CN114791470A

CN114791470A - 一种高效液相色谱串联质谱检测血液中多粘菌素的方法和应用

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Publication number: CN114791470A
Application number: CN202210720593.3A
Authority: CN
Inventors: 刘春冉; 贾永娟; 张�杰; 倪君君
Original assignee: Beijing Harmony Health Medical Diagnostics Co ltd
Current assignee: Beijing Harmony Health Medical Diagnostics Co ltd
Priority date: 2022-06-24
Filing date: 2022-06-24
Publication date: 2022-07-26

Abstract

本发明涉及医药检测技术领域，尤其涉及一种高效液相色谱串联质谱检测血液中多粘菌素的方法和应用。多粘菌素包括多粘菌素B1和多粘菌素B2，方法包括：制备标准曲线方程，处理得到待测样品，使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中多粘菌素的浓度。本发明在满足检测要求的前提下，简化前处理操作，提高定量结果准确性，缩短分析时间。

Description

一种高效液相色谱串联质谱检测血液中多粘菌素的方法和应用

技术领域

本发明涉及医药检测技术领域，尤其涉及一种高效液相色谱串联质谱检测血液中多粘菌素的方法和应用。

背景技术

多粘菌素是一类非核糖体碱性多肽类抗菌药物，1947年首次从多粘类芽孢杆菌中分离出来，包括A、B、C、D、E 等形式。其中，多粘菌素E（polymyxin E，PE或colis-tin）和多粘菌素B（polymyxin B，PB）均于1950年批准用于临床，但是严重的肾毒性和神经毒性限制了其在1970年代初期的使用。近年来，由于细菌耐药菌株的产生，多粘菌素又重新进入临床使用。2019年由多家国际学术组织联合发布的多粘菌素国际共识中建议，PB的疗效及毒性控制可参照PE的达稳态后24 h药时曲线下面积（AUCSS，24h）及平均稳态浓度（CSS，AVG）。采用PE的参数主要是因为PB的临床药动学数据缺乏。然而指南中并没有明确指出血药浓度监测的方法和主要成分。PB治疗窗窄、不良反应发生率高，其常见不良反应为剂量依赖的肾毒性及神经毒性，其中肾毒性最为常见，主要表现为急性肾损伤（AKI），以急性肾小管坏死多见；神经毒性主要表现为感觉异常。因此，开展多粘菌素的血药浓度监测，能够保证疗效的同时减少不良反应的发生。

PB是30多种多粘菌素成分（主要成分PB1、PB2、PB3和PB4）的混合物，最主要的成分由含有脂肪酰基(S)-6-甲基辛酰基的B1（PB1）和含有脂肪酰基6-甲基庚酰基的多粘菌素B2（PB2）构成。

目前测定血液中多粘菌素B1、B2含量通常采用的方法为高效液相色谱质谱联用法。但已被报道的文献方法大多存在着前处理操作较复杂，定量结果准确性差，分析时间较长等问题，尚不适于大通量的样本检测。由于目前市面上没有多粘菌素B1、多粘菌素B2的同位素内标，因此目前的检测方法一般会使用其他多粘菌素类物质作为内标。而当待测样本中含有该作为内标的多粘菌素类物质时，就会引发检测误差。

因此，有必要提出一种检测方法简单、准确性高的多粘菌素B1/B2的液相色谱质谱分析方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血液中多粘菌素的方法和应用。

本发明提供了一种高效液相色谱串联质谱检测血液中多粘菌素的方法，多粘菌素包括多粘菌素B1和多粘菌素B2，方法至少包括以下步骤：

S1、制备标准曲线方程，包括：

配制标准工作液和内标工作液；内标工作液中采用喹硫平-D8为内标物；标准工作液中含有多粘菌素B1对照品和多粘菌素B2对照品；将标准工作液、内标工作液和甲酸水溶液混合后得到含有不同多粘菌素浓度的标准溶液；将标准溶液采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得标准曲线方程；

S2、处理得到待测样品，包括：取待测血液加入内标工作液和蛋白沉淀剂；混合、离心后得到待测样本；蛋白沉淀剂选自磺基水杨酸；

S3、检测待测样品，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对待测样本进行检测，将检测结果代入标准曲线方程，得到待测样本中多粘菌素的浓度。

