CN105938119B - 一种利用毛细管电泳快速检测甲壳类精氨酸激酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用毛细管电泳快速检测甲壳类精氨酸激酶的方法，包括如下步骤：(1)提取虾肌肉中的全蛋白并溶于pH为7～8的平衡缓冲液中，然后加入阴离子交换层析柱中，洗脱液洗脱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品；(2)将所得样品进行毛细管区带电泳，得电泳图谱，将电泳图谱中所得峰面积代入标准曲线回归方程计算得到样品中甲壳类精氨酸激酶的浓度。本发明用毛细管电泳快速检测水产品过敏原——甲壳类精氨酸激酶的方法，属于过敏原检测技术领域，提取虾肌肉中的全蛋白，加入到阴离子交换层析柱中，用洗脱液洗脱，收集穿透峰对应的溶液，加入毛细管电泳仪中，通过毛细管区带电泳，对样品液中的精氨酸激酶进行定性和定量检测。

Description

一种利用毛细管电泳快速检测甲壳类精氨酸激酶的方法
技术领域
本发明涉及过敏原检测技术领域，具体的说，是涉及一种甲壳类精氨酸激酶的快速定性及定量检测方法。
背景技术
水产品蛋白质含量丰富，在人们营养和健康中扮演重要角色，但对易感人群容易引起严重的过敏反应。全世界大约有30％～40％的疾病由过敏引起，水产品过敏尤其严重，有5％的儿童和2％的成年人会对某些水产品产生过敏。精氨酸激酶(Arginine Kinase，AK)广泛存在于虾、蟹等甲壳类水产品中，是水产品中一种主要的过敏原。
目前确定食品过敏原的检测方法主要有以下几种：
(1)利用抗原抗体特异性反应的原理进行检测，通常采用酶联免疫的方法，利用食品过敏原抗体和过敏原进行特异性的结合，然后酶标记的二抗与过敏原形成复合物，利用显色底物，通过颜色的深浅来判断食品中过敏原的含量；
(2)组胺释放实验，组胺释放实验主要是通过食品过敏原激发致敏的靶细胞，引起细胞释放组胺，组胺含量可应用荧光测定法、放射免疫法等方法测定，与适宜参照进行比较，确定组胺释放率阳性标准，从而进行过敏原活性测定及鉴定的一类方法；
(3)过敏原指纹图谱快速检测方法，在食物总蛋白双向电泳指纹图谱的基础上，对总蛋白双向电泳图谱上的单个点进行了飞行质谱分析，以飞行质谱图谱的分子量峰和图谱形状为基本参数来鉴定特征性的蛋白点。
目前这些方法普遍存在检测速度慢，操作复杂繁琐，灵敏度、精确度不高的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种利用毛细管电泳快速检测甲壳类精氨酸激酶的方法，简便快速、灵敏度高、精确度高。
一种利用毛细管电泳快速检测甲壳类精氨酸激酶的方法，包括如下步骤：
(1)提取虾肌肉中的全蛋白并溶于pH为7～8的平衡缓冲液中，然后加入阴离子交换层析柱中，氯化钠溶液作洗脱液进行洗脱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品；
(2)将所得样品进行毛细管区带电泳，得电泳图谱，将电泳图谱中甲壳类精氨酸激酶所对应的峰面积代入甲壳类精氨酸激酶的标准曲线回归方程中计算得到样品液中甲壳类精氨酸激酶的浓度。
本发明用毛细管电泳快速检测水产品过敏原——甲壳类精氨酸激酶，属于过敏原检测技术领域，提取虾肌肉中的全蛋白，加入到阴离子交换层析柱中，用洗脱液洗脱，收集穿透峰对应的溶液，加入毛细管电泳仪中，通过毛细管区带电泳，对样品液中的精氨酸激酶进行定性和定量检测。本发明所采用的毛细管电泳法分析具有检测速度快、灵敏度高的特点，能快速、精确的定量检测水产品中的精氨酸激酶，与以往检测精氨酸激酶的方法相比具有明显优势。
本发明的步骤(1)中：
优选地，虾肌肉中的全蛋白采用试剂盒提取。
所述试剂盒为凯基全蛋白提取试剂盒(南京凯基生物技术发展有限公司)。
优选地，所述平衡缓冲液为pH为7.3～7.6的tris-HCl溶液，所述tris-HCl溶液的浓度为5～10mmol/L。进一步优选地，所述平衡缓冲液为pH为7.5的tris-HCl溶液，所述tris-HCl溶液的浓度为10mmol/L。
优选地，阴离子交换层析柱中所用填料为DEAE-Sepharose Fast Flow。
优选地，所述洗脱液为0-0.5mol/L的NaCl溶液，进一步优选为优选0.3～0.4mol/L的NaCl溶液。
优选地，溶有全蛋白的平衡缓冲液以0.3～0.6ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，洗脱液以0.8～1.2ml/min的速度洗脱层析柱，进一步优选地，溶有全蛋白的平衡缓冲液以0.5ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，洗脱液以1.0ml/min的速度洗脱层析柱。
进行蛋白分离前以1.5ml/min的流速加入3～5倍柱体积的平衡缓冲液以平衡层析柱。
