CN104280503A - 同时测定烟草中黄曲霉毒素b1、b2、g1和g2的hplc-fld柱前衍生法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定烟草中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的HPLC-FLD柱前衍生法：烟末样品用甲醇溶液水浴超声萃取后过滤，将滤液稀释后通过免疫亲和柱，用纯水分两次淋洗免疫亲和柱，再用甲醇将免疫亲和柱上富集的四种黄曲霉毒素洗脱下来，将洗脱后的溶液经氮气吹干，然后加入三氟乙酸和正己烷在45℃恒温衍生化40min，加入少量甲醇溶液，取下层溶液进行HPLC-FLD分析。本发明可用于烟草及烟草制品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁和G₂的同时测定，在20min内完成测定，四种目标物能够得到很好地分离，线性关系良好，检出限低，具有较好的回收率和重现性，适用于烟草及烟草制品中黄曲霉素的检测。

Description

同时测定烟草中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的HPLC-FLD柱前衍生法

技术领域

本发明涉及黄曲霉素的检测方法，具体地指一种同时测定烟草中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁和G₂的HPLC-FLD柱前衍生法。

背景技术

黄曲霉毒素(Aflatoxin,简称AFT)是20世纪60年代初发现的一种剧毒的真菌代谢产物，主要由黄曲霉菌(Aspergillus flaws)和寄生曲霉菌(Aspergillus parasiticus)等侵染农产品之后产生，是目前已知最强的致癌物之一，毒性极强。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织癌症研究机构划定为一级致癌物。

黄曲霉毒素主要有B₁，B₂，G₁，G₂等，结构式如下，其中黄曲霉毒素B₁(AFB₁)毒性最强，也最为常见。

黄曲霉毒素广泛的存在于大米、花生、玉米、棉籽等农产品中，是食品安全和食品国际贸易的巨大威胁。在烟叶的贮藏过程中，烟叶也面临着霉变的问题，如果处理不善，烟叶也面临着被黄曲霉毒素污染的风险。

目前，黄曲霉毒素的检测方法主要有薄层层析法、高效液相色谱法和酶联免疫法等。其中高效液相色谱(HPLC)方法测定准确，分辨率高，可同时测定多种黄曲霉毒素成分，完成定性、定量测定。由于烟叶样品中含有大量化合物，需要对测量样品进行净化处理以及对毒素进行富集，才能进行检测分析。

酶联免疫法主要使用免疫亲和柱来纯化萃取液液，进行富集。免疫亲和柱是通过偶联的抗体对黄曲霉毒素进行特异性吸附达到富集的效果，其富集效率高，选择性强，是目前黄曲霉毒素最为有效的固相萃取柱。但是采用免疫亲和柱时，是从免疫亲和柱上洗脱得到的甲醇溶液，经氮气吹干后，加入三氟乙酸衍生化，然后再经氮气吹干。在三氟乙酸的作用下，AFB₁和AFG₁分子可被转化为具有强荧光的AFB_2a和AFG_2a分子。经实验发现，衍生化后经氮气吹干，衍生化效果较差，几乎无法获得衍生效果。这可能与AFB_2a和AFG_2a分子的低稳定性有关，在氮气吹干的过程中，衍生化反应得到的半缩醛再次分解，使得衍生化效果减弱，从而导致无法对黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁和G₂的同时测定。

发明内容

本发明的目的就是要克服现有技术所存在的不足，提供一种同时测定烟草中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁和G₂的HPLC-FLD柱前衍生法，旨在为烟用香精香料的质量安全控制提供参考。

为实现上述目的，本发明所提供的同时测定烟草中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁和G₂的HPLC-FLD柱前衍生法：称取烟末样品加入体积分数80％为甲醇溶液，水浴超声萃取10min，每隔两分钟震荡一次，萃取结束后过滤，将滤液稀释后，以1mL/min的速度通过免疫亲和柱，用纯水分两次淋洗免疫亲和柱，再用甲醇将免疫亲和柱上富集的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2洗脱下来，将洗脱后的溶液经氮气吹干，然后加入三氟乙酸和正己烷在45℃恒温衍生化40min，加入体积分数50％甲醇溶液，取下层溶液进行HPLC-FLD分析；其中，分析检测条件：

