CN113219092A - 分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种分散液液微萃取‑高效液相色谱‑串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：S1、称取待测烟末，加入甲醇水溶液超声提取；S2、取上清液加C18吸附剂涡旋，离心取上层清液，加入萃取剂混合均匀，迅速注入水中超声振荡得到乳浊液；S3、将乳浊液离心分层，取下层有机溶液氮气吹干；S4、将固形物用甲醇‑水溶液复溶制成待测液；S5、配制黄曲霉毒素的基质配标系列标准工作溶液，采用HPLC‑MS/MS同时检测黄曲霉毒素，建立标准曲线；S6、将待测液置于色谱瓶内，采用HPLC‑MS/MS进行定量分析。本方法的样品前处理简单，结果准确，灵敏度高，适合于烟叶中多种黄曲霉毒素同时检测。
Description
技术领域
本发明属于真菌毒素检测技术领域，特别是分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法。
背景技术
黄曲霉毒素是由黄曲霉菌基于自身生理机制在适宜环境下产生的有毒次级代谢物，其作用是帮助真菌自我防御或有效寄生。人若摄入被黄曲霉毒素污染的食品，则可能造成食物中毒或诱发各种急、慢性疾病等。目前已知的黄曲霉毒素有十多种，其中以B1、B2、G1和G2最为常见，其中以黄曲霉毒素B1(简称AFB1，其余类推)的毒性最强。在世界范围内，黄曲菌毒素对农作物、食品存在着广泛的污染，其来源可能为作物生长过程中真菌感染形成的毒素残留或食品霉变过程中产生的毒素。烟叶的生产和贮藏过程中，也面临着被毒素污染的威胁。
目前，黄曲霉毒素的富集和纯化多采用免疫吸附柱和多功能净化柱(如MycoSep萃取柱)等。这类固相萃取柱子选择性强、效率高，但是价格昂贵。分散液液微萃取(Dispersiveliquid-liquidmicroextraction，DLLME)技术是2006年以来发展的一种新的分离富集技术，它通过在萃取过程中形成三元乳浊液体系，有效提升萃取效率，具有便捷、高效、有机溶剂用量少等特点。用于黄曲霉毒素检测的方法主要有薄层色谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法等，其中高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)由于其固有的高灵敏度和高特异性，能同时定量分析复杂基质中的多个目标化合物，正逐渐显示出其优势。
现有技术中，例如中国授权专利CN104678039A提供了一种基于液相色谱-串联质谱联用同时测定烟草及烟草制品中四种黄曲霉毒素含量的方法，该方法先将烟末样品用氯化钠和甲醇水溶液震荡提取，然后离心取上清液，用液相色谱法和串联质谱联用同时检测上清液中四种黄曲霉毒素的含量。然而，然而这种方法采用的免疫亲和柱价格昂贵，检测成本较高。
又例如论文《超声辅助-分散液液微萃取_快速液相色谱-串联质谱法测定食用植物油中黄曲霉毒素》(朱筱玲等，中国油脂，2019年第44卷第11期，97-101，107)中公开了利用了超声辅助、分散液液微萃取(UA—DLLME)、快速液相色谱、串联质谱法测定食用植物油中黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)的方法。先将食用油用石油醚溶解混匀，然后用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液混合，超声萃取，静置分层后取底层溶液过滤后上机进行液相色谱和质谱联用检测。然而这种方法仅仅针对的对象是食用油，其样品前处理方式和液相色谱、质谱条件也不能适用于烟叶。
发明内容
针对以上现有技术的不足，本发明提供了分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，通过考察优化样品前处理条件，建立以甲醇-水溶液萃取、DLLME技术净化富集和LC-MS/MS定量分析的检测烟叶中多种生物毒素残留的方法，旨在为烟叶质量安全监控提供方法参考。具体通过以下技术实现。
分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，包括以下步骤：
S1、称取待测烟末样品置于离心管中，加入甲醇-水溶液，待测烟末样品用量为0.1g/ml，超声提取20min；
S2、取上清液5ml，加入50mgC18吸附剂，涡旋震荡1min，离心取上层清液1.5ml，加入不少于300μl萃取剂，混合均匀，迅速注入5ml水中，超声振荡3-6min得到乳浊液；
所述萃取剂为二氯乙烷和/或氯仿；
S3、将步骤S2的乳浊液离心分层，取下层有机溶液，用氮气吹干得到固形物；
S4、将步骤S2的固形物用100μl的50％甲醇-水溶液复溶制成待测液；
S5、配置四种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的基质配标系列标准工作溶液，采用高效液相色谱-串联质谱同时检测混合标准工作液中黄曲霉毒素，建立相应的标准曲线；
S6、将步骤S4的待测液置于色谱瓶内，采用高效液相色谱-串联质谱同时检测待测液中黄曲霉毒素的含量，根据步骤S5的标准曲线进行定量分析。