本发明还提供了上述方法在监测多粘菌素B1、B2血药浓度中的应用。

本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点：

本发明的检测方法在满足检测要求的前提下，简化前处理操作，提高定量结果准确性，缩短分析时间。

本发明创新的利用了喹硫平-D8为内标物，避免了使用其他多粘菌素类物质作为内标时引发检测误差的问题。

本发明的检测方法采用磺基水杨酸作为蛋白沉淀剂，达到回收率良好的技术效果。

本发明通过对前处理方法的改进，从而可达到不添加基质血前处理条件下回收率良好的技术效果。

本发明的检测方法在0.005 μg/mL到0.952 μg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900。

本发明的检测方法重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。血浆经蛋白沉淀后直接进样，使检测过程简便快速，实验成本降低，分析时间短，更利于大通量的样本检测。

附图说明

图1为实验例1中标准溶液中多粘菌素B1色谱图；

图2为实验例1中标准溶液中多粘菌素B2色谱图；

图3为实验例1中加标血清样本中多粘菌素B1色谱图；

图4为实验例1中加标血清样本中多粘菌素B2色谱图；

图5为实验例1中标准溶液中多粘菌素B1、多粘菌素B2和内标色谱图；

图6为实验例1中加标血清样本中多粘菌素B1、多粘菌素B2和内标色谱图；

图7为对比例1中标准溶液的色谱图；

图8为对比例2中标准溶液的色谱图；

图9为对比例2中加标血清样本的色谱图。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施；显然，说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明实施例提出一种高效液相色谱串联质谱检测血液中多粘菌素的方法，多粘菌素包括多粘菌素B1和多粘菌素B2，方法至少包括以下步骤：

S1、制备标准曲线方程，包括：

配制标准工作液和内标工作液；内标工作液中采用喹硫平-D8为内标物，标准工作液中含有多粘菌素B1对照品和多粘菌素B2对照品；

将标准工作液、内标工作液和甲酸水溶液混合后得到含有不同多粘菌素浓度的标准溶液；

标准溶液采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得标准曲线方程；

S2、处理得到待测样品，包括：取待测血液加入内标工作液和蛋白沉淀剂；混合、离心后得到待测样本；蛋白沉淀剂选自磺基水杨酸（SSA）；

本发明通过采用甲酸水溶液制备标准溶液，同时选用SSA作为蛋白沉淀剂，保证在没有同位素内标的前提下、标曲不需要添加基质进行前处理，从而可以在满足检测要求的前提下，简化前处理操作的步骤。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，甲酸水溶液为体积百分比浓度为0.05~ 0.2%的甲酸水溶液，甲酸水的浓度会对多粘菌素B1、B2的稳定性带来一定影响，因此更优选体积百分比浓度为0.1 %的甲酸水溶液。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，标准工作液采用含有体积百分比浓度为0.05 ~ 0.2%甲酸的甲醇：水的体积比为1：1 ~ 7：3的溶液配制（下文称稀释液），甲酸的体积百分比浓度优选为0.1 %。采用该稀释液不仅可以确保多年菌素B1和B2的溶解性，同时还可保证多粘菌素B1和B2的稳定性。

为了进一步提高稳定性能，稀释液优选为含有体积百分比浓度为0.1%甲酸的甲醇：水的体积比为1：1。

作为一个具体的实施方式，标准工作液的配制可采用以下方法：

（1）采用多粘菌素B1甲酸盐标准品，以上述稀释液配制母液A，母液A 浓度可以为500 ~ 1000 μg/mL；

（2）采用多粘菌素B2甲酸盐标准品，以上述稀释液配制母液B, 母液B浓度可以为500 ~ 1000 μg/mL；

（3）将母液A和母液B等浓度、等体积混合，以上述稀释液进行稀释，所得的标准工作液中多粘菌素B1、B2浓度分别可以为50 ~ 200 μg/mL，优选分别可以为100 μg/mL，便于后续的配制；

（4）以上述稀释液进行稀释，配制得到8个浓度梯度的溶液，具体的，多粘菌素B1、B2的浓度可分别为0.05 μg/mL、0.10 μg/mL、0.25 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00 μg/mL的溶液，并在-20℃条件下保存；

