CN103543222A - 一种热毒宁注射液中糖类成分含量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种热毒宁注射液中糖类成分含量的检测方法，特别是涉及一种应用HPLC-ELSD法同时测定热毒宁注射液中果糖和葡萄糖的含量的方法。该方法采用氨基键合硅胶色谱柱，蒸发光散射检测器，以乙腈-水或甲醇-水为流动相。本方法简便、快速、准确、可靠，色谱峰分离度良好，可使果糖和葡萄糖呈现良好的分离度，适用于热毒宁注射液中果糖和葡萄糖含量的测定。

Description

一种热毒宁注射液中糖类成分含量的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药注射液的检测方法，特别涉及一种热毒宁注射液中果糖和葡萄糖的含量检测方法。

背景技术

热毒宁注射液(国药准字Z20050217)是江苏康缘药业股份有限公司的独家品种。热毒宁注射液处方由青蒿、金银花、栀子组成，用于急性支气管炎、外感风热所致感冒咳嗽等症，在临床上得到广大医生和患者的欢迎。据陈有根等(3种经典工艺生产的金银花提取物中糖类成分含量比较.中国中医药信息杂志[J].2008，15(2)∶50～52.)、韦性琰等(江西栀子多糖的含量测定及比较.江西中医学院学报[J].2011，23(5)∶51～52.)、薛明等(青蒿多糖的抗肿瘤作用实验研究.时珍国医国药[J].2008，19(4)∶937～938.)报道，青蒿、金银花、栀子中均含有糖类成分，且种类较多。为了更好地控制药品质量，发明人希望能够建立一套完整、有效的检测方法，为此发明人进行了更加细致地研究。

现有文献记载，糖类成分测定多用比色法，包括苯酚—硫酸法、蒽酮—硫酸法、3,5-二硝基水杨酸法(DNS法)。前两种方法的原理是利用多糖在强酸性条件下脱水生成糠醛或其衍生物，然后再与酚类或胺类化合物缩合，生成有特殊颜色的物质的这一性质进行测定。比色法虽然简便，但因硫酸遇水剧烈放热，使显色条件难以控制，影响测定结果。DNS法的原理是在NaOH和丙二醇存在下，3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原生成氨基化合物，在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈橘红色，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系。该方法的缺点在于，波长越短，测定灵敏度越高，越适合于检测浓度偏低的样品；波长越长，测定灵敏度越低，但标准曲线的线性范围越宽，对测定较高浓度的样品有利。此外，糖类成分的化学结构也其影响还原能力，因而影响测定结果。

除以上三种方法外，高效液相色谱—蒸发光散射法也被较多的应用于糖类成分的测定中。陈俊等(HPLC-ELSD在中药分析及指纹图谱中的应用.药学实践杂志[J].2009，27(4)∶251～253.)报道，中药的化学成分复杂，部分成分不存在紫外吸收或仅在紫外末端有吸收，加上色谱分离的困难以及流动相带来的干扰，使用传统的紫外检测器对其进行定性定量分析十分困难。ELSD在某种程度上弥补了这方面的不足。而糖类成分多不存在紫外吸收，以前主要采用分光光度法对这类成分进行定量分析，但只能测定总糖含量，灵敏度和准确度较差。HPLC-ELSD方法则可以直接进行单糖的测定。多篇文献也报道，HPLC-ELSD法可以用于食品、药品中糖类成分的测定。但是，HPLC-ELSD法对色谱柱的柱效具有较高的要求，不同类型、不同型号甚至不同厂家的色谱柱对成分的分离都有实质上的影响。而且，就现有文献的报道来看，以应用HPLC-ELSD法检测单味中药材中糖类成分的研究占绝大部分，应用到中药复方制剂的研究较少。

基于以上报道，发明人有针对性的检索了金银花、青蒿、栀子中糖类成分含量测定方法的相关报道。文献记载，科研人员应用紫外分光光度法、苯酚—硫酸法、蒽酮—硫酸法测定栀子多糖的含量，金银花中糖类成分亦采用苯酚—硫酸法测定含量，而对青蒿多糖的研究则侧重其药理活性，含量测定方法未见报道。

在此基础上江苏康缘药业股份有限公司经过对热毒宁注射液进行系统成分分析后，发现糖类成分在成品指纹图谱中清晰可见、且含量较高，主要为葡萄糖和果糖。如何对热毒宁注射液中葡萄糖和果糖的含量进行测定，现有技术没有报道，如果采用目前较为先进的HPLC-ELSD法对热毒宁注射液中的果糖和葡萄糖进行定量检测，如何克服待测成分分离度以及其他成分的干扰，在现有技术中没有报道，所以，建立一种准确、可靠、快速的对热毒宁注射液中葡萄糖和果糖进行测定的方法成为亟待解决的技术问题。

