CN101430307B - 一种同时分析氨基酸和有机酸代谢物谱的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种尿液中同时分析氨基酸和有机酸代谢物谱的方法，是将生物样本经常规沉蛋白处理后，采用毛细管电泳为分离手段，检测器选择通用性强、灵敏度高的质谱检测器。本发明方法具有良好的精密度和回收率，是一种不需要衍生化步骤，操作简单，灵敏度高，选择性好，普适性强的能够同时测定生物样品中22种氨基酸和5种有机酸的分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及色谱分析技术，特别提供了一种通过毛细管电泳-质谱联用法同时分析生物样品中氨基酸和有机酸代谢物谱的方法。
背景技术
氨基酸和有机酸是代谢组学研究中重要的代谢物，与糖、脂、蛋白质和核酸的代谢密切相关，研究表明人体内氨基酸和有机酸的浓度变化与多种疾病有密切关系。现有检测氨基酸的方法主要是以离子交换色谱、高效液相色谱、气相色谱、毛细管电泳等为分离手段，以紫外或荧光检测器为检测方法，由于氨基酸和有机酸大都紫外吸收较弱或无紫外吸收，不易气化，因此用前述四种方法时均需要衍生化步骤，操作繁琐，分析时间长或灵敏度低，难以同时检测常见的几十种氨基酸和有机酸。
发明内容
本发明针对上述技术存在的不足，提供一种尿液中同时分析氨基酸和有机酸代谢物谱的方法。本发明方法是将生物样本经常规沉蛋白处理后，采用毛细管电泳为分离手段，检测器选择通用性强、灵敏度高的质谱检测器。本发明通过以下步骤实现：
(1)样品预处理
取样品(尿液)200μL，加入20μL内标液及400μL甲醇，于旋涡混合器上混合5min，12000r/min离心10min，移取500μL上清液，于离心浓缩仪离心浓缩至干，残渣加入200μL水溶解后，12000r/min离心10min取上清液进样分析(用于标准曲线试验的标准品溶液处理方式同样品)。
标准品和内标溶液制备：分别取各氨基酸、有机酸标准品适量，精密称定，用水或含一定浓度氨水的水溶液溶解。作为标准品储备溶液。低浓度的标准品溶液通过用适量水稀释储备溶液得到。取适量盐酸巴马汀标准品，精密称定，用水溶解，作为内标储备液。
(2)毛细管电泳-质谱联用法测定
A.毛细管电泳条件：缓冲液含有3.0-6.0％甲酸和2.5-15％甲醇，分离电压为15-18kV，分离温度为25℃，程序进样：50mbar压力下进14％的浓氨水(v/v)0-3秒后，再于50mbar压力下进样品溶液40秒，
B.质谱条件：SIM模式检测，鞘液为含80-90％甲醇和0.05％甲酸的溶液，流速为3μL/min，雾化气压力为2-4psig，干燥气流速和温度分别为7-8L/min和250-275℃，毛细管电压为4500V，各氨基酸、有机酸及内标碎片电压均为10-70V。
本发明是一种不需要衍生化步骤，操作简单，灵敏度高，选择性好，普适性强的能够同时测定生物样品中22种氨基酸和5种有机酸的分析方法。本发明的方法具有良好的精密度(日内：4.96-14.93％，日间：6.22-14.03％)和回收率(高浓度：83.62-111.41％，中浓度：81.73-105.50％，低浓度：80.17-110.94％)，检测限为0.80-2562ng/mL。
附图说明
图1是22种氨基酸和5种有机酸标准品混合溶液的总离子流色谱图(TIC)。
图2是22种氨基酸和5种有机酸标准品混合溶液的选择离子色谱图。
图3是正常人尿液中氨基酸和有机酸代谢物谱分析的总离子流色谱图(TIC)。
图4是正常人尿液中氨基酸和有机酸代谢物谱分析的选择离子色谱图。
图5是乳腺癌病人尿液中氨基酸和有机酸代谢物谱分析的总离子流色谱图(TIC)。
图6是乳腺癌病人尿液中氨基酸和有机酸代谢物谱分析的选择离子色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的描述。
实施例1
样品预处理：取混合标准品溶液200μL，加入400μL甲醇，于涡旋混合器上混合2min，12000r/min离心10min，移取500μL上清液，于离心浓缩仪离心浓缩至干，残渣加入200μL水充分溶解后，12000r/min离心10min取上清液进样分析。
标准品和内标溶液制备：分别取各氨基酸、有机酸标准品约1.0-8.0mg，精密称定，用水或含一定1％浓度氨水的水溶液溶解，制成浓度分别为1.0-8.0mg/mL的标准品储备溶液。临用前，用水稀释成一系列浓度的标准品溶液。取盐酸巴马汀标准品约1.0mg，精密称定，用水溶解，制成浓度为0.01mg/mL的内标溶液。
毛细管电泳条件：缓冲液含有6.0％甲酸和6％甲醇，分离电压为15kV，分离温度为25℃。进样：50mbar压力下进样品溶液40s。