虾为南美白对虾。
本发明的步骤(2)中：
电泳条件为：毛细管选用未涂层石英毛细管柱，检测波长为210～220nm，进样方式为压力进样，分离电压为15±1kv，毛细管柱温为25±1℃，运行缓冲液为pH9.0～9.2的硼砂缓冲溶液。
优选地，电泳条件为：毛细管选用未涂层石英毛细管柱，检测波长为214nm，进样方式为压力进样(0.5psi，5s)，分离电压为15kv，毛细管柱温为25℃，运行缓冲液为pH9.2且浓度为25mmol/L的硼砂缓冲溶液。
标准曲线线性回归方程的制作方法如下：精密配制甲壳类精氨酸激酶标准溶液5、10、25、50、100μg/mL按步骤(2)中电泳条件进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归，得标准曲线线性回归方程。
毛细管的预处理：选用未涂层石英毛细管柱(45cm×75μm，P/ACETM MDQ System，Beckman公司)，新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10～12min，蒸馏水冲洗5～6min，0.1M Na0H溶液冲洗30～35min，蒸馏水冲洗5～6min，最后再用运行缓冲液冲洗10～12min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲2～3min。
进一步地，新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，0.1M Na0H溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲2min。
毛细管电泳在食品过敏原检测方面的应用并不广泛，尤其在水产品过敏原的检测中，目前还没有可行的方法。这是由于水产品中蛋白成分比较复杂，从而对水产品中某一过敏原的检测产生干扰，而毛细管电泳检测要求样品中的成分尽可能的简单。因此，需要发展简单、快速、有效的样品前处理方法，使其适合毛细管电泳对样品的要求。
本发明提供了一种简单、快速的样品前处理方法。首先是利用试剂盒将水产品中的全蛋白提取出来，再采用DEAE-Sepharose阴离子交换层析的方法将目的过敏原与其他蛋白分离，使样品成分单一，适合毛细管电泳对样品的要求；同时，本发明对毛细管电泳的条件进行优化，实现了对样品中精氨酸激酶含量的测定。
在前处理的优化条件与毛细管电泳优化条件的组合下，检测更快速、灵敏度和精确度更高。
与现有的检测方法相比，本发明的有益效果如下：
本发明所建立的方法可以实现对AK的定性和定量分析，未见文献报道，为快速、准确的检测甲壳类过敏原AK提供新的依据。本发明所采用的毛细管电泳法具有分析速度快，分离度好，准确度和灵敏度高的特点。
具体实施方式
实施例1
1.样品的制备
样品的制备：使用试剂盒提取虾肌肉中的全蛋白，将虾全蛋白溶于pH7.5的平衡缓冲液中得到样品液。以1.5ml/min的流速加入3～5倍柱体积的平衡液，平衡层析柱，然后将样品液以0.5ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，然后用0.3～0.4mol/L的洗脱液以1.0ml/min的速度洗脱层析柱，收集穿透峰所对应的溶液，即为样品。
2.毛细管电泳分析条件优化
(1)毛细管选择及预处理:选用未涂层石英毛细管柱(45cm×75μm，P/ACETM MDQSystem，Beckman公司)，新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，0.1M NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲2min；
(2)毛细管电泳分析条件:检测波长是214nm，进样方式为压力进样(0.5psi，5s)，分离电压15kv，毛细管柱温25℃，运行缓冲液是25mmol/L硼砂缓冲溶液(pH9.2)。
3.标准曲线的建立:精密配制AK标准溶液5、10、25、50、100μg/mL进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归。结果在5-100μg/mL的范围内线性关系良好，回归方程为Y＝0.073+0.029x，相关系数R2＝0.998，在5-100μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。最低检出浓度为0.1μg/mL(S/N>3)。
4.回收率测定和精密度测定:样品处理方法(不加底物)，取5、10、25、50、100μg/mL浓度进行加标回收实验，每个浓度6个平行样，计算回收率和精密度(见表1)。
表1精氨酸激酶添加回收率和精密度测定(n＝6)
添加浓度(μg/mL) 回收率％ RSD％