发明内容

为实现上述目的，发明人提供一种HPLC-ELSD法同时测定热毒宁注射液中葡萄糖和果糖含量的测定方法，具体步骤为：

(1)低浓度对照品溶液制备：精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成含果糖和葡萄糖的低浓度对照品溶液；

(2)高浓度对照品溶液制备：精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成含果糖和葡萄糖的高浓度对照品溶液；

(3)供试品溶液制备：精密吸取热毒宁注射液，加水稀释、定容，摇匀，作为供试品溶液；

(4)色谱条件：色谱柱：氨基键合硅胶色谱柱；蒸发光散射检测器：漂移管温度90～100℃，氮气流速2.0～3.0L/min，增益值1；以乙腈-水(75～90：25～10v/v)或甲醇-水(95～85：5～15v/v)为流动相；流速1.0～2.0mL/min;进样量5～15μL。

优选的，低浓度对照品溶液为每1mL溶液中含有果糖0.3～0.5mg、葡萄糖0.8～0.9mg；

更优选的，低浓度对照品溶液为每1mL溶液中含有果糖0.35～0.45mg、葡萄糖0.80～0.85mg。

优选的，高浓度对照品溶液为每1mL溶液中含有果糖0.8～0.9mg、葡萄糖3.5～4.0mg；

更优选的，高浓度对照品溶液为每1mL溶液中含有果糖0.80～0.85mg、葡萄糖3.5～3.8mg。

优选的，供试品溶液的配制方法为精密吸取热毒宁注射液1mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。

优选的，色谱柱为Waters Carbohydrate NH₂(3.9×300mm)、Alltech Prevail^TMCarbohydrate ES(4.6×250mm)；

最优选的，色谱柱为Waters Carbohydrate NH₂(3.9×300mm)。

优选的，蒸发光散射检测器：漂移管温度95℃，氮气流速2.5L/min，增益值1。

优选的，流动相为乙腈-水(75～90：25～10v/v)或甲醇-水(95～85：5～15v/v)；

更优选的，流动相为乙腈-水(80～85：20～15v/v)或甲醇-水(90：10v/v)；

最有选的，流动相为乙腈-水(83：17v/v)。

优选的，流速1.2mL/min。

优选的，进样量为10μL。

本发明的有益效果在于，

1、采用HPLC-ELSD法对热毒宁注射液中的果糖和葡萄糖进行定量检测，色谱峰分离度良好，果糖浓度在0.4056μg～4.056μg范围内，其浓度对数—峰面积对数呈良好的线性关系(r=0.9992)，平均回收率为102.3％，RSD为2.8％，葡萄糖浓度在0.8348μg～8.348μg范围内，其浓度对数—峰面积对数呈良好的线性关系(r=0.9999)，平均回收率为102.0％，RSD为2.9％。

2.发明人对不同类型、不同厂家的色谱柱进行了考察，其中以WatersCarbohydrate NH₂(3.9×300mm)的检测结果最为合适。Inertsil-NH₂(4.6×250mm)和Phenomenex Luna NH₂(4.6×250mm)不能将葡萄糖和果糖完全分离，而使用AlltechPrevail^TM Carbohydrate ES(4.6×250mm)时，果糖峰形不理想。

3、本发明采用高浓度对照品和低浓度对照品并用的方法，得到精确的线性范围，从而精密测定热毒宁注射液中果糖和葡萄糖的含量。

4、本发明提供的技术方案准确可靠，灵敏度高，能够简便、快速地同时测定成品中果糖和葡萄糖的含量，为全面有效的控制热毒宁注射液质量、提高质量控制水平提供依据。

说明书附图

图1，热毒宁注射液(批号120220)中果糖、葡萄糖含量测定色谱图。

图2，不同色谱柱考察色谱图。

发明内容

以下实施例中应用到的仪器及试剂

Agilent1100高效液相色谱仪(Alltech2000ES蒸发光散射检测器)；乙腈、甲醇为色谱纯(进口分装)，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

热毒宁注射液(江苏康缘药业股份有限公司，批号120220)；对照品：D-果糖(批号：111504-200001)、D-无水葡萄糖(批号：110833-200904)均由中国食品药品检定研究院提供。