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，内标工作液采用含有体积百分比浓度为0.05 ~ 0.2%甲酸的甲醇：水体积比为1：1 ~ 7：3的溶液（下文称稀释液）配制，甲酸的体积百分比浓度优选为0.1 %。采用该溶剂不仅可以确保多年菌素B1和B2的溶解性，同时还可保证多粘菌素B1和B2的稳定性。

为了进一步提高稳定性能，稀释液采用含有体积百分比浓度为0.1%甲酸的甲醇：水体积比为1：1的溶液，内标工作液中喹硫平-D8浓度为5 ~ 500 ng/mL，优选为50 ng/mL。

作为一个具体的实施方式，内标工作液的配制可采用以下方法：

（1）以上述稀释液配制喹硫平- D8标准储备液浓度为50 ~ 500 μg/mL，优选为100μg/mL，

（2）以上述稀释液进行稀释，所得的标准内标液中喹硫平-D8浓度可以为20 ~ 100ng/mL，优选可以为50 ng/mL，该内标工作液-20℃条件下保存。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，在S1中，标准工作液、内标工作液和甲酸水溶液的体积比为20：10：100 ~ 300，优选20：10：150。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，在S1中，混合的条件为在转速为1500~ 2500 rpm下涡旋混匀3 ~ 8分钟，优选1000 ~ 2000 rpm下涡旋混匀5分钟，取上清液进行检测。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，在S1中，将获得的多种不同浓度的多粘菌素B1、B2和内标物的标准溶液采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，从多粘菌素B1、B2和内标物的标准溶液色谱图中分别得到多粘菌素B1、B2和内标物的峰面积，分别以上述多个不同浓度的多粘菌素B1、B2标准溶液的峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述多粘菌素B1、B2标准工作液中的浓度与内标工作液浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的多种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y=a*x + b，并且得出线性方程系数a、b。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，本发明实施例里对蛋白沉淀剂进行了筛选，实验发现，甲醇、乙腈、TCA等蛋白沉淀剂在本发明的条件下，会带来回收率不合格的缺陷，因此，在本发明实施例中S2中，蛋白沉淀剂选自SSA，从而克服了上述缺陷，达到了回收率良好的技术效果。

具体的，SSA的质量百分比含量为4 ~ 10%；并进一步优选为质量百分比含量为6%的SSA。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，待测血液、内标工作液和蛋白沉淀剂的体积比为20：10：100 ~ 300，优选20：10：150。其中，待测血液、内标工作液的比例固定为2：1。

本发明实施例的方法，通过对前处理方法的改进，从而可以保证标曲不添加基质血前处理条件下回收率均合格。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，在S2中，混合的条件为在转速为1500~ 2500 rpm下涡旋混匀3 ~ 8 min，优选为在转速为1000 ~ 3000 rpm下涡旋混匀5 min；离心的条件为在转速为10000 ~ 14000 rpm下离心5 ~ 15分钟，优选为在转速为12000 ~14000 rpm下离心10分钟。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，在S3中，使用高效液相色谱质谱联用仪对上述步骤S2获得的待测样品进行检测，得出上述待测样品的多粘菌素B1、B2与内标的色谱图，从上述多粘菌素B1、B2与内标色谱图中可以得到多粘菌素B1、B2与内标峰面积，将多粘菌素B1、B2与内标峰面积的比值y1代入上述步骤（一）的标准曲线方程y=a*x + b中，通过计算得到待检测样品中多粘菌素B1、B2与内标物的相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该待检测血液样本中的多粘菌素B1、B2的浓度。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，在S1和S3中，高效液相色谱采用C18柱；所采用C18柱的粒径为2 ~ 5 μm；并优选3 μm，所采用C18柱的内径优选为2.1 ~ 3.0mm，C18柱的长度优选为50 ~ 100 mm；具体可选用的柱子例如：phenomenex Luna OmegaPolar C18 2.1×50 mm，3 μm；phenomenexKinetex Polar C18 2.1×50 mm，3 μm； Shim-pack Velox SP-C18 2.1×50mm，2.7 μm等。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，高效液相色谱的流动相包括：A相：含2~ 10 mmol/L甲酸铵或乙酸铵、0.05 ~ 0.2%（v/v）甲酸的水；B相：含0 ~ 0.2%（v/v）甲酸的乙腈或甲醇。

