CN103940918A

CN103940918A - 一种同时检测动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的方法

Info

Publication number: CN103940918A
Application number: CN201310024689.7A
Authority: CN
Inventors: 李冰; 张继瑜; 周绪正; 牛建荣; 魏小娟; 李金善; 李剑勇; 杨亚军; 刘希望; 张�杰
Original assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Current assignee: Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine CAAS
Priority date: 2013-01-23
Filing date: 2013-01-23
Publication date: 2014-07-23

Abstract

本发明公开了一种检测动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的测定方法。其步骤是先用溶剂提取血浆样品，所得样品液用固相萃取技术处理，将上述处理好的固相萃取小柱，用醋酸和甲醇醋酸溶液冲洗，最后用乙酸乙酯和1-氯丁烷洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，残渣用甲醇溶解，即得供试品溶液，用HPLC-MS/MS进行准确测定羊血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素的含量。青蒿琥酯最低检测线为0.1ng·mL^-1，二氢青蒿素最低检测线为1ng·mL^-1。本发明减少了杂质的影响，富集了样品浓度，专属性强，分离效果好，方法线性、稳定性、重现性、回收率试验均达较好的技术要求，该方法为药物在生物体内的药物代谢动力学及生物等效性研究奠定了方法学基础。

Description

一种同时检测动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的方法

技术领域

本发明属于药物分析领域涉及一种运用固相萃取前处理技术和高效液相色谱-串联质谱联用（HPLC-MS/MS）法同时测定动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的方法。

背景技术

在亚洲和非洲国家青蒿素及其衍生物青蒿琥酯等被广泛用于疟疾的治疗，特别是恶性疟原虫的治疗。青蒿琥酯及其在体内的代谢产物二氢青蒿素血药浓度的检测方法在国内未见报道。目前报道的青蒿琥酯含量的检测方法主要有HPLC-UV检测、电化学检测、HPLC-蒸发光检测。但由于青蒿琥酯的分子结构决定了它的紫外吸收很弱，紫外检测限高，很难满足生物样品检测的要求，并且检测方法复杂，操作困难。为了解决血浆样品中青蒿琥酯及二氢青蒿素的含量测定问题，必须同时在生物样品前处理过程和分析检测技术中寻求突破，提高检测的灵敏度和准确性。

固相萃取技术是一种样品预处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术相结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩，与传统的液液萃取法相比较可以提高分析物的回收率，更有效的将分析物与干扰组分分离，减少样品预处理过程，得到高纯度和浓缩的分离物。

HPLC—MS/MS(液相色谱-串联质谱)联用技术是当前比较新颖的技术，因其结合了液相色谱的高效分离能力和质谱的准确定性能力，近年来成为最可靠实用的分析手段。该分析技术需样量少、检测限低，尤其适用于药物在机体代谢等因素的作用下所产生的分解物或代谢物的结构研究和量的变化。

发明内容

鉴于上述，本发明的目的在于提供一种同时检测动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的测定方法。该方法将固相萃取前处理技术与高效液相色谱-串联质谱联用技术联合使用，成功排除了复杂生物样品体系中杂质对青蒿琥酯及二氢青蒿素含量测定的干扰，能准确的同时测定动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素的含量。

本发明目的是通过以下技术方案来实现：

一种同时检测动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的方法，其步骤是：

a. 精密称取青蒿琥酯标准品、二氢青蒿素标准品，分别置于棕色容量瓶中，用色谱甲醇或乙腈配制得标准品溶液；精密称取青蒿素标准品，置于棕色容量瓶中，用色谱甲醇或乙腈配制得内标溶液；

b. 取动物空腹静脉血浆，加入上述a得到的标准品溶液和内标溶液，涡旋混合40-50s，得血浆样品；取给药后的动物血浆，加入内标溶液，涡旋混合40-50s，得供试样品；

c. 将b步骤所得的血浆样品和供试样品分别加入2倍体积乙腈沉淀蛋白，涡旋震荡30-40s，离心，取上清液；

d. 固相萃取小柱处理（Waters Oasis HLB固相萃取小柱），加1ml甲醇和1ml 1M醋酸冲洗，再用1ml甲醇冲洗，备用；

e. 将c步骤得到的上清液分别上处理好的固相萃取小柱，用1M醋酸和20%甲醇醋酸溶液冲洗，最后用乙酸乙酯和1-氯丁烷(V:V=2:3)洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，残渣用甲醇或乙腈溶解，即得标准血浆溶液和供试品溶液，备用；