采用液相色谱柱Agilent ZORBAX Bonus-RP C₁₈，其规格为250mm×4.6mm i.d.，5μm；柱温30℃；

采用二元流动相乙腈-水按体积比25：75等度洗脱分离，流速为1.0mL/min；进样量100μL；

荧光检测器检测的激发波长为360nm，发射波长为440nm。

本发明的有益效果在于：采用本发明的分析方法可用于烟草及烟草制品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁和G₂的同时测定。本发明的分析方法在20min内完成测定，四种目标物能够得到很好地分离，线性关系良好，4种黄曲霉毒素的线性相关系数r值均大于0.99，方法可成功应用于烟叶的检测。本发明检出限低，具有较好的回收率和重现性，回收率为85％～117％，相对标准偏差0.2％～9.4％(n＝6)，适用于烟草及烟草制品中黄曲霉素的检测。

附图说明

图1为AFB₁衍生化过程中荧光强度随时间变化图。

图2为AFB1衍生化过程中不同温度下转化率随时间变化图。

图3为标准样品中四种黄曲霉毒素的液相色谱图。

图4为添加有黄曲霉毒素标准样品的烟叶样品的液相色谱图。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细说明，但它们不对本发明构成限定。

实施例

本实施例所采用的材料、试剂与仪器如下：

Dionex Summit P680A高效液相色谱仪(配自动进样器、柱温箱和DAD检测器)、AL204型万分之一电子天平、移液枪(Gilson)、2mL样品小瓶、移液枪枪头、手动固相萃取仪(Supelco)、黄曲霉毒素免疫亲和柱(美国Beacon)。

甲醇(色谱纯，CNW)，乙腈(色谱纯，CNW)，正己烷(色谱纯，CNW)，三氟乙酸，纯净水(哇哈哈)。

测定方法如下：

按YC/T 31制备样品，称取2.00g烟末样品，置于30mL带盖塑料瓶中，用20mL体积分数80％的甲醇溶液在超声波仪中水浴提取10min，每隔两分钟震荡一次；提取结束后过滤；取5mL滤液加入20mL纯水稀释后，以1mL/min的速度通过免疫亲和柱，然后以20mL纯水分两次淋洗亲和柱，最后用1mL甲醇将免疫亲和柱上富集的黄曲霉毒素洗脱下来。

将甲醇溶液用氮气小心吹干，然后加入100μL三氟乙酸和200μL正己烷，涡旋振荡后在45℃恒温箱内衍生40min，加入0.9mL体积分数50％的甲醇溶液，取下层溶液进行HPLC-FLD分析；其中，分析检测条件：

采用液相色谱柱Agilent ZORBAX Bonus-RP C₁₈，其规格为250mm×4.6mm i.d.，5μm；柱温30℃；

采用二元流动相乙腈-水按体积比25：75等度洗脱分离，流速为1.0mL/min；进样量100μL；

荧光检测器检测的激发波长为360nm，发射波长为440nm。

采用本发明的方法分别检测了2012～2013年的16个烟末留样中的黄曲霉毒素残留量。结果显示：2013年的8个样品中均有未检出。2012年的8个样品保存环境较差，目测已有一定程度霉变，其中有一个样检出黄曲霉素B₁，含量为0.44μg/kg，低于欧盟针对直接食用食物的限量要求。

衍生化条件的优化

分子发射的荧光强度与其结构有关。双呋喃环上的具有饱和结构的B₂、G₂具有较高的荧光强度，而双呋喃环上具有不饱和双键的B₁、G₁在相同激发条件下荧光较弱。为提高其灵敏度，必须通过衍生化对AF分子的荧光强度。在三氟乙酸的作用下，AFB₁和AFG₁分子可被转化为具有强荧光的AFB_2a和AFG_2a分子。为了防止衍生化反应得到的半缩醛AFB_2a和AFG_2a分子在氮气吹干的过程中再次分解，提高衍生化效果，衍生化后未用氮气吹干，只是在洗脱后衍生化之前经氮气吹干。