本发明提供的上述方法将分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱方式运用在烟叶中四种黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)和的定性定量测定。在分散液液微萃取过程(DLLME)中，待测物在萃取剂、分散剂和水形成三相乳浊液的过程中，通过大的接触面积迅速在各相间达到分配平衡，但是针对研究对象(例如烟叶)的不同，乳浊液形成状态也存在差异，制备待测液时，所需要的超声震荡时间以及采用的萃取剂(种类和用量)也明显不同。申请人研究了不同的超声振荡时间对目标物萃取效率的影响，发现振荡时间对萃取效率的影响很小，这说明在分散液液微萃取中，目标物在三相乳浊液中很快达到平衡。申请人还研究了二氯甲烷(CH2Cl2)、三氯甲烷(CHCl3，氯仿)、四氯化碳(CCl4)、二氯乙烷这4种萃取剂的萃取效果，发现采用二氯乙烷、四氯化碳作为萃取剂的萃取效果明显优于其他两种。申请人还分别以100、150、200、300和400μL的二氯乙烷做为萃取剂时，发现如果萃取剂体积太小，沉积在底部的有机相的量也很少，难以转移且重复性较差；当萃取剂体积加大后，萃取效率提升；加大至大于300μl后，萃取效率没有明显变化，经综合考虑选择萃取剂体积为300μL。
针对现有技术中，有些待测样品在前处理时使用了氯化钠或氯化钠溶液，申请人考察了不同浓度的氯化钠水溶液(0、5％、10％、15％和20％；质量体积比)对目标物萃取效率的影响，发现随着氯化钠水溶液浓度越大，目标物萃取效率越差。因此，在烟末样品前处理时选择不添加氯化钠。
优选地，上述方法的步骤S1中，甲醇-水溶液中甲醇和水的体积比为7-8:3-2。
优选地，液相色谱条件为：色谱柱为Zorbax SB-C18(2.1×50mm，1.8μm)，进样量10μL，柱温25℃，流速0.5ml/min；流动相A为10mmol/L乙酸铵-水溶液，流动相B为乙腈溶液；梯度洗脱的方式为0min，流动相B 5％、10min，流动相B 40％、15min，流动相B 100％、20min，流动相B 100％，运行5min；
质谱条件为：电喷雾离子化正离子模式(ESI+)，检测方式为多反应监测(MRM)，离子源温度550℃，喷雾电压5500V，碰撞气压力7psi，气帘气压力30psi，辅助加热气压力60psi，加热气压力50psi。
优选地，步骤S2中，萃取剂用量为300μl。
优选地，步骤S2中，超声震荡的时间为5min。超声震荡的时间对最终的目标物萃取效率影响不大，为了提高效率一般选5min。
优选地，其特征在于，步骤S5的基质配标系列标准工作溶液的制备方法为：移取AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的3mg/L的标准样品苯溶液各1mL至容量瓶中，加入甲醇配制得到浓度为0.2μg/ml的混合标准储备液；分别移取0.025ml、0.05ml、0.1ml、0.25ml、0.5ml、1ml混合标准储备液于各自容量瓶中，用甲醇定容制备成浓度分别为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的混合标准工作液(贮存时-18℃避光贮存)；
处理无霉变烟末样品制备空白净化液，分别取6份空白净化液各1mL，用氮吹浓缩仪浓缩近干(即接近完全干燥)，再分别加入1mL6种所述混合标准工作液，搅拌复溶，即得到基质配标系列标准工作溶液。最终制备的基质配标系列标准工作溶液的浓度范围为1-10ng/ml。
与现有技术相比，本发明的有益之处在于：本发明提供了一种能够用于测定烟叶中黄曲霉毒素等几种黄曲霉毒素的分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱方法，这种方法的样品前处理简单，结果准确，灵敏度高，非常适合于卷烟叶中多种黄曲霉毒素的检测。
附图说明
图1为加标烟叶样品中四种黄曲霉毒素的总离子流色谱图；
图2为本发明的方法采用不同类型萃取剂时的色谱峰面积结果对比；
图3为本发明的方法采用不同用量的相同萃取剂时的回收率结果对比。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
以下实施例所采用的待测烟末的制备方法为：取烟叶和/或烟丝样品(品种为烤烟，选自湖北省烟草质量监督检测站接受的监督检测样品留样)，在30～40℃烘干后，粉碎，过孔径为0.5mm的网筛，取筛下烟末。
以下试验例所采用的黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的标准品(3mg/L苯溶液，)采购自上海安谱科学仪器有限公司。甲醇、甲苯、乙腈(色谱纯)采购自德国CNW公司。二氯甲烷(CH2Cl2)、三氯甲烷(CHCl3)、四氯化碳(CCl4)、二氯乙烷和四氯乙烷等色谱纯试剂(AR)采购自北京百灵威科技有限公司，C18吸附剂采购自上海安谱实验科技股份有限公司；纯净水采购自杭州娃哈哈集团有限公司。其余试剂均为分析纯，试验用水为超纯水。