f. 高效液相色谱-串联质谱联用（HPLC-MS/MS）测定供试品溶液，测定条件用碳十八烷基键合硅胶固定相色谱柱，流动相A:B=60:40（v:v），其中A:乙腈；B：纯净水（1mmol乙酸铵，0.1%甲酸，0.02%乙酸），流速0.4mL· min^-1，电喷雾离子化（ESI）模式，正（+）离子多反应监测，毛细管出口端电压：45v；碰撞能量：25v；deta EMV+：200v；干燥气体（N₂）流速10L·min^-1，喷雾器30psi，气体温度350℃，毛细管电压 4000 V。

g. 将e得到的标准血浆溶液和供试品溶液按f所述色谱质谱条件进样，得到总离子流图和质谱图，测定峰面积。分别以青蒿琥酯和二氢青蒿素浓度（X）为横坐标，青蒿琥酯、二氢青蒿素分别与内标青蒿素的峰面积比值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程，计算待测物浓度。

上所述固相萃取小柱填料可为键合硅胶填料，或为聚合物吸附填料，或为石墨碳反相填料。

上述固相萃取小柱填料为由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体聚合成的大孔共聚物填料。

上述动物可为羊，牛。

本发明的优点：

1、本发明采用对供试样品应用固相萃取技术处理后，复杂生物样品中微量的被测组分萃取完全并达到了很好的富集，得到了高纯度和浓缩的分离物。方法可靠，回收率在95%左右，RSD(%)小于3%，满足分析检测要求。

2、本发明采用将HPLC-MS/MS技术应用于动物血浆中青蒿琥酯及其代谢产物的检测，被测组分检测灵敏度提高，检测限低（青蒿琥酯最低检测线为0.1 ng·mL^-1 ，二氢青蒿素最低检测线为1ng·mL^-1），青蒿琥酯、青蒿素及二氢青蒿素峰分离度好，峰形好，分析时间短（9分钟之内完成整个检测），需样量少（仅需1μl），溶剂用量少，成本低，含量测定结果准确，重复性、稳定性好。

3、二氢青蒿素是青蒿琥酯在体内的活性代谢产物，采用本发明的方法，能方便快捷、准确的同时检测动物血浆中原药青蒿琥酯及其代谢物二氢青蒿素的含量，为青蒿琥酯在动物体内的药代动力学和生物等效性研究奠定了方法学基础。

附图说明

图1为本发明空白血浆总离子流图（TIC图）。

图2为本发明青蒿琥酯、二氢青蒿素及青蒿素在血浆样品中的总离子流图（TIC图）。

图3为本发明青蒿琥酯母离子扫描图。

图4为本发明二氢青蒿素母离子扫描图。

图5为本发明青蒿素母离子扫描图。

具体实施方式

下面列举实施例进一步详细说明本发明，该实施例仅用于说明本发明而对本发明并没有限制。

实施例：

本发明使用的青蒿琥酯纳米乳（主要成份为青蒿琥酯，辅料为油酸乙酯、吐温-80、正丁醇、超纯水，产地：兰州）是兰州畜牧与兽药研究所自主研制的新型抗动物寄生虫兽药（国家发明专利号：ZL 200810150303.4），在兽医临床上主要用于治疗牛羊泰勒焦虫病，疗效显著。

1、仪器

Agilent 1200/6410 Triple Quad LC/MSMS；C18色谱柱（大连依利特公司）；OASiS HLB固相萃取柱；美国Millipore水纯化系统；KL512型氮吹仪（北京康林科技有限责任公司产品）；Thermo离心机，涡旋振荡仪（Heros BIO）；针筒式微孔滤膜过滤器（上海兴亚净化材料厂产品，孔径0.22μm）。

2、药品与试剂

青蒿琥酯纳米乳（兰州畜牧与兽药研究所自主研制）；青蒿琥酯标准品、青蒿素标准品、二氢青蒿素标准品均购自中国药品生物制品检定所；冰乙酸（分析纯，上海中美化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，天津市光复精细化工研究所）；甲醇（分析纯，天津市百世化工有限公司）；乙酸乙酯（色谱纯，国药集团）；乙酸铵（分析纯，国药集团）；甲酸（分析纯，国药集团）；1-氯丁烷（分析纯，国药集团）。

3、分析条件

3.1液相色谱条件：ODS色谱柱（250×4.6mm，5μm）；流动相A：B=60:40（v：v），其中A:乙腈；B：纯净水（1mmol乙酸铵，0.1%甲酸，0.02%乙酸），流速0.4mL· min^-1 ,进样量1μL，柱温室温。

