CN105675695A - 一种利用毛细管电泳快速检测鱼类胶原蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用毛细管电泳快速检测鱼类胶原蛋白的方法，包括如下步骤：(1)提取鱼皮中的全蛋白并溶于pH为7～8的平衡缓冲液中，然后加入阴离子交换层析柱中，洗脱液洗脱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品；(2)将所得样品进行毛细管区带电泳，得电泳图谱，将电泳图谱中所得峰面积代入鱼类胶原蛋白的标准曲线回归方程中计算得到样品液中鱼类胶原蛋白的浓度。本发明用毛细管电泳快速、定性及定量检测一种鱼类新型过敏原水产品过敏原鱼类胶原蛋白的方法。本发明用所建立的方法定性和定量分析鱼类胶原蛋白的方法，未见文献报道，为快速、准确的检测鱼类胶原蛋白提供新的依据。

Description

一种利用毛细管电泳快速检测鱼类胶原蛋白的方法
技术领域
本发明涉及过敏原检测技术领域，具体的说，是涉及一种用毛细管电泳快速、定性及定量检测鱼类胶原蛋白的方法。
背景技术
鱼味道鲜美，营养丰富，深受消费者喜爱，但其同时也是联合国粮农组织公布的8种最常见的高过敏活性食物之一。工业化国家，对鱼类过敏的人口约占总人口的0.1～0.3％，占食物过敏总人口的2.3％～30.4％。胶原蛋白(Pepsinsolublecollagen，PSC)是新被发现的一种鱼类过敏原，广泛存在于鱼皮和鱼肉中。
目前确定鱼类过敏原的检测方法主要有以下几种：
(1)组胺释放实验
组胺释放实验是使用过敏原刺激肥大细胞，导致其释放出组胺等活性介质，再通过测量组胺的释放量，来对过敏原活性进行鉴定。实验中，通常以抗IgE抗体作为阳性对照，而选用样品介质做为阴性参照，以排除组胺非特异性释放对实验结果的干扰。但该实验中影响组胺释放的因素较多，测量难度较大。
(2)免疫印迹实验
免疫印迹技术是在电泳分离技术和抗体对抗原特异性检测基础上，逐步发展起来的一种食物过敏原检测鉴定技术。免疫印迹实验一般包括以下三个步骤：全蛋白的电泳分离；蛋白质条带的转印(转移至硝酸纤维素(NC)膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜等固相载体上)；将印有蛋白质条带的固相载体依次与IgE抗体和酶标二抗作用后，加入显色物质，使过敏原的条带显色。
(3)过敏原指纹图谱检测法
指纹图谱是一种综合的、可量化的鉴别手段，以往主要用以对中药材鉴别真伪，被WHO和美国FDA广泛认可。。肽质量指纹图谱分析是在前期电泳(SDS-PAGE，2-DE)，色谱(LC)对目标蛋白进行分离鉴定的基础上，通过MALDI-TOF-MS质谱获得目标蛋白的肽质量指纹图谱，并结合数据库搜索分析蛋白质序列而实现对蛋白质进一步鉴定的方法。
目前这些方法普遍存在检测速度慢，操作复杂繁琐，灵敏度、精确度不高的问题。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种用毛细管电泳快速、定性及定量检测鱼类PSC的方法。
一种利用毛细管电泳快速检测鱼类胶原蛋白的方法，包括如下步骤：
(1)提取鱼皮中的全蛋白并溶于pH为7～8的平衡缓冲液中，然后加入阴离子交换层析柱中，洗脱液洗脱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品；
(2)将所得样品进行毛细管区带电泳，得电泳图谱，将电泳图谱中鱼类胶原蛋白所对应的峰面积代入鱼类胶原蛋白的标准曲线回归方程中计算得到样品液中鱼类胶原蛋白的浓度。
本发明用毛细管电泳快速、定性及定量检测一种鱼类新型过敏原水产品过敏原鱼类胶原蛋白，本发明用所建立的方法定性和定量分析鱼类胶原蛋白的方法，未见文献报道，为快速、准确的检测鱼类胶原蛋白提供新的依据。提取鱼肌肉中的全蛋白，加入到阴离子交换层析柱中，用洗脱液洗脱，收集穿透峰对应的溶液，加入毛细管电泳仪中，通过毛细管区带电泳，对样品液中的胶原蛋白进行定性和定量检测。与文献方法相比，本发明所采用的毛细管电泳法具有更好的可靠性和选择性，而且具有灵敏度高，分析速度快等特点。
本发明的步骤(1)中：
优选地，鱼皮中的全蛋白采用试剂盒提取。
所述试剂盒为凯基全蛋白提取试剂盒(南京凯基生物技术发展有限公司)。
优选地，所述平衡缓冲液为pH为7.3～7.6的tris-HCl溶液，所述tris-HCl溶液的浓度为5～10mmol/L。进一步优选地，所述平衡缓冲液为pH为7.5的tris-HCl溶液，所述tris-HCl溶液的浓度为10mmol/L。
阴离子交换层析柱中所用填料为DEAE-SepharoseFastFlow。
所述洗脱液为0～0.5mol/L的NaCl溶液，NaCl溶液的浓度进一步优选为0.2～0.3mol/L。
优选地，溶有全蛋白的平衡缓冲液以0.3～0.6ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，洗脱液以0.8～1.2ml/min的速度洗脱层析柱，进一步优选地，溶有全蛋白的平衡缓冲液以0.5ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，洗脱液以1.0ml/min的速度洗脱层析柱。
进行蛋白分离前以1.5ml/min的流速加入3～5倍柱体积的平衡缓冲液以平衡层析柱。