1.色谱柱考察

精密量取样品溶液10μL注入液相色谱仪，色谱柱分别为WatersCarbohydrate NH₂(3.9×300mm)、Inertsil-NH₂(4.6×250mm)、Phenomenex LunaNH₂(4.6×250mm)和Alltech Prevail^TM Carbohydrate ES(4.6×250mm)，乙腈-水(83：17)为流动相，流速1.2mL/min，漂移管温度95℃，氮气流速2.5L/min，增益值1。

检测结果如图2所示，图2中依次为Waters Carbohydrate NH₂、Inertsil-NH₂、PhenomenexLuna NH₂、Alltech Prevail^TM Carbohydrate ES。可以看出，应用WatersCarbohydrate NH₂，该色谱柱能够得到果糖和葡萄糖较好的分离效果；而Inertsil-NH₂(4.6×250mm)和PhenomenexLuna NH₂(4.6×250mm)不能将葡萄糖和果糖完全分离，而使用Alltech Prevail^TM Carbohydrate ES(4.6×250mm)时，果糖峰形不理想。

2方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：Waters Carbohydrate氨基柱；蒸发光散射检测器：漂移管温度90～100℃，氮气流速2.0～3.0L/min，增益值1；以乙腈-水(75～90：25～10v/v)或甲醇-水(95～85：5～15v/v)为流动相；流速1.0～2.0mL/min；进样量5～15μL；

优选的，色谱柱：Waters Carbohydrate(3.9×300mm)氨基柱；蒸发光散射检测器：漂移管温度95℃，氮气流速2.5L/min，增益值1；以乙腈-水(83：17)为流动相；流速1.2mL/min；进样10μL。

2.2对照品溶液和供试品溶液的制备

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中含果糖0.4056mg、葡萄糖0.8348mg的低浓度对照品溶液。

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中含果糖0.836mg、葡萄糖3.637mg的高浓度对照品溶液。

精密吸取热毒宁注射液1mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3样品测定

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，取120220批热毒宁注射液，按1.2项下所述配制方法，分别精密量取低浓度对照品溶液、高浓度对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按优选的色谱条件测定，记录峰面积，如图1。

2.4线性关系考察

精密量取上述低浓度对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、和10.0mL，分别置于10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得到6个浓度的对照品溶液，各精密量取10μl，依次注入高效液相色谱仪，按优选的色谱条件测定，以对照品进样量(μg)对数X为横坐标，峰面积对数Y为纵坐标，绘制标准曲线。得果糖的回归方程为：Y=1.5513X+5.9234，r=0.9992,线性范围为0.4056μg～4.056μg；葡萄糖回归方程为：Y=1.4818X+5.9806，r=0.9999，线性范围为0.8348μg～8.348μg。

2.5精密度考察

精密量取低浓度对照品溶液适量，加水稀释并制成每毫升含果糖81.12μg、葡萄糖166.96μg的溶液作为超低浓度对照品溶液，标记为对照品溶液A。分别精密量对照品溶液A、低浓度对照品溶液各10μL注入液相色谱仪，按优选的色谱条件测定，连续进样6次。对照品溶液A和低浓度对照品溶液果糖的峰面积RSD分别为2.6％和0.6％，对照品溶液A和低浓度对照品溶液葡萄糖的峰面积RSD分别为1.6％和0.4％，表明在此条件下进样精密度良好。

2.6溶液稳定性考察

分别于0h、1h、2h、4h、8h和12h精密量取2.5项下对照品溶液A、低浓度对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，考察果糖和葡萄糖的峰面积，结果见表1。有结果可以看出，对照品溶液A中果糖和葡萄糖在8h时，峰面积有所降低，故最好在8h内完成测定。

表1稳定性考察试验结果

2.7重复性考察

取热毒宁注射液，按1.2项下配制方法，平行制备6份供试品溶液，按优选的色谱条件测定，结果热毒宁注射液中果糖的平均含量为1.22mg/mL(RSD=1.3％)，葡萄糖的平均含量为7.27mg/mL(RSD=1.1％)，表明此分析方法的重复性较好。

2.8加样回收试验

精密量取热毒宁注射液0.5mL于10mL量瓶中，分别加入高浓度对照品溶液0.8mL、1.0mL、1.2mL，各平行制备3份，加水稀释并定容到刻度，摇匀，按优选的色谱条件测定，结果表明该测定方法回收率良好。结果见表2和表3。

表2果糖加样回收试验结果

表3葡萄糖加样回收试验结果

3不同批次样品测定

按1.2项下所述配制方法，分别精密量取低浓度对照品溶液、高浓度对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按优选的色谱条件测定，记录峰面积，按外标两点法对数方程计算含量，结果见表4。