优选的，高效液相色谱的流动相组成为：A相：含3 ~ 8 mmol/L甲酸铵或乙酸铵、0.1 ~ 0.2%（v/v）甲酸的水；B相：含0 ~ 0.1%（v/v）甲酸的乙腈或甲醇。

更优选的，高效液相色谱的流动相组成为：A相：含5 mmol/L甲酸铵、0.2%（v/v）甲酸的水；B相：乙腈。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，高效液相色谱的其他条件为：流速为0.25 ~ 0.5 mL/min，进一步优选0.3 mL/min。柱温：30 ~ 50℃，优选35 ~ 45℃，进一步优选40℃。进样量：1 ~ 20 µL，优选1 ~ 10 µL，进一步优选5 µL；分析时间为3.5 ~ 5.5 min，进一步优选 4.5 min。

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，高效液相色谱的梯度洗脱条件为：

0 ~ 1.00分钟，A相：80 ~ 100%；B相：0 ~ 20%；

1.01 ~ 2.00分钟，A相：80 ~ 90%；B相：10 ~ 20%；

2.50 ~ 3.50分钟，A相：35 ~ 65%；B相：35 ~ 65%；

3.51 ~ 5.50分钟，A相：80 ~ 100%；B相：0 ~ 20%。

优选为：

0 ~ 1.00分钟，A相：93 ~ 100%；B相：0 ~ 7%；

1.01 ~ 2.00分钟，A相：80 ~ 85%；B相：15 ~ 20%；

2.50 ~ 3.50分钟，A相：35 ~ 55%；B相：45 ~ 65%；

3.51 ~ 4.50分钟，A相：93 ~ 100%；B相：0 ~ 7%。

由于多粘菌素B1和多粘菌素B2属于结构类似物，因此其质谱分析中两种物质会有离子通道的串扰，因此需要在高效液相色谱阶段将两者有效分离。采用本发明实施例的高效液相色谱条件所获得的多粘菌素B1和多粘菌素B2的分离度良好，从而确保多粘菌素B1和多粘菌素B2的准确定量。

作为本发明实施例的一种优选的技术方式，高效液相色谱的梯度洗脱条件如表1所示：

表1

作为本发明实施例的一种优选的技术方案，质谱检测的条件为：

雾化温度：350 ~ 600 ℃；

电喷雾电压：3500 ~ 5500 V；

气帘气：20 ~ 35L/min；

碰撞气：6 ~ 10 L/min；

雾化气：40 ~ 60 L/min

辅助气：40 ~ 60 L/min。

在具体的实施方式中，质谱检测器采用SCEIX AB4500检测器，采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，多反应监测（MRM）具体参数如表2和表3所示：

表2：离子源参数

表3：离子对参数

本发明实施例使用的英文中文对照如表4所示：

表4

本发明实施例还涉及上述方法在监测多粘菌素B1、B2血药浓度中的应用，其中，检测样本可以为全血。本发明实施例的方法线性范围宽，灵敏度高，进而准确监测多粘菌素B1、B2在血液中的浓度，并可绘制血药浓度曲线，用于研究相关药物的代谢情况。

下面通过具体实施对本发明实施例的技术方案做进一步的解释和说明，本发明的原料均为市售。所采用的主要原料和仪器如下：

1、仪器设备：

（1）液质联用仪：Exion LC AC / TRIPLE QUAD 5500，AB SCIEX， USA；

（2）离心机：Eppendorf 5804R 高速离心机，Eppendorf AG，USA；

Sartorius Α-14C 高速离心机，Satorius，德国；

（3）氮吹仪：MD200-2，杭州奥盛，China；

（4）旋涡混匀器：MIX-25P，MIΜL AB，China；

（5）超纯水仪：CascadaII I-10，Pall，USA。

2、试剂与原料如表5所示：

表5

3、其他试剂

超纯水：自制；

乙腈：4 L，LC-MS Grade，Fisher，USA；

甲酸：50 mL，LC-MS Grade，Fisher，USA；

甲醇：4 L，HPLC Grade，Merck，USA；

乙酸铵、甲酸铵：250 G，LC-MS Grade，Sigma，USA；

在本发明实施例中，甲醇、甲酸等有机溶剂的浓度均为体积百分比浓度。

实施例1

本实施例提出高效液相色谱串联质谱检测血液中多粘菌素的方法，包括以下步骤：

（一）溶液的配制：

1、多粘菌素B1甲酸盐标准品的规格为1.00 mg，加入1 mL甲醇：水=1：1含（0.1%FA）直接全部溶解，纯度为95%，甲酸盐个数为4.5，得到浓度为811 μg/mL的母液。