质谱条件：SIM模式检测，m/z值见表1；鞘液为含80％甲醇和0.05％甲酸的溶液，流速为3μL/min；雾化气压力为4psig；干燥气流速和温度分别为7L/min和275℃；毛细管电压为4500V；各氨基酸、有机酸及内标碎片电压均为10。
表1SIM离子的m/z及其对应的代谢物名称
应用毛细管电泳-质谱法对22个氨基酸和5个有机酸进行分析，分析结果参见附图1和图2。图2中：1：甘氨酸，2：β-丙氨酸，3：丙氨酸，4：β-氨基异丁酸，5：3-羟基丁酸，6：丝氨酸，7：辅氨酸，8：缬氨酸，9：琥珀酸，10：苏氨酸，11：半胱氨酸，12：肌酸，13：亮氨酸，14：鸟氨酸，15：天冬氨酸，16：苹果酸，17：赖氨酸，18：谷氨酰胺，19：谷氨酸，20：甲硫氨酸，21：组氨酸，22：苯丙氨酸，23：精氨酸，24：酪氨酸，25：柠檬酸，26：色氨酸，27：胱氨酸。
实施例2
样品预处理：取正常人尿液200L，加入400L甲醇，于涡旋混合器上混合2min，12000r/min离心10min，移取500L上清液，于离心浓缩仪离心浓缩至干，残渣加入200L水充分溶解后，12000r/min离心10min取上清液进样分析。
毛细管电泳条件：缓冲液含有4.0％甲酸和15％甲醇，分离电压为15kV，分离温度为25℃。进样：50mbar压力下进样品溶液40s。
质谱条件：同实施例1。
应用毛细管电泳-质谱法对正常人尿液中氨基酸和有机酸进行分析，结果参见附图3和图4。图4中：1：甘氨酸，2：β-丙氨酸，3：丙氨酸，4：β-氨基异丁酸，5：3-羟基丁酸，6：丝氨酸，7：辅氨酸，8：缬氨酸，9：琥珀酸，10：苏氨酸，11：半胱氨酸，12：肌酸，13：亮氨酸，14：鸟氨酸，15：天冬氨酸，17：赖氨酸，18：谷氨酰胺，19：谷氨酸，20：甲硫氨酸，21：组氨酸，22：苯丙氨酸，23：精氨酸，24：酪氨酸，25：柠檬酸，26：色氨酸，27：胱氨酸
实施例3
样品预处理：取乳腺癌病人尿液200L，加入400L甲醇，于涡旋混合器上混合5min，12000r/min离心10min，移取500L上清液，于离心浓缩仪离心浓缩至干，残渣加入200L水充分溶解后，12000r/min离心10min取上清液进样分析。
毛细管电泳条件：缓冲液含有4.0％甲酸和2.5％甲醇，分离电压为18kV，分离温度为25℃。进样：50mbar压力下进14％的浓氨水(v/v)3s后，再于50mbar压力下进样品溶液40s。
质谱条件：SIM模式检测，m/z值如表1所示；鞘液为含80％甲醇和0.05％甲酸的溶液，流速为3L/min；雾化气压力为2psig；干燥气流速和温度分别为8L/min和250℃；毛细管电压为4500V；各氨基酸、有机酸及内标碎片电压均为70。
应用毛细管电泳-质谱法对乳腺癌病人尿液中氨基酸和有机酸进行测定，结果见附图5和图6。图6中：1：甘氨酸，2：β-丙氨酸，3：丙氨酸，4：β-氨基异丁酸，5：3-羟基丁酸，6：丝氨酸，7：辅氨酸，8：缬氨酸，9：琥珀酸，10：苏氨酸，11：半胱氨酸，12：肌酸，13：亮氨酸，15：天冬氨酸，16：苹果酸，17：赖氨酸，18：谷氨酰胺，19：谷氨酸，20：甲硫氨酸，21：组氨酸，22：苯丙氨酸，23：精氨酸，24：酪氨酸，25：柠檬酸，26：色氨酸，27：胱氨酸。
Claims (1)
1.一种尿液中同时分析氨基酸和有机酸代谢物谱的方法，其特征在于通过以下步骤实现：
(1)样品预处理
取样品200μL，加入20μL内标液及400μL甲醇，于旋涡混合器上混合5分钟，高速离心10分钟，移取500μL上清液，于离心浓缩仪离心浓缩至干，残渣加入200μL水溶解后，高速离心10分钟取上清液进样分析；
(2)毛细管电泳-质谱联用法测定
A.毛细管电泳条件：缓冲液含有3.0-6.0％甲酸和2.5-15％甲醇，分离电压为15-18kV，分离温度为25℃，程序进样：50mbar压力下进体积百分含量为14％的浓氨水0-3秒后，再于50mbar压力下进样品溶液40秒，
B.质谱条件：SIM模式检测，鞘液为含80-90％甲醇和0.05％甲酸的溶液，流速为3μL/min，雾化气压力为2-4psig，干燥气流速和温度分别为7-8L/min和250-275℃，毛细管电压为4500V，氨基酸、有机酸及内标碎片电压均为10-70V；
步骤(1)所用内标液的制备是取盐酸巴马汀标准品，用水溶解后作为内标液；
步骤(2)B中所述的是22种氨基酸和5种有机酸，分别是：甘氨酸、丝氨酸、辅氨酸、缬氨酸、琥珀酸、苏氨酸、半胱氨酸、苹果酸、谷氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、酪氨酸、柠檬酸、色氨酸、β-丙氨酸、丙氨酸、β-氨基异丁酸、3-羟基丁酸、赖氨酸、谷氨酰胺、肌酸、亮氨酸、鸟氨酸、天冬氨酸、胱氨酸。
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