CN102507831B

CN102507831B - 全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的测定方法

Info

Publication number: CN102507831B
Application number: CN201110309072.0A
Authority: CN
Inventors: 黄亦琦; 赵艳丽; 杨辉; 许光辉
Original assignee: MEDICAL AND PHARMACY INST OF XIAMEN CITY
Current assignee: MEDICAL AND PHARMACY INST OF XIAMEN CITY
Priority date: 2011-10-13
Filing date: 2011-10-13
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2031-10-13
Also published as: CN102507831A

Abstract

全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的测定方法，涉及一种全蚕粉。称定1-脱氧野尻霉素对照品各两份，作为对照品液1和2；吸取对照品液1和2，进样；称取待测全蚕粉，加入石油醚，在水浴中加热回流提取，过滤，弃去滤液，挥干石油醚，得产物A；在A中加入甲醇，超声提取，过滤，将滤液浓缩，再置于中性氧化铝柱，洗脱，收集洗脱溶液，蒸干，再用甲醇溶解并定容，作为供试品溶液；对所得的供试品溶液进行HPLC分析，根据峰面积值，用外标两点法计算所用待测全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量。具有精密度较高、重现性和稳定性较好、加样回收率符合要求、方法简便实用等优点，可普及于一般实验室等，并可用于全蚕粉制品中1-脱氧野尻霉素的质量控制。

Description

全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的测定方法

技术领域

本发明涉及一种全蚕粉，尤其是涉及一种采用反相高效液相色谱测定全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的方法。

背景技术

全蚕粉中1-脱氧野尻霉素是其降血糖的主要活性成分。1-脱氧野尻霉素及其衍生物具有高效广泛的药理作用，对糖尿病及其并发症、肥胖症、病毒感染(HIV)等方面有着较显著的治疗效果。如何有效检测1-脱氧野尻霉素产品的质量，创建一种简便、快速、高效的检测1-脱氧野尻霉素含量的方法逐渐成为研究热点之一。测定1-脱氧野尻霉素含量的方法主要有以下四种：

第一种是离子色谱测定法，陈智毅等利用该方法分别对黄血蚕、蚕沙中1-脱氧野尻霉素进行了定量分析。

第二种是反相高效液相色谱-荧光检测法，欧阳臻等、Jin等分别对这种方法进行了研究，并测定了桑叶和全蚕粉中1-脱氧野尻霉素的含量。结果显示，离子色谱测定法具有样品处理简单、易操作等优点，但分离效果和可靠性不够理想；反相高效液相色谱-荧光检测法，具有灵敏度高，结果准确、可靠等优点，但要求的检测器价格昂贵，一般实验室中很少配置，在应用普及方面受到较大限制。

第三种是反相高效液相色谱-紫外检测法，此法虽然所用检测器普及于大多实验室，但是其样品需要柱前衍生化，衍生过程复杂，条件较难把握。

第四种，用蒸发光散射检测器来测定家蚕体内1-脱氧野尻霉素，此种检测器没有紫外检测器和荧光检测器灵敏。因此，探索一种在普通实验室就能进行测定复杂混合物中1-脱氧野尻霉素的含量，并且样品处理较简单的方法是颇有现实意义的工作，既可提供在普通实验室进行1-脱氧野尻霉素的分析，也便于企业进行家蚕药用产品生产过程中的1-脱氧野尻霉素质量检测。为此，探索稳定、准确的检测蚕样品中的1-脱氧野尻霉素含量的方法，研究RP-HPLC-UV方法的具体技术参数，获得稳定准确测定结果，具有重要的现实意义。

采用紫外末端吸收法检测全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量，目前在国内外尚未见报道。

中国专利CNl883513公开一种全蚕粉中降血糖活性物质的分离方法。其分离步骤为首先将全蚕粉与浸提缓冲液按1∶1的比例混匀，置4～8℃环境下浸提、过滤、分离，进行全蚕粉降血糖有效成分的提取；然后将全蚕粉浸提液上离子交换柱层析，进行阳离子交换柱层析，并调整pH值；再洗脱、样品收集、浓缩与干燥。该发明保持了家蚕体内的原有活性物质，降血糖活性成分单一；产出量高，获得率为2.7％。

发明内容

本发明的目的在于提供一种不仅具有精密度较高、重现性和稳定性较好、加样回收率符合要求、方法简便实用等优点，而且可以普及于一般实验室等，并可用于全蚕粉制品中1-脱氧野尻霉素的质量控制的全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的测定方法。

本发明包括以下步骤：

1)称定1-脱氧野尻霉素对照品各两份，作为对照品液1和对照品液2；

2)吸取对照品液1和对照品液2，进样；

3)称取待测全蚕粉，加入石油醚，在水浴中加热回流提取，过滤，弃去滤液，挥干石油醚，得产物A；

4)在产物A中加入甲醇，超声提取，过滤，将滤液浓缩，再置于中性氧化铝柱，洗脱，收集洗脱溶液，蒸干，再用甲醇溶解并定容，作为供试品溶液；

5)对步骤4)所得的供试品溶液进行HPLC分析，根据峰面积值，用外标两点法计算步骤3)所用待测全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量。