多粘菌素B2甲酸盐标准品的规格为1.00 mg，加入1 mL甲醇：水=1：1含（0.1%FA）直接全部溶解，纯度为95%，甲酸盐个数为6.5，得到浓度为759 μg/mL的母液。

用甲醇：水=1：1含（0.1%FA）溶液进行稀释，所得的标准工作液中多粘菌素B1、B2浓度为100 μg/mL，

然后继续用上述甲醇：水=1：1含（0.1%FA）溶液进行稀释，配制成浓度分别为0.05μg/mL、0.10 μg/mL、0.25 μg/mL、0.50 μg/mL、1.00 μg/mL、2.00 μg/mL、5.00 μg/mL、10.00μg/mL的多粘菌素B1、B2溶液，并在-20℃条件下保存；

2、内标工作液的配制：喹硫平- D8标准储备液浓度为100 μg/mL，用甲醇：水=1：1含（0.1%FA）溶液进行稀释，所得的标准内标液中喹硫平-D8浓度为50 ng/mL，该内标工作液-20℃条件下保存；

（二）标准溶液的标定

首先用移液器分别移取20 μL混合标准工作液、10 μL内标工作液和150 μL水含0.1%FA分别置于1.5 mL离心管中混合制成八种不同浓度的标准溶液，将上述标准溶液分别在转速为1000 ~ 2000 rpm下涡旋混匀30s ~ 1min后，取150 μL上清液，利用高效液相色谱质谱联用仪对上述溶液进行检测，得到八种不同浓度的多粘菌素B1、B2和内标物的标准溶液色谱图，从上述多粘菌素B1、B2和内标物的标准溶液色谱图中分别得到多粘菌素B1、B2和内标物的峰面积，分别以上述八个不同浓度的多粘菌素B1、B2标准溶液的峰面积与内标物峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述多粘菌素B1、B2标准工作液中的浓度与内标工作液浓度的比值为作为标准曲线方程的横坐标x1，将以上检测所得的八种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y=a*x + b，并且得出线性方程系数a、b；标准工作液为含有多粘菌素B1、B2的溶液，内标工作液为含有喹硫平-D8的溶液。

（三）待测样品处理

用移液枪移取20 μL血清待测样品，加入10 μL内标工作液，加入150 μL 6%SSA，2000 r/min混匀5min，14000 r/min离心10 min，取上清150 μL进样分析，进样量为5 μL；

（四）待测样品的检测

使用高效液相色谱质谱联用仪对上述步骤（四）待测的样品进行检测，得出上述待测样品的多粘菌素B1、B2与内标的色谱图，从上述多粘菌素B1、B2与内标色谱图中可以得到多粘菌素B1、B2与内标峰面积，将多粘菌素B1、B2与内标峰面积的比值y1代入上述步骤（二）的标准曲线方程y=a*x + b中，通过计算得到待检测样品中多粘菌素B1、B2与内标物的相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该待检测血液样本中的多粘菌素B1、B2的浓度。

色谱分析所使用的色谱柱为phenomenex Luna Omega Polar C18 2.1×50 mm，3μm；色谱条件同表1。质谱检测器是SCEIX AB4500检测器，采用电喷雾离子源（ESI），正离子模式，多反应监测（MRM）具体参数见同表2和表3。