3.2质谱条件：电喷雾离子化（ESI）模式，检测离子为正（+）离子，多反应监测，干燥气体（N₂）流速10L·min^-1，喷雾器30psi，气体温度350℃，毛细管电压 4000 V。

4、标准溶液的配制

4.1对照品溶液：精密称取青蒿琥酯、二氢青蒿素各1mg，分别置于100mL棕色容量瓶中，用色谱甲醇配制成浓度为10μg·mL^-1的储备液。分别取该两种储备液置于10mL容量瓶中，用甲醇配制成浓度为1μg·mL^-1的青蒿琥酯和1μg·mL^-1二氢青蒿素的对照品混合溶液。由于其在室温下暴露在空气中不稳定，置于-80℃冰箱保存。

4.2内标溶液：精密称取青蒿素 1mg，置于100mL棕色容量瓶中，用色谱甲醇配制成浓度为10μg·mL^-1的储备液。取该储备液置于10mL容量瓶中，加甲醇配制成1μg·mL^-1的内标溶液。

5、血样采集及处理

5.1动物给药

取健康成年小尾寒羊1只，分别在给药前称重、禁饲。取1.5%的青蒿琥酯纳米乳，通过肌肉注射给药，给药剂量为5mg/kg体重。

5.2空白血浆的采集

在给药前使用一次性EDTA真空采血管颈静脉采集小尾寒羊血液，采血量为5 ml，离心10 min，分离血浆，吸取上清液，得得空白血浆，于离心管中保存在-20 ℃待分析。

5.3 血浆样品的采集

在给药后30min使用一次性EDTA真空采血管颈静脉采集小尾寒羊血液，采血量为5 ml，离心10 min，分离血浆，吸取上清液，得血浆样品，于另一离心管中保存在-80 ℃待分析。

6、空白血浆溶液和标准血浆样品溶液的制备

取固相萃取小柱（Waters Oasis HLB固相萃取小柱），加1ml甲醇和1ml 1M醋酸冲洗，再用1ml甲醇冲洗，备用。

精密吸取1mL空白血浆，加入1ml乙腈，涡旋震荡30s，离心10min，取上清液上处理好的固相萃取小柱，用1M醋酸和20%甲醇醋酸溶液冲洗，最后用乙酸乙酯和1-氯丁烷（V:V=2:3）洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，在干燥的提取物中加入250mL甲醇复溶，得空白血浆溶液，备用。

精密吸取1mL空白血浆，加入10μL 对照品混合溶液，再加入10μL内标溶液，混匀，加入1ml乙腈，涡旋震荡30s，离心10min，取上清液上处理好的固相萃取小柱，用1M醋酸和20%甲醇醋酸溶液冲洗，最后用乙酸乙酯和1-氯丁烷（V:V=2:3）洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，在干燥的提取物中加入250mL甲醇复溶，得标准血浆样品溶液，备用。

7、供试品溶液的制备

精密吸取1ml血浆样品，加入10μl内标溶液，混匀，加入1ml乙腈，涡旋震荡30s，离心10min，取上清液上处理好的固相萃取小柱，用1M醋酸和20%甲醇醋酸溶液冲洗，最后用乙酸乙酯和1-氯丁烷（V:V=2:3）洗脱，收集洗脱液，氮气吹干，在干燥的提取物中加入250mL甲醇复溶，备用。

8、标准曲线与最低检测限

分别配置0.5,1,2,4,10,12,16μg·ml^-1的青蒿琥酯和二氢青蒿素的标准混合溶液，按步骤“6”操作下进行处理，按“3”项下色谱质谱条件进样，测定峰面积。青蒿琥酯和二氢青蒿素浓度（X）为横坐标，以青蒿琥酯、二氢青蒿素分别与内标青蒿素的峰面积比值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程。

分别配置不同浓度的青蒿琥酯和二氢青蒿素的标准混合溶液，按步骤“6”操作下进行处理，按“3”项下色谱质谱条件进样，分别测定青蒿琥酯和二氢青蒿素的最低检测限（S/N=3）。

9、精密度与准确度

配制高、中、低三种浓度的青蒿琥酯和二氢青蒿素标准混合溶液，处理方法同“6”，得到三种浓度(5、40、100 ng·ml^-1)的血浆样品溶液，按”3”色谱质谱条件进样，三种浓度样品在1天内连续进样5次，连续5天进样，进行浓度测定，计算日内变异系数、日间变异系数。

10、回收率

取1ml血浆样品（n=6），分别精密加入高、中、低三种浓度为5、40、100 ng·ml^-1的标准品溶液各1ml，处理方法同“6”，按”3”色谱质谱条件进样，分别计算低、中、高3种浓度的回收率。

