CN101162228B - 一种测定人血浆和/或血清中重组双功能水蛭素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆/血清中重组双功能水蛭素的分析方法。本方法采用超滤法分离蛋白，解决了水溶性的水蛭素和蛋白的分离问题；采用冷冻干燥技术，使血样中微量的水蛭素得以富集；采用质谱检测器，明显提高了检测的选择性和灵敏度；整个色谱分析过程时间为15min以内。本方法样品取样少，前处理简单、快速、灵敏，分析周期短，可使水蛭素测定的选择性提高，灵敏度提高两个数量级，适合于重组双功能水蛭素体内药物的浓度测定。本方法还可对游离重组双功能水蛭素的浓度进行测定。

Description

一种测定人血浆和/或血清中重组双功能水蛭素的方法 

技术领域

本发明属于医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆/血清中重组双功能水蛭素的方法。 

背景技术

水蛭素是一种特异的凝血酶抑制剂，它能与血浆中游离的和与纤维蛋白结合的凝血酶结合，以防止血栓形成。由于其抗栓抗凝作用优于传统抗凝药肝素，因此具有广阔的应用前景。目前已通过基因工程技术获得重组水蛭素。 

重组双功能水蛭素(RGD-Hirudin)是一种新型高效的抗凝血药物，目前处于临床I期研究阶段，为了开展该药物的体内药动学研究，体内药物的浓度测定是关键的技术之一。 

目前国内外有关测定水蛭素的方法主要采用凝血酶时间测定法(TT法)、APTT测定法、生物底色法、蝰蛇毒凝血时间测定法(ECT法)、放射免疫法、酶联免疫法(EMIT)以及荧光标记测定法等。上述这些方法存在种种缺陷：如操作繁琐费时，效率低，选择性差，灵敏度低等。由于水蛭素是水溶性物质，将其从血浆中分离存在很大的困难，迄今未见有效的方法将其分离并浓缩，也使血浆中低浓度的有关水蛭素药物的定量分析无法实现。 

发明内容

本发明的目的是提供一种准确、灵敏测定人血浆中水蛭素浓度的方法，具体涉及一种测定人血浆和/或血清中重组双功能水蛭素的方法。 

本方法对血浆或血清样品进行定量分取，用超滤法分离出超滤液，超滤液经冷冻干燥，复溶解后进色谱柱分离，经色谱柱分离后，用质谱检测器检测，进行血浆/血清中水蛭素浓度的测定。 

本方法具有准确、灵敏，选择性好，血浆用量少等优点，适合该水蛭素药物的体内浓度测定和体内过程的研究。 

本发明方法通过下述方法和步骤进行： 

对待测样品经过预处理后，利用超滤技术将蛋白从药物中分离出来，采用乙腈∶0.1甲酸为流动相，梯度洗脱，质谱检测；包括以下步骤： 

(1)蛋白分离 

水溶性的水蛭素样品与血浆蛋白的分离：以20％甲酸水溶液酸化并稀释血样，混匀后置于超滤管(Millipore，50K)于4000g，25℃条件下超滤20min； 

(2)样品富集 

水蛭素的浓缩：超滤液置于1.5ml Eppendorf管中，-70℃条件下冷冻干燥，完全冻干后取出；-70℃条件下保存； 

(3)样品分析 

将冻干后的样品取出，加入10％甲酸50μl复溶解，10μl进样做LC/MS分析； 

色谱条件：采用填料为十八烷基键合相硅胶为填料的液相色谱柱，高效液相系统采用通用型高压泵，流动相采用甲醇和0.1％甲酸溶液，梯度洗脱； 

质谱条件：单级四极杆质谱检测器，电喷雾离子源(ESI)，正离子模式下选择离子监测(M/Z 1433)，干燥气流速：13L/min，雾化气压力：50psig，干燥气温度：350℃，碎片电压：220V，毛细管电压：5500V，内标法定量。 

所述的待测样品为人血浆和/或血清； 

所述的色谱条件其中色谱柱采用Agilent Extend C₁₈分析柱(150×2.1mm，i.d.，5μm)；柱温为35℃；流动相是甲醇-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱，流速为0.3ml/min；质谱条件采用电喷雾离子化，采集正离子。 

本方法可用于血浆/血清中水蛭素定量测定。 

本方法样品取样少，前处理简单、快速、灵敏，分析周期短，可使水蛭素测定的选择性和灵敏度均得到明显的提高，使重组双功能水蛭素的灵敏度提高两个数量级，可对游离重组双功能水蛭素的浓度进行测定，适合于重组双功能水蛭素体内药物的浓度测定。本方法还可对游离重组双功能水蛭素的浓度进行测定。 