本发明的步骤(2)中：
电泳条件为：毛细管选用未涂层石英毛细管柱，检测波长为210～220nm，进样方式为压力进样，分离电压为15±1kv，毛细管柱温为25±1℃，运行缓冲液为pH9.0～9.2的硼砂缓冲溶液。
优选地，电泳条件为：毛细管选用未涂层石英毛细管柱，检测波长为214nm，进样方式为压力进样(0.5psi，5s)，分离电压为15kv，毛细管柱温为25℃，运行缓冲液为pH9.0且浓度为20mmol/L的硼砂缓冲溶液。
标准曲线线性回归方程的制作方法如下：精密配制鱼类胶原蛋标准溶液5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，按步骤(2)中电泳条件进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归，得标准曲线线性回归方程。
毛细管的预处理：选用未涂层石英毛细管柱(45cm×75μm，P/ACETMMDQSystem，Beckman公司)，新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10～12min，蒸馏水冲洗5～6min，0.1MNa0H溶液冲洗30～35min，蒸馏水冲洗5～6min，最后再用运行缓冲液冲洗10～12min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲2～3min。
进一步地，新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，0.1MNa0H溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲2min。
鱼为鲤鱼。
毛细管电泳在食品过敏原检测方面的应用并不广泛，尤其在水产品过敏原的检测中，目前还没有可行的方法。这是由于水产品中蛋白成分比较复杂，从而对水产品中某一过敏原的检测产生干扰，而毛细管电泳检测要求样品中的成分尽可能的简单。因此，需要发展简单、快速、有效的样品前处理方法，使其适合毛细管电泳对样品的要求。
本发明提供了一种简单、快速的样品前处理方法。首先是利用试剂盒将水产品中的全蛋白提取出来，再采用DEAE-Sepharose阴离子交换层析的方法将目的过敏原与其他蛋白分离，使样品成分单一，适合毛细管电泳对样品的要求；同时，本发明对毛细管电泳的条件进行优化，实现了对样品中胶原蛋白含量的测定。
在前处理的优化条件与毛细管电泳优化条件的组合下，检测更快速、灵敏度和精确度更高。
与现有检测方法相比，本发明的有益效果如下：
本发明用所建立的方法定性和定量分析鱼类胶原蛋白的方法，未见文献报道，为快速、准确的检测鱼类胶原蛋白提供新的依据。与文献方法相比，本发明所采用的毛细管电泳法具有更好的可靠性和选择性，而且具有灵敏度高，分析速度快等特点。
具体实施方式
实施例1
1.样品的制备
样品的制备：使用试剂盒提取鱼皮中的全蛋白，将鱼全蛋白溶于pH7.5的平衡缓冲液中得到样品液。将3～5倍柱体积的平衡液以1.5ml/min的流速加，以平衡层析柱，再将样品液以0.5ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，然后用0.2～0.3mol/L的洗脱液以1.0ml/min的速度洗脱层析柱，收集穿透峰所对应的溶液，即为样品。
2，毛细管电泳分析条件优化
(1)毛细管选择及预处理:选用未涂层石英毛细管柱(45cm×75μm，P/ACETMMDQSystem，Beckman公司)，新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，0.1MNa0H溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲2min；
(2)毛细管电泳分析条件:检测波长是214nm，进样方式为压力进样(0.5psi，5s)，分离电压15kv，毛细管柱温25℃；运行缓冲液是20mmol/L硼砂缓冲液(pH＝9.0)。
3.标准曲线的建立:精密配制鱼类胶原蛋白标准溶液5、10、25、50、100μg/mL进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归。结果在5-100μg/mL的范围内线性关系良好，回归方程为Y＝0.003+1.75×10-3x，相关系数R2＝0.991，在5-100μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。最低检出浓度为0.1μg/mL(S/N>3)。
4.回收率测定和精密度测定:按样品的处理方法(不加底物)，取5、10、25、50、100μg/mL浓度进行加标回收实验，每个浓度6个平行样，计算回收率和精密度(见表1)。
表1胶原蛋白添加回收率和精密度测定(n＝6)
添加浓度(μg/mL) 回收率％ RSD％
5 98.6 5.3
10 98.2 5.1
25 97.4 4.6
50 95.3 4.3
100 95.8 4.2
由表1的结果可知，在5-100μg/mL浓度添加范围内，回收率>95％，RSD<6％，在蛋白质大分子的检测中，是可以被接受的。
实施例2
1.样品的制备