11、含量测定

分别吸取空白血浆溶液、标准血浆样品溶液和供试品溶液各10μl，用0.22μm微孔滤膜过滤后进HPLC-MS/MS分析。

12、结果

12.1方法专属性

空白血浆溶液、标准血浆样品溶液和供试品溶液按“3”所述述色谱质谱条件分别进行测定，得到的总离子流图见图1-2。从图中可以看出血浆中的内源性物质及其他杂质不干扰样品的测定，AS、DHA、AR三者分离良好，保留时间分别为5.2、6.2、7.8min，分析时间短。

标准血浆样品溶液按“3”所述述色谱质谱条件分别进行测定，得到的质谱图见图3-5。从图中分析得，青蒿琥酯、二氢青蒿素和青蒿素在ESI正离子模式下形成的质子化分子是[M+Na]⁺，母离子分别为[407.2]⁺、[307.2]⁺和[305.2]⁺。

12.2线性关系考察

分别以青蒿琥酯、二氢青蒿素与青蒿素峰面积比值为纵坐标，青蒿琥酯和二氢青蒿素浓度为横坐标做线性回归，得青蒿琥酯回归方程y=0.0467x-0.0162，R²=0.9990；二氢青蒿素回归方程y=0.0068x+0.073，R²=0.9992。线性范围为5-160ng·mL^-1，青蒿琥酯最低检测线为0.1 ng·mL^-1 ，二氢青蒿素最低检测线为1ng·mL^-1。

12.3精密度与准确度

对高、中、低三个浓度的血浆样品的日内、日间精密度进行考察，结果表明，在本试验条件下该方法准确、可靠、重现性好。结果见表1。

表1 青蒿琥酯、二氢青蒿素在血浆样品中测定的精密度

12.4 回收率

试验结果表明，本试验条件下该方法的回收率满足测定要求（回收率%在92.99%-95.11%，RSD(%)小于3%）。结果见表2。

表2 青蒿琥酯、二氢青蒿素在血浆样品中的回收率

12.5含量测定

取20110614、20110615、20110616 3个不同批次的青蒿琥酯纳米乳，分别对羊通过肌肉注射给药，用HPLC-MS/MS法测定其血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素的含量。结果：青蒿琥酯、青蒿素及二氢青蒿素峰分离度好，峰形好，日内、日间变异系数RSD(%)均小于3%，表明本发明方法可准确测定血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素的含量，方法稳定可靠。结果见表3。

表3 羊血浆中青蒿琥酯、二氢青蒿素含量测定结果

Claims

1.一种同时检测动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的方法，其步骤是：

b. 取动物空腹静脉血浆，加入上述a得到的标准品溶液和内标溶液，涡旋混合40-50s，得血浆样品；动物给药后取静脉血浆，加入上述a得到的内标溶液，涡旋混合40-50s，得供试样品；

d. 固相萃取小柱处理为取固相萃取小柱，加1ml甲醇和1ml 1M醋酸冲洗，再用1ml甲醇冲洗，备用；

f. 高效液相色谱-串联质谱联用（HPLC-MS/MS）测定供试品溶液，测定条件用碳十八烷基键合硅胶固定相色谱柱，流动相A:B=60:40（v:v），其中A:乙腈；B：纯净水（1mmol乙酸铵，0.1%甲酸，0.02%乙酸），流速0.4mL· min^-1，电喷雾离子化（ESI）模式，正（+）离子多反应监测，毛细管出口端电压：45v；碰撞能量：25v；deta EMV+：200v；干燥气体（N₂）流速10L·min^-1，喷雾器30psi，气体温度350℃，毛细管电压 4000 V；

g. 将e得到的标准血浆溶液和供试品溶液按f所述色谱质谱条件进样，得到总离子流图和质谱图，测定峰面积，分别以青蒿琥酯和二氢青蒿素浓度（X）为横坐标，青蒿琥酯、二氢青蒿素分别与内标青蒿素的峰面积比值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程，计算待测物浓度。

2.根据权利要求1所述一种同时检测动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的方法，其特征在于，所述固相萃取小柱填料可为键合硅胶填料，或为聚合物吸附填料，或为石墨碳反相填料。

3.根据权利要求1所述一种同时检测动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的方法，其特征在于，所述固相萃取小柱为Waters Oasis HLB固相萃取小柱，填料为由亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮两种单体聚合成的大孔共聚物填料。

4.根据权利要求1所述一种同时检测动物血浆中青蒿琥酯及二氢青蒿素含量的方法，其特征在于，所述动物可为羊，牛。