色谱柱Zorbax SB-C18采购自安捷伦科技(中国)有限公司；Agilent1290infinity-AB API4000超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪采购自美国AB SCIEX公司；称量用的AL204电子天平(感量0.000 1g)采购自瑞士Mettler Toledo公司，KQ-800KDE型高功率数控超声波清洗器采购自昆山市超声仪器有限公司；Talboys数显型多管式旋涡混合器采购自美国Talboys公司；台式高速离心机采购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司。
以下试验例的分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，均采用以下步骤进行：
S1、称取待测烟末样品2.00g置于50ml离心管中，加入80％(体积比)甲醇-水溶液20ml，超声提取20min；
S2、(离心或过滤后)取上清液5ml，加入50mgC18吸附剂，涡旋震荡1min，离心取上层清液1.5ml，加入一定体积的萃取剂，混合均匀，用注射器迅速注入5ml水中，超声振荡一段时间，得到乳浊液；
S3、将步骤S2的乳浊液离心分层，取下层有机溶液，用氮气吹干得到固形物；
S4、将步骤S2的固形物用100μl的50％甲醇-水溶液复溶制成待测液；
S5、移取AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的3mg/L的标准样品苯溶液各1mL至容量瓶中，加入甲醇配制得到浓度为0.2μg/ml的混合标准储备液；分别移取0.025ml、0.05ml、0.1ml、0.25ml、0.5ml、1ml混合标准储备液于各自容量瓶中，用甲醇定容制备成浓度分别为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的混合标准工作液；
按照步骤S1的方法处理无霉变烟末样品制备空白净化液，分别取6份空白净化液各1mL，用氮吹浓缩仪浓缩近干，再分别加入1mL6种所述混合标准工作液，搅拌复溶，即得到基质配标系列标准工作溶液，采用高效液相色谱-串联质谱同时检测混合标准工作液中这几种黄曲霉毒素，建立相应的标准曲线；
S6、将步骤S4的待测液置于色谱瓶内，采用高效液相色谱-串联质谱同时检测待测液中这几种黄曲霉毒素的含量，根据步骤S5的标准曲线进行定量分析。
液相色谱条件为：色谱柱为Zorbax SB-C18(2.1×50mm，1.8μm)，进样量10μL，柱温25℃，流速0.5ml/min；流动相A为10mmol/L乙酸铵-水溶液，流动相B为乙腈溶液；梯度洗脱的方式为0min，流动相B 5％、10min，流动相B 40％、15min，流动相B 100％、20min，流动相B100％，运行5min；
质谱条件为：电喷雾离子化正离子模式，检测方式为多反应监测，离子源温度550℃，喷雾电压5500V，碰撞气压力7psi，气帘气压力30psi，辅助加热气压力60psi，加热气压力50psi。
附图1是采用上述优化液谱和质谱获得的最佳条件下得到的加标烟叶样品中四种黄曲霉毒素的总离子流色谱图，四种黄曲霉毒素的出峰顺序为G2、G1、B2、B1。图1中残留杂质对目标物无明显干扰，目标物获得有效分离，信号良好，由此可以证明采用本发明的方法，有效分离了四种黄曲霉素。
试验例1：不同类型萃取剂试验研究
本试验力研究不同类型萃取剂对萃取效果的影响，采用的分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种真菌毒素黄曲霉毒素的方法基本相同，唯一区别为所选用的萃取剂分别为二氯乙烷、四氯化碳、四氯乙烷、二氯甲烷和氯仿，分别进行检测得到四种黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)的色谱峰面积对比，如图1所示。
从图1中可以看到，当使用二氯乙烷、四氯化碳、四氯乙烷作为萃取剂时，对这六种黄曲霉毒素的综合萃取效果较好，且二氯乙烷为萃取剂时萃取效果最好。
试验例2：萃取剂不同用量(体积)的试验研究
本试验例主要研究不同用量的萃取剂对萃取效率的影响。采用的分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，萃取剂均采用二氯乙烷，唯一区别为二氯乙烷萃取剂用量体积分别为50μl、100μl、150μl、200μl、300μl、400μl，分别进行检测得到的四种黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)的回收率如图2所示。
从图2中可以看到，当二氯化碳萃取剂用量为150、200、300μl时，各黄曲霉毒素的回收率较高。经分析原因可能为，萃取剂的体积太小，沉积在底部的有机相的量也很少，难以转移且重复性较差；萃取剂体积太大时，萃取剂和分散剂无法完全混溶，降低萃取效率，且后续氮气吹干耗时较长。
试验例3：建立混合标准工作曲线