样品的制备：使用试剂盒提取鱼皮中的全蛋白，将鱼全蛋白溶于pH7.5的平衡缓冲液中得到样品液。将3～5倍柱体积的平衡液以1.5ml/min的流速加，以平衡层析柱，再将样品液以0.5ml/min的流速加入阴离子交换层析柱中，然后用0.2～0.3mol/L的洗脱液以1.0ml/min的速度洗脱层析柱，收集穿透峰所对应的溶液，即为样品。
2，毛细管电泳分析条件优化
(1)毛细管选择及预处理:选用未涂层石英毛细管柱(45cm×75μm，P/ACETMMDQSystem，Beckman公司)，新毛细管柱先依次用甲醇冲洗10min，蒸馏水冲洗5min，0.1MNa0H溶液冲洗30min，蒸馏水冲洗5min，最后再用运行缓冲液冲洗10min；进样前依次用蒸馏水及运行缓冲液各冲2min；
(2)毛细管电泳分析条件:检测波长是214nm，进样方式为压力进样(0.5psi，5s)，分离电压15kv，毛细管柱温25℃；运行缓冲液是30mmol/L硼砂缓冲液(pH＝9.4)。
3.标准曲线的建立:精密配制鱼类胶原蛋白标准溶液5、10、25、50、100μg/mL进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归。结果在5-100μg/mL的范围内线性关系良好，回归方程为Y＝-0.003+2.16×10-3x，相关系数R2＝0.998，在5-100μg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。最低检出浓度为0.1μg/mL(S/N>3)。
4.回收率测定和精密度测定:按样品的处理方法(不加底物)，取5、10、25、50、100μg/mL浓度进行加标回收实验，每个浓度6个平行样，计算回收率和精密度(见表2)。
表2胶原蛋白添加回收率和精密度测定(n＝6)
添加浓度(μg/mL) 回收率％ RSD％
5 99.3 5.8
10 98.6 5.7
25 96.8 4.9
50 96.9 4.6
100 96.2 4.5
由表2的结果可知，在5-100μg/mL浓度添加范围内，回收率>95％，RSD<6％，在蛋白质大分子的检测中，是可以被接受的。
以上所述仅为本发明专利的具体实施案例，但本发明专利的技术特征并不局限于此，任何相关领域的技术人员在本发明的领域内，所作的变化或修饰皆涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (10)

1.一种利用毛细管电泳快速检测鱼类胶原蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取鱼皮中的全蛋白并溶于pH为7～8的平衡缓冲液中，然后加入阴离子交换层析柱中，NaCl溶液洗脱，收集穿透峰所对应的溶液即为样品；
(2)将所得样品进行毛细管区带电泳，得电泳图谱，将电泳图谱中鱼类胶原蛋白所对应的峰面积代入鱼类胶原蛋白的标准曲线回归方程中计算得到样品液中鱼类胶原蛋白的浓度。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤(2)中电泳条件为：毛细管选用未涂层石英毛细管柱，检测波长为210～220nm，进样方式为压力进样，分离电压为15±1kv，毛细管柱温为25±1℃，运行缓冲液为pH9.0～9.2的硼砂缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，电泳条件为：毛细管选用未涂层石英毛细管柱，检测波长为214nm，进样方式为压力进样，压力为0.5psi，进样时间为5s，分离电压为15kv，毛细管柱温为25℃，运行缓冲液为pH9.0且浓度为20mmol/L的硼砂缓冲溶液。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，标准曲线线性回归方程的制作方法如下：精密配制鱼类胶原蛋标准溶液5μg/mL、10μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL，按步骤(2)中电泳条件进样，每个样品重复3次，以峰面积对浓度进行线性回归，得标准曲线线性回归方程。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述NaCl溶液的浓度为0-0.5mol/L。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为pH为7.3～7.6的tris-HCl溶液，所述tris-HCl溶液的浓度为5～10mmol/L。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述平衡缓冲液为pH为7.5的tris-HCl溶液，所述tris-HCl溶液的浓度为10mmol/L。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，鱼皮中的全蛋白采用试剂盒提取。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，阴离子交换层析柱中所用填料为DEAE-SepharoseFastFlow。
10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，鱼为鲤鱼。
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