在步骤1)中，所述对照品液1的浓度可为0.82mg/mL，对照品液2的浓度可为0.74mg/mL。

在步骤2)中，所述吸取对照品液1和对照品液2的可为各10μl。

在步骤3)中，所述待测全蚕粉每份可为0.5～2g，加入石油醚的量可为15～60mL；所述在水浴中加热回流提取的时间可为0.5～2h。

在步骤4)中，在产物A中加入甲醇的量可为15～60mL；所述超声提取的时间可为0.5～2h；所述将滤液浓缩，可浓缩至1～10mL；所述洗脱可采用0.02mol/L HCl洗脱并调节流速至20～60滴/min。

在步骤5)中，所述HPLC分析可采用包含有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，检测波长可为190～400nm，所用高效液相色谱的固定相为反相色谱柱，柱温可为20～50℃；所述流动相可为水与乙腈的混合液，其中有机相的比例可为20％～90％，以流动相质量为100％计，水在流动相中所占的质量百分比可为10％～80％，优选20％～70％，最好为30％～60％。

本发明的关键点在于，在上述流动相和波长条件下可以很准确地测定将全蚕粉及其制剂中1-脱氧野尻霉素的含量。

本发明的突出优点和技术效果主要体现在以下几方面：

1)所建立的高效液相色谱法具有操作简单、准确度高、专一性强等特点；

2)目前，1-脱氧野尻霉素通用测定方法均需柱前衍生化或者直接用蒸发光散射检测器检测，而本发明所用的检测方法无需柱前衍生化操作，具有高效、快速、低污染的优点；

3)本发明采用紫外末端吸收法检测全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量，目前，在国内外尚未见报道，方法简便、实用，可以普及于一般实验室，测定结果可靠稳定，可用于全蚕粉制品中1-脱氧野尻霉素的质量控制。

附图说明

图1为1-脱氧野尻霉素的标准曲线。在图1中，横坐标为1-脱氧野尻霉素浓度(μg)，纵坐标为峰面积。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量测定方法如下：

称定两份质量为8.20mg和7.40mg的1-脱氧野尻霉素对照品，分别配制成浓度为0.82mg/mL、0.74mg/mL，作为对照品液1和对照品液2。

吸取对照品液1和对照品液2各10μl，各进样一次。

分别称取批号为200801、200802和200803三个批次全蚕粉，各3份，每份1g，分别加入石油醚30mL，在水浴中加热回流提取1h，过滤，弃去滤液，挥干溶剂。加入甲醇30mL，超声提取1h，过滤，将滤液浓缩至3mL，将其置于中性氧化铝柱，用0.02mol/L HCl洗脱，调节流速至40滴/min，收集洗脱溶液100mL，蒸干，甲醇溶解并定容至10mL，作为供试品溶液。

进行HPLC分析，根据峰面积值，用外标两点法计算样品中1-脱氧野尻霉素含量。经计算，全蚕粉样品中1-脱氧野尻霉素含量为0.5957％，不同批次全蚕粉1-脱氧野尻霉素含量测定结果如表1所示。

表1不同批次全蚕粉1-脱氧野尻霉素含量测定

检测波长的选择

1-脱氧野尻霉素分子缺少共轭双键结构，紫外吸收较弱，对其进行紫外检测时需要衍生，或采用末端吸收。本实验在用高效液相色谱仪分析前，分别取供试品及对照品溶液，在190-400nm进行紫外-可见光谱扫描，结果N-甲基-1-脱氧野尻霉在192nm处有末端吸收，实验最终选择203nm为检测波长。

流动相的选择

当采用末端吸收波长进行检测时，色谱流动相采用截止波长低的乙腈(紫外截止波长为190nm)，可减少紫外末端吸收的干扰，因此本实验对乙腈和水的配比进行了优化，分别以乙腈-水(85∶15)、(78∶22)和(75∶25)作为流动相，结果发现当乙腈-水(85∶15)，主峰保留时间为23.618min；乙腈-水(78∶22)时，主峰保留时间为11.487min；乙腈-水(75∶25)时，主峰保留时间为9.325min，但是主成分分离与杂质分离较差。所以最终选择乙腈-水(78∶22)作为流动相。

色谱柱的选择

首先采用以十八烷基键合硅胶为固定相的色谱柱，结果发现1-脱氧野尻霉素在该色谱柱上无保留。分析原因，是由于全蚕粉中1-脱氧野尻霉素结构与糖非常相似，极性很大，C₁₈柱不能有效保留，所以选用氨基色谱柱(Hypersil NH₂色谱柱)，对色谱条件进行了优化，能够将杂质和1-脱氧野尻霉素很好分离。