实验例1

本实施例用于说明本发明检测方法的线性和回收率和精密度：

一、线性

将实施例1配制的10 μL的各个浓度的多粘菌素B1、B2标准工作液，分别加入10 μL内标工作液，加入150 μL水含0.1%FA分别置于1.5 mL离心管中混合制成八种不同浓度的标准溶液，将上述标准溶液分别在转速为1000 ~ 2000 rpm下涡旋混匀30s ~ 1min后，取150μL上清液，进样5 μL至LC-MS/MS分析。多粘菌素B1、B2浓度在0.005 μg/mL到0.952 μg/mL范围内，按实施例1的测定条件，按浓度由低到高进行测定，以多粘菌素B1、B2的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值-多粘菌素B1、B2的浓度与内标物的浓度的比值作图，得到标准曲线；结果表明多粘菌素B1、B2在0.005μg/mL到0.952μg/mL范围内，线性良好，相关系数R2﹥0.9900。

二、定量下限

多粘菌素B1：0.01 µg/mL；

多粘菌素B2：0.04 µg/mL。

三、回收率和精密度

分别取多粘菌素B1、B2标准工作液配制成低、中、高3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，实施例1的方法进行测定，重复分析测定5批次，多粘菌素B1、B2回收率和精密度分别如表4、表5所示。多粘菌素B1在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为107.75% ~ 109.70%，相对标准偏差为1.73% ~ 3.80%，多粘菌素B2在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为104.67% ~ 110.25%，相对标准偏差为3.08% ~ 4.08%。

表6：多粘菌素B1加标回收率和精密度

表7：多粘菌素B2加标回收率和精密度

综合上述验证试验，本实施例的回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中多粘菌素B1、B2含量，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。血浆经蛋白沉淀后直接进样，使检测过程简便快速，实验成本降低，分析时间短，更利于大通量的样本检测。

实验结果：标准溶液中多粘菌素B1、B2的色谱图见图1和图2，多粘菌素B1、B2的保留时间分别为：3.22分钟、2.82分钟。

血清样本中多粘菌素B1、B2的色谱图见图3和图4，多粘菌素B1、B2的保留时间与标准溶液一致。

图5为标准溶液中多粘菌素B1、多粘菌素B2和内标色谱图；图6为加标血清样本中多粘菌素B1、多粘菌素B2和内标色谱图，多粘菌素B1、多粘菌素B2色谱峰的分离度良好。

实验例2

用不同体积百分比浓度的甲酸水溶液配制多粘菌素B1、B2的溶液，在常温条件下检测其稳定性，经过3小时，检测多粘菌素B1、B2的含量如表8所示：

表8：多粘菌素B1、B2的稳定性

根据表8的试验结果可知，采用其他浓度的甲酸水溶液无法保证多粘菌素B1、B2的稳定性。

实验例3

按照实验例1的条件进行检测，区别在于：在（二）中，标准工作液、内标工作液和甲酸水溶液的体积比分别为20：10：100、20：10：90、20：10：200、20：10：300、20：10：400，然后按照上实验例1相同的方法检测回收率，实验结果如表9所示：

表9：多粘菌素B1、B2加标量为1 μg/mL的回收率

根据表9的试验结果可知，标准工作液、内标工作液和甲酸水溶液的体积比为20：10：100 ~ 300，可以保证标曲不添加基质血前处理条件下回收率均合格。

实验例4

按照实验例1的条件进行检测，区别在于：在（三）中，蛋白沉淀剂选自表10所示的物质，然后按照上实验例1相同的方法检测回收率，实验结果如表10所示：

表10：多粘菌素B1、B2加标量为1μg/mL的回收率

其中，甲醇和乙腈的浓度为体积百分比浓度，4%TCA、5%高氯酸和6%SSA溶液的浓度为质量百分比浓度；

根据表10的试验结果可知，采用其他蛋白沉淀剂，无法达到本发明实施例的回收率效果。

对比例1

本实施例用于说明色谱柱、流动相、梯度洗脱的技术效果：

采用如表11所示的高效液相色谱条件，其余条件均同实施例，对标准溶液进行检测，获得色谱图如图7所示。

表11

由图7所示，梯度变化时，如果第一梯度有机相比例超过20%，第二梯度有机相比例超过65%，多粘菌素B1和多粘菌素B2分离度较差。因为两个物质离子通道有串扰，所以需要液相进行分离，进而才能保证检测结果准确性。