按照与上述实施例和对比例相同的方法处理无霉变的烟末样品，制得相应的空白净化液，配制基质配标系列标准工作溶液进行检测。以各目标物的峰面积Y与其对应的质量浓度X进行线性回归分析，计算得到四种黄曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)的标准工作曲线及相关系数，分别以3倍信噪比和10倍信噪比计算本方法的检测限和定量限，结果如表1所示。在无霉变烟末样品配制的系列基质混合标准工作溶液中分别添加高、中、低浓度(即10.0ng/g、5.0ng/g、1.0ng/g)的黄曲霉毒素标准溶液后，样品按选定的条件进行前处理和色谱分析，并由加标量以及加标测定量计算回收率，步骤S2所用的萃取剂为二氯乙烷，用量为300μl，超声振荡时间30s。结果见表2。
表1 4种黄曲霉毒素的回归方程、相关系数、检出限和定量限
表2分析方法的加标回收率(n＝6)
由上表2、3可以看到，本发明提供的方法检测黄曲霉毒素AFB1和AFB2的定量限为0.47μg/kg和0.50μg/kg，黄曲霉毒素AFG1和AFG2的定量限为0.16μg/kg和0.43μg/kg，且回收率均较高，测定数据的相对标准偏差在4.08-11.61％，表明本发明的方法回收率高，重复性好。
试验例5：实际样品检测
采用本发明建立的方法对15个烟叶样品进行检测，其中1-6号样品为霉变烟叶样品，7-8号为正常烟叶样品，9-12号为霉变卷烟样品，13-15号为正常卷烟样品。检测结果见下表3。
表3实际样品中黄曲霉毒素分析结果，单位μg/kg
从上表3可以看出，正常烟叶和卷烟样品中未检出黄曲霉素；部分霉变烟叶中检出B1或G1，但检出值均较低。
Claims (6)
1.分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、称取待测烟末样品置于离心管中，加入甲醇-水溶液，待测烟末样品用量为0.1g/ml，超声提取20min；
S2、取上清液5ml，加入50mgC18吸附剂，涡旋震荡1min，离心取上层清液1.5ml，加入不少于300μl萃取剂，混合均匀，迅速注入5ml水中，超声振荡3-6min得到乳浊液；
所述萃取剂为二氯乙烷和/或氯仿；
S3、将步骤S2的乳浊液离心分层，取下层有机溶液，用氮气吹干得到固形物；
S4、将步骤S2的固形物用100μl的50％甲醇-水溶液复溶制成待测液；
S5、配置四种黄曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的基质配标系列标准工作溶液，采用高效液相色谱-串联质谱同时检测混合标准工作液中黄曲霉毒素，建立相应的标准曲线；
S6、将步骤S4的待测液置于色谱瓶内，采用高效液相色谱-串联质谱同时检测待测液中黄曲霉毒素的含量，根据步骤S5的标准曲线进行定量分析。
2.根据权利要求1所述的分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，其特征在于，步骤S1中，甲醇-水溶液中甲醇和水的体积比为7-8:3-2。
3.根据权利要求1所述的分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，其特征在于，液相色谱条件为：色谱柱为Zorbax SB-C18(2.1×50mm，1.8μm)，进样量10μL，柱温25℃，流速0.5ml/min；流动相A为10mmol/L乙酸铵-水溶液，流动相B为乙腈溶液；梯度洗脱的方式为0min，流动相B 5％、10min，流动相B 40％、15min，流动相B 100％、20min，流动相B 100％，运行5min；
质谱条件为：电喷雾离子化正离子模式，检测方式为多反应监测，离子源温度550℃，喷雾电压5500V，碰撞气压力7psi，气帘气压力30psi，辅助加热气压力60psi，加热气压力50psi。
4.根据权利要求1所述的分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，其特征在于，步骤S2中，萃取剂用量为300μl。
5.根据权利要求1所述的分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，其特征在于，步骤S2中，超声震荡的时间为5min。
6.根据权利要求1所述的分散液液微萃取-高效液相色谱-串联质谱同时测定烟叶中多种黄曲霉毒素的方法，其特征在于，步骤S5的基质配标系列标准工作溶液的制备方法为：移取AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的3mg/L的标准样品苯溶液各1mL至容量瓶中，加入甲醇配制得到浓度为0.2μg/ml的混合标准储备液；分别移取0.025ml、0.05ml、0.1ml、0.25ml、0.5ml、1ml混合标准储备液于各自容量瓶中，用甲醇定容制备成浓度分别为0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、20ng/mL的混合标准工作液；
处理无霉变烟末样品制备空白净化液，分别取6份空白净化液各1mL，用氮吹浓缩仪浓缩近干，再分别加入1mL6种所述混合标准工作液，搅拌复溶，即得到基质配标系列标准工作溶液。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210806 |
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