量限度的制定
按夏枯草药材迷迭香酸含量测定的方法检测三批原药材的迷迭香酸含量，并按正文方法和条件检测该3批药材分别对应的夏枯草口服液成品的迷迭香酸含量，结果如下：
根据三批大生产样品含量与处方中夏枯草药材中迷迭香酸的转移率(24.8％)，确定本品含量限度为。
实施例：
一种夏枯草口服液含量测定方法，包括在同一体系中对总黄酮、迷迭香酸同时进行含量测定，步骤如下：
(1)总黄酮对照品溶液的制备精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品20mg，置10ml量瓶中，加甲醇5ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.2mg)。
标准曲线的制备精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml与6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水稀释至刻度，摇匀，放置15分钟，同时以相应的试剂作空白。照分光光度法(中国药典2005年版一部附录V A)，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
测定法精密量取本品10ml，加水10ml，摇匀。用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇10ml使溶解，定量转移至100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取1ml，置25ml量瓶中，加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水稀释至刻度，摇匀，放置15分钟，同时以相应的试剂作空白。照分光光度法(中国药典2005年版一部附录V A)，在500nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得。
本品每支含总黄酮以芦丁(C27H30016)计，不得少于50.0mg。
(2)迷迭香酸照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部VI D)测定。
色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；甲醇-0.5％甲酸(40∶60)为流动相；检测波长330nm。理论板数按迷迭香酸峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备精密称取迷迭香酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得。
供试品溶液的制备精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
本品每支含夏枯草以迷迭香酸(C18H16O8)计，不得少于4.0mg。
Claims (4)
1、一种夏枯草口服液含量测定方法，包括如下步骤：
(1)迷迭香酸测定：照高效液相色谱法测定；
(2)色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，40∶60的甲醇-0.5％甲酸为流动相；检测波长330nm。理论板数应不低于3000；
(3)对照品溶液的制备：精密称取迷迭香酸对照品适量，加50％甲醇制成每1ml含0.2mg的溶液，即得；
(4)供试品溶液的制备：精密量取本品2ml，置25ml量瓶中，加50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得：
(5)测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
2、如权利要求1所述的夏枯草口服液含量测定方法，其中：夏枯草口服液每支含夏枯草以迷迭香酸计，不得少于4.0mg。
3、如权利要求1或2所述的夏枯草口服液含量测定方法，还包括总黄酮测定的以下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取在120℃减压干燥至恒重的芦丁对照品20mg，置10ml量瓶中，加甲醇5ml，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，精密量取5ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.2mg)；
(2)标准曲线的制备：精密量取对照品溶液1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml与6.0ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水稀释至刻度，摇匀，放置15分钟，同时以相应的试剂作空白；照分光光度法，在500nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线；
(3)测定法：精密量取本品10ml，加水10ml，摇匀。用水饱和的正丁醇振摇提取4次，每次20ml，合并提取液，蒸干，残渣加甲醇10ml使溶解，定量转移至100ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀；精密量取1ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自加水至6ml起依法测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中相当于芦丁的重量，计算，即得。
4、如权利要求3所述的夏枯草口服液含量测定方法，其中：夏枯草口服液每支含总黄酮以芦丁计，不得少于50.0mg。
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