表4热毒宁注射液葡萄糖及果糖含量测定结果

具体实施例

以下实施例进一步说明本发明技术，但不限于本技术，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现基本相同的技术效果。

【实施例1】

1.1色谱条件

色谱柱：Waters Carbohydrate(3.9×300mm)氨基柱；蒸发光散射检测器：漂移管温度95℃，氮气流速2.5L/min，增益值1；以乙腈-水(83：17v/v)为流动相；流速1.2mL/min；进样10μL。

1.2对照品溶液和供试品溶液的制备

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中含果糖0.4056mg、葡萄糖0.8348mg的低浓度对照品溶液。

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中含果糖0.836mg、葡萄糖3.637mg的高浓度对照品溶液。

精密吸取热毒宁注射液1mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

1.3样品测定

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，取121020批热毒宁注射液，按1.2项下所述配制方法，分别精密量取低浓度对照品溶液、高浓度对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，按优选的色谱条件测定，记录峰面积，按外标两点法对数方程计算含量。

1.4结果

121020批热毒宁注射液每毫升中含有果糖0.90mg、葡萄糖7.11mg。

【实施例2】

2.1色谱条件

色谱柱：Waters Carbohydrate(3.9×300mm)氨基柱；蒸发光散射检测器：漂移管温度90℃，氮气流速2.0L/min，增益值1；以乙腈-水(80：20v/v)为流动相；流速2.0mL/min；进样量15μL。

2.2对照品溶液和供试品溶液的制备

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中含果糖0.3877mg、葡萄糖0.8012mg的低浓度对照品溶液。

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中含果糖0.8105mg、葡萄糖3.549mg的高浓度对照品溶液。

精密吸取热毒宁注射液1mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3样品测定

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，取121212批热毒宁注射液，按2.2项下所述配制方法，分别精密量取低浓度对照品溶液、高浓度对照品溶液及供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，按优选的色谱条件测定，记录峰面积，按外标两点法对数方程计算含量。

2.4结果

121212批热毒宁注射液每毫升中含有果糖0.87mg、葡萄糖7.06mg。

【实施例3】

3.1色谱条件

色谱柱：Waters Carbohydrate(3.9×300mm)氨基柱；蒸发光散射检测器：漂移管温度99℃，氮气流速3.0L/min，增益值1；以甲醇-水(83：17)为流动相；流速2.0mL/min；进样15μL。

3.2对照品溶液和供试品溶液的制备

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中含果糖0.4900mg、葡萄糖0.8833mg的低浓度对照品溶液。

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL中含果糖0.833mg、葡萄糖3.805mg的高浓度对照品溶液。

精密吸取热毒宁注射液1mL，置10mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

3.3样品测定

精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，取130420批热毒宁注射液，按3.2项下所述配制方法，分别精密量取低浓度对照品溶液、高浓度对照品溶液及供试品溶液各15μL，注入液相色谱仪，按优选的色谱条件测定，记录峰面积，按外标两点法对数方程计算含量。

2.4结果

130420批热毒宁注射液每毫升中含有果糖0.94mg、葡萄糖7.19mg。

Claims (5)

1.一种热毒宁注射液中糖类成分含量的检测方法，其特征在于，检测步骤包括：

(1)低浓度对照品溶液制备：精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL溶液中含有果糖0.3～0.5mg、葡萄糖0.8～0.9mg的溶液作为低浓度对照品溶液；

(2)高浓度对照品溶液制备：精密称取果糖和葡萄糖对照品适量，加水溶解并稀释制成每1mL溶液中含有果糖0.8～0.9mg、葡萄糖3.5～4.0mg的溶液作为高浓度对照品溶液；

(3)供试品溶液制备：精密吸取热毒宁注射液，加水稀释、定容，摇匀，作为供试品溶液；

(4)色谱条件：采用Waters Carbohydrate NH₂色谱柱和/或Alltech Prevail^TMCarbohydrate ES色谱柱，蒸发光散射检测器，以乙腈-水或甲醇-水为流动相，流速1.0～2.0mL/min，进样量5～15μL。

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，蒸发光散射检测器中漂移管温度为90～100℃，氮气流速2.0～3.0L/min。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相为体积比为75～90：25～10的乙腈-水或体积比为95～85：5～15的甲醇-水。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的低浓度对照品溶液为每1mL溶液中含有果糖0.3～0.5mg、葡萄糖0.8～0.9mg。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的高浓度对照品溶液为每1mL溶液中含有果糖0.8～0.9mg、葡萄糖3.5～4.0mg。

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