随着衍生化过程的推进，AFB₁被转化为AFB_2a分子，通过监测AFB_2a的荧光强度变化可以监测衍生化的反应进程。图1是常温下AFB₁衍生过程的荧光监控图。如图1所示，随着反应的进行，AFB_2a分子的含量逐步上升，荧光强度也随之增强，最终达到平衡状态。如果将平衡状态下的AFB₁转化率设为100％，根据荧光强度的比值即可以计算出不同时间的转化率。图2为AFB₁衍生化过程中转化率与反应时间关系图。由图2可以看到，在常温下，衍生化完全需要两个小时以上，在45℃的条件下，经过40min，即可以衍生化完全。在实际操作中，由于衍生化过程与样品上机之间存在时间差，因此衍生化时间可适当缩短。

色谱条件的优化

流动相的组成会影响分离度和目标物保留时间。经多次实验验证，在甲醇-水二元流动相体系中，无论任何配比都无法将B₂和B_2a，G₂和G_2a分离开。甲醇和乙腈组分的提升都能使出峰的保留时间提前。在流动相中加入乙腈能提升分离度。经多次实验，最终确定流动相为乙腈-水的体积比为25：75，在20min内可以得到满意地分离。如图3所示，标准样品中四种黄曲霉毒素的出峰顺序为G₂、G₁、B₂、B₁。

工作曲线及检测限

配制四种AFT的系列标准混合溶液，标准混合溶液经氮气吹干，三氟乙酸衍生化再重新溶解，最终得到B₂的浓度为0.025，0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，和2.5ng/ml，G₂、G₁、B₁的浓度均为0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，2.5和5ng/ml。将标准溶液进行HPLC-FLD分析，采用外标法定量，以目标物的峰面积Y对其浓度X进行回归分析，并按3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比来确定各分析物的定性检出限和定量检出限，得到的线性回归方程、相关系数和检测限如表1所示。

表1四种黄曲霉毒素的工作曲线及检测限

在0.1～10μg/kg范围内，G₂、G₁、B₁呈现了良好的线性关系；在0.05～5μg/kg范围内，B₂呈现了良好的线性关系。其中B₁的定性检出限和定量检出限分别为0.10μg/kg和0.34μg/kg，满足欧盟针对直接食用食物中AFT总量和B₁分量设定的限量要求(最大残留限量：AFT总量不大于4μg/kg，B₁不大于2μg/kg)。考虑到烟草的吸食特性，由卷烟烟气摄入人体的量比直接食用要少的多。

重复性和回收率

在烟叶样品中分别添加0.2、1.0和5μg/kg水平的黄曲霉毒素标准样品(B₁、B₂、G₁、G₂)，测定黄曲霉毒素各个分量的回收率，每种浓度添加进行6次平行实验，根据结果计算方法的加标回收率及加标后测定值的相对标准偏差(RSD)，如表2所示。结果表明方法的回收率高、重复性好。

表2方法的回收率及重复性(n＝6)

图4为添加5μg/kg水平的黄曲霉毒素标准样品的烟叶样品的色谱图。从图4中可以看出，经免疫亲和柱富集和净化，烟叶萃取液中的大部分杂质均能被有效除去，残留的杂质能与目标物有效分离，对目标物无干扰。

Claims (1)

1.一种同时测定烟草中黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2的HPLC-FLD柱前衍生法，其特征在于：称取烟末样品加入体积分数80％为甲醇溶液，水浴超声萃取10min，每隔两分钟震荡一次，萃取结束后过滤，将滤液稀释后，以1mL/min的速度通过免疫亲和柱，用纯水分两次淋洗免疫亲和柱，再用甲醇将免疫亲和柱上富集的黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2洗脱下来，将洗脱后的溶液经氮气吹干，然后加入三氟乙酸和正己烷在45℃恒温衍生化40min，加入体积分数50％甲醇溶液，取下层溶液进行HPLC-FLD分析；其中，分析检测条件：

采用液相色谱柱Agilent ZORBAX Bonus-RP C₁₈，其规格为250mm×4.6mm i.d.，5μm；柱温30℃；

采用二元流动相乙腈-水按体积比25：75等度洗脱分离，流速为1.0mL/min；进样量100μL；

荧光检测器检测的激发波长为360nm，发射波长为440nm。