5 99.6 5.8
10 98.5 5.4
25 98.2 4.8
50 96.8 4.6
100 95.4 4.3
由表1的结果可知，在5-100μg/mL浓度添加范围内，回收率>95％，RSD<6％，在蛋白质大分子的检测中，是可以被接受的。
实施例2
1.样品的制备
样品的制备：使用试剂盒提取虾肌肉中的全蛋白，将虾全蛋白溶于pH 7.5的平衡缓冲液中得到样品液。以1.5ml/min的流速加入3～5倍柱体积的平衡液，平衡层析柱，然后将样品液以0.5ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，再用0.3～0.4mol/L的洗脱液以1.0ml/min的速度洗脱层析柱，收集穿透峰所对应的溶液，即为样品。
2.毛细管电泳分析条件优化
(1)毛细管选择及预处理:选用未涂层石英毛细管柱(45cm×75μm，P/ACETM MDQSystem，Beckman公司)，新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，0.1M NaOH溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲2min；
(2)毛细管电泳分析条件：检测波长是214nm，进样方式为压力进样(0.5psi，5s)，分离电压15kv，毛细管柱温25℃，运行缓冲液是30mmol/L硼砂缓冲溶液(pH9.2)。
3.标准曲线的建立:精密配制AK标准溶液5、10、25、50、100μg/mL进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归。结果在5-100μg/mL的范围内线性关系良好，回归方程为Y＝0.050+0.028x，相关系数R2＝0.994，在5-100μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。最低检出浓度为0.1μg/mL(S/N>3)。
4.回收率测定和精密度测定：样品处理方法(不加底物)，取5、10、25、50、100μg/mL浓度进行加标回收实验，每个浓度6个平行样，计算回收率和精密度(见表2)。
表2精氨酸激酶添加回收率和精密度测定(n＝6)
添加浓度(μg/mL) 回收率％ RSD％
5 99.3 5.7
10 99.5 5.2
25 98.6 4.7
50 97.4 4.5
100 96.2 4.3
由表2的结果可知，在5-100μg/mL浓度添加范围内，回收率>95％，RSD<6％，在蛋白质大分子的检测中，是可以被接受的。
以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (2)

1.一种利用毛细管电泳快速检测甲壳类精氨酸激酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)采用试剂盒提取南美白对虾虾肌肉中的全蛋白并溶于平衡缓冲液中，所述平衡缓冲液为pH为7.5的tris-HCl溶液，所述tris-HCl溶液的浓度为10mmol/L，然后加入阴离子交换层析柱中，0.3～0.4mol/L的NaCl溶液洗脱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品；溶有全蛋白的平衡缓冲液以0.5ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，洗脱液以1.0ml/min的速度洗脱层析柱；
(2)将所得样品进行毛细管区带电泳，得电泳图谱，将电泳图谱中甲壳类精氨酸激酶所对应的峰面积代入甲壳类精氨酸激酶的标准曲线回归方程中计算得到样品液中甲壳类精氨酸激酶的浓度；
标准曲线线性回归方程的制作方法如下：精密配制甲壳类精氨酸激酶标准溶液5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，按步骤(2)中电泳条件进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归，得标准曲线线性回归方程；
步骤(2)中电泳条件为：毛细管选用未涂层石英毛细管柱，检测波长为214nm，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进样时间为5s，分离电压为15kv，毛细管柱温为25℃，运行缓冲液为pH9.2且浓度为25mmol/L的硼砂缓冲溶液。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，阴离子交换层析柱中所用填料为DEAE-Sepharose Fast Flow。
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