本发明方法具有如下优点：采用超滤法分离蛋白，解决了水溶性的水蛭素和蛋白的分离问题；采用冷冻干燥技术，使血样中微量的水蛭素得以富集；采用质谱检测器，大大提高了检测的选择性和灵敏度；整个色谱分析过程时间为15min以内。重组双功能水蛭素的最低检出量为25ng/ml血浆。线性范围为25～250μg·L^-1，线性相关系数良好，方法回收率大于50％，RSD小于10％。 

附图说明

图1是典型色谱图，其中， 

上图为空白血浆；中图为空白血浆+标准品；下图为血浆供试品； 

1为重组双功能水蛭素，2为硫酸奎宁(I.S.)。 

具体实施方式

实施例1 

高效液相色谱质谱联用条件 

Agilent1100 LC/MSD系统：G1312A二元泵、G1312A自动进样器、G1946D质谱检测器、AgilentLC-MS色谱工作站；色谱柱：Zorbax Extend C₁₈(150mm×2.1mm，5μm)；柱温：35℃；流动相：乙腈∶0.1％甲酸水溶液，梯度洗脱(梯度程序设置为：乙腈0％-90％0-15min)，流速：1.0mL·min^-1；ESI离子源(正离子检测，M/Z 1433)，干燥气流速：13L/min，雾化气压力：30psig，干燥气温度：350℃，碎片电压：220V，毛细管电压：5500V。 

色谱行为 

空白血浆、加样血浆的色谱图见图1。从图中可见，内标和重组双功能水蛭素的典型色谱保留时间分别为6min和10min。血浆内源性杂质对样品的测定无干扰，两者峰形良好，分离完全。整个色谱分析过程时间为15min以内。 

样品前处理 

取待测血浆样品适量，加入3倍于样品量的20％甲酸水溶液，混匀后置于超滤管(Millipore，50K)于4000g，25℃条件下超滤20min。精密吸取超滤液300μl置于1.5mlep管中，-70℃条件下冷冻干燥，完全冻干后取出，加入流动相100μl复溶解，5μl进样做LC/MS分析。 

线性试验 

分别精密吸取1000，100，10mg·L^-1重组双功能水蛭素标准工作液，用空白血浆稀释定容至5mL，配制成含重组双功能水蛭素0.025，0.05，0.1，0.2，0.5，1，2.5，5μg·L^-1的系列血样，各取血清150μL，按“血浆样品预处理”方法操作。以重组双功能水蛭素与内标峰面积比(A)和重组双功能水蛭素的浓度(C)作加权(1/C^r)线性回归，得标准曲线回归方程为：A＝0.1307 C-2.848×10^-3 r＝0.9999，线性范围为0.025～5μg·L^-1。重组双功能水蛭素的最低检测限(LOD，信噪比＞3)为0.025μg·L^-1。精密度和回收率试验 

精密吸取重组双功能水蛭素标准工作液，用空白血浆配制成含重组双功能水蛭素0.025，0.1，0.5，2.5μg·L^-1的系列血样，各取血浆150μL，按“血浆样品预处理”方法操作。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值及相对标准偏差(RSD)表示，(C实测/C理论)×100％即为回收率。 

表1是血浆中重组双功能水蛭素浓度的日内、日间精密度和方法回收率。 

表1 

Claims (3)

1.一种测定人血浆和/或血清中重组双功能水蛭素的方法，其特征是采用超滤法和冷冻干燥法对待测样品进行预处理，在分析色谱柱分离后用质谱检测器检测，包括以下步骤：

(1)蛋白分离

水溶性的水蛭素样品与血浆蛋白的分离：以20％甲酸水溶液酸化并稀释血样，混匀后置于超滤管Millipore，50K于4000g，25℃条件下超滤20min；

(2)样品富集

水蛭素的浓缩：超滤液置于1.5ml Eppendorf管中，-70℃条件下冷冻干燥，完全冻干后取出，-70℃条件下保存；

(3)样品分析

将冻干后的样品取出，加入10％甲酸50μl复溶解，10μl进样做LC/MS分析，

色谱条件：采用填料为十八烷基键合相硅胶为填料的液相色谱柱，高效液相系统采用通用型高压泵，流动相采用甲醇和0.1％甲酸溶液，梯度洗脱；

质谱条件：单级四极杆质谱检测器，电喷雾离子源，正离子模式下选择离子监测M/Z 1433，干燥气流速：13L/min，雾化气压力：50psig，干燥气温度：350℃，碎片电压：220V，毛细管电压：5500V，内标法定量。

2.根据权利要求1所述的测定人血浆和/或血清中重组双功能水蛭素的方法，其特征是所述的待测样品为人血浆或血清。

3.根据权利要求1所述的测定人血浆和/或血清中重组双功能水蛭素的方法，其特征是所述的步骤(3)的色谱条件其中色谱柱采用Agilent Extend C₁₈分析柱150×2.1mm，i.d.，5μm；柱温为35℃；流动相是甲醇-0.1％甲酸水溶液梯度洗脱，流速为0.3ml/min；质谱条件采用电喷雾离子化，采集正离子。

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