对比例2

本实施例用于说明色谱柱、流动相、梯度洗脱的技术效果：

采用如表12所示的高效液相色谱条件，其余条件均同实施例，分别对标准溶液和加标血清样本进行检测，获得色谱图分别如图8和图9所示。

表12

由图8和图9所示的色谱图可知，在该色谱柱条件下，标准溶液的峰形尚可，但是加标血清样本中多粘菌素B1和多粘菌素B2的峰形不好。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.一种高效液相色谱串联质谱检测血液中多粘菌素的方法，其特征在于，所述多粘菌素包括多粘菌素B1和多粘菌素B2，所述方法至少包括以下步骤：

S1、制备标准曲线方程，包括：

配制标准工作液和内标工作液；所述内标工作液中采用喹硫平-D8为内标物；所述标准工作液中含有多粘菌素B1对照品和多粘菌素B2对照品；

将所述标准工作液、所述内标工作液和甲酸水溶液混合后得到含有不同多粘菌素浓度的标准溶液；

将所述标准溶液采用高效液相色谱质谱联用仪进行检测，获得标准曲线方程；

S2、处理得到待测样品，包括：取待测血液加入所述内标工作液和蛋白沉淀剂；混合、离心后得到所述待测样本；所述蛋白沉淀剂选自磺基水杨酸；

S3、检测所述待测样品，包括：使用高效液相色谱质谱联用仪对所述待测样本进行检测，将检测结果代入所述标准曲线方程，得到所述待测样本中多粘菌素的浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S1中，

所述甲酸水溶液为体积百分比浓度为0.05 ~ 0.2%的甲酸水溶液；

所述标准工作液采用含有体积百分比浓度为0.05 ~ 0.2%甲酸的甲醇：水的体积比为1：1 ~ 7：3的溶液配制，所述多粘菌素B1对照品和所述多粘菌素B2对照品的浓度相同；

所述内标工作液采用含有体积百分比浓度为0.05 ~ 0.2%甲酸的甲醇：水的体积比为1：1 ~ 7：3的溶液配制，所述内标工作液中喹硫平-D8浓度为20~ 100 ng/mL。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S1中，所述标准工作液、所述内标工作液和所述甲酸水溶液的体积比为20：10：100 ~ 300；所述混合的条件为在转速为1500 ~ 2500rpm下涡旋混匀3~8分钟，取上清进行检测。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2中，所述蛋白沉淀剂为质量百分比含量为4 ~ 10%的SSA；所述待测血液、所述内标工作液和所述蛋白沉淀剂的体积比为20：10：100 ~ 300，优选20：10：150。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S2中，所述混合的条件为在转速为1500~ 2500 rpm下涡旋混匀3 ~ 8 min，所述离心的条件为在转速为10000 ~ 14000 rpm下离心5 ~ 15分钟，取上清进行检测。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S1和S3中，所述高效液相色谱采用C18柱；C18柱的粒径为2 ~ 5 μm；流动相：A相：含2 ~ 10 mmol/L的甲酸铵或乙酸铵、0.05 ~0.2%（v/v）甲酸的水；B相：含0 ~ 0.2%（v/v）甲酸的甲醇或乙腈；流速：0.25 ~ 0.5 mL/min；柱温：30 ~ 50℃；进样量：1 ~ 20 µL；分析时间：3.5 ~ 5.5 min。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的洗脱条件为：0 ~1.00分钟，A相：80 ~ 100%；B相：0 ~ 20%；1.01 ~ 2.00分钟，A相：80 ~ 90%；B相：10 ~ 20%；2.50 ~ 3.50分钟，A相：35 ~ 65%；B相：35 ~ 65%；3.51 ~ 5.50分钟，A相：80 ~ 100%；B相：0~ 20%。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S1和S3中，所述质谱的检测的条件为：雾化温度：350 ~ 600 ℃；电喷雾电压：3500 ~ 5500 V；气帘气：20 ~ 35L/min；碰撞气：6 ~10 L/min；雾化气：40 ~ 60 L/min；辅助气：40 ~ 60 L/min。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在S1和S3中，所述质谱的检测的条件为：雾化温度：350 ~ 600 ℃；电喷雾电压：3500 ~ 5500 V；气帘气：20 ~ 35L/min；碰撞气：6 ~10 L/min；雾化气：40 ~ 60 L/min；辅助气：40 ~ 60 L/min。

10.如权利要求1~9任一项所述的方法在监测多粘菌素B1、B2血药浓度中的应用。