标准曲线绘制

精密称取1-脱氧野尻霉素对照品适量于容量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀得浓度为1mg/mL的1-脱氧野尻霉素标准液。

依次吸取2mL、4mL、6mL、8mL、10mL标准液(浓度为1mg/mL)，置10mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀。分别吸取10μl，按上述色谱条件分别测定，全蚕粉1-脱氧野尻霉素浓度与峰面积的关系结果如表2所示。

表2全蚕粉1-脱氧野尻霉素浓度与峰面积的关系

以色谱峰面积为纵坐标，1-脱氧野尻霉素浓度为横坐标，绘制标准曲线如图1所示，以1-脱氧野尻霉素浓度对峰面积进行回归分析，得出其回归方程为：Y＝261320x，相关系数r＝0.9996，结果表明，1-脱氧野尻霉素浓度在2～10μg范围内，其浓度与对应的峰面积呈现良好线性关系，在此范围内据峰面积来计算其含量是可靠的。

重现性试验

称取中性氧化铝(100目)粉末约10g，用0.02mol/LHCL洗脱液20mL湿润，充分搅拌后一次性装入规格为1.5cm×20cm的玻璃层析柱，不断轻敲管壁，使均匀紧密，用洗脱液50mL淋洗，封柱，待用。

称取待测全蚕粉1g，加入石油醚30mL，在水浴中加热回流提取1h，过滤，弃去滤液，挥干溶剂。精密加入甲醇30mL，超声提取1h，过滤，将滤液浓缩至3mL，将其置于中性氧化铝柱，用0.02mol/L HCl洗脱，调节流速至40滴/min，收集洗脱溶液100mL，蒸干，甲醇溶解并定容至10mL，作为供试品溶液。

取全蚕粉6份，每份约1g，精密称量后按样品含量测定方法操作，进行HPLC分析，根据峰面积值，用外标两点法计算样品中1-脱氧野尻霉素含量。6次测定1-脱氧野尻霉素的平均含量为0.5932％，其RSD＝2.11％。此结果表明，本发明的重现性良好，重现性试验结果见表3。

表3重现性试验结果

稳定性试验

精密吸取同一浓度供试品液10μl，每隔12h进样一次，共进5次，记录峰面积值，结果在72h内测定1-脱氧野尻霉素含量的RSD＝1.47％(参见表4)，表明供试品中的1-脱氧野尻霉素在72h内稳定。

表4稳定性试验结果

加样回收率试验

取已知含量的全蚕粉6份，每份约0.5g，精密称量后分别加入对照品2.0012mg按2.2.2方法操作，进行HPLC分析，测定1-脱氧野尻霉素含量，计算加样回收率，结果见表5平均回收率为97.21％，RSD＝2.55％。此结果表明，本测定方法符合加样回收率的要求。

表5全蚕粉1-脱氧野尻霉素回收率试验

Claims

1.全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的测定方法，其特征在于包括以下步骤：

1）称定1-脱氧野尻霉素对照品各两份，作为对照品液1和对照品液2；

2）吸取对照品液1和对照品液2，进样；

3）称取待测全蚕粉，加入石油醚，在水浴中加热回流提取，过滤，弃去滤液，挥干石油醚，得产物A；所述待测全蚕粉每份为0.5～2g，加入石油醚的量为15～60mL；

4）在产物A中加入甲醇，超声提取，过滤，将滤液浓缩，再置于中性氧化铝柱，采用0.02mol/L HCl洗脱并调节流速至20～60滴/min，收集洗脱溶液，蒸干，再用甲醇溶解并定容，作为供试品溶液；在产物A中加入甲醇的量为15～60mL；

5）对步骤4）所得的供试品溶液进行紫外末端吸收检测分析，根据峰面积值，用外标两点法计算步骤3）所用待测全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量；所述紫外末端吸收检测分析是采用包含有紫外检测器的高效液相色谱仪进行检测，检测波长为190～400nm，所用高效液相色谱的固定相为氨基色谱柱，柱温为20～50℃；所述流动相为水与乙腈的混合液，其中乙腈的比例为78%，以流动相质量为100%计，水在流动相中所占的质量百分比为22%。

2.如权利要求1所述的全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的测定方法，其特征在于在步骤1）中，所述对照品液1的浓度为0.82mg/mL，对照品液2的浓度为0.74mg/mL。

3.如权利要求1所述的全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的测定方法，其特征在于在步骤2）中，所述吸取对照品液1为10μl，所述对照品液2为10μl。

4.如权利要求1所述的全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的测定方法，其特征在于在步骤3）中，所述在水浴中加热回流提取的时间为0.5～2h。

5.如权利要求1所述的全蚕粉中1-脱氧野尻霉素含量的测定方法，其特征在于在步骤4）中，所述超声提取的时间为0.5～2h；所述将滤液浓缩，是浓缩至1～10mL。