CN114924015B

CN114924015B - 一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法

Info

Publication number: CN114924015B
Application number: CN202210682492.1A
Authority: CN
Inventors: 向俊; 荆辉华; 陈晓青; 刘琦; 陈同强
Original assignee: Hunan Institute Of Commodity Quality Inspection; Central South University
Current assignee: Hunan Institute Of Commodity Quality Inspection; Central South University
Priority date: 2022-06-16
Filing date: 2022-06-16
Publication date: 2023-06-27
Anticipated expiration: 2042-06-16
Also published as: CN114924015A

Abstract

本申请提出了一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法，涉及分析化学技术领域。步骤包括：称取苦参碱和氧化苦参碱标准品，分别采用甲醇配制成浓度为1.0μg/mL的标准使用溶液；将标准使用溶液采用乙腈‑水溶液配制成梯度苦参碱标准工作液和氧化苦参碱标准工作液；往蜂蜜样品中加水溶解，然后加入氨水乙腈和无水硫酸钠混合，离心后取上清液进行氮吹，然后采用乙腈‑水溶液溶解得到样品待测液，采用超高效液相色谱‑串联质谱仪进行质谱和色谱测试，对比得到蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的含量。本申请方法可靠性高，快速准确，适用于蜂蜜样品的批量检测。

Description

一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法

技术领域

本申请涉及分析化学技术领域，具体而言，涉及一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法。

背景技术

目前关于苦参碱和氧化苦参碱的检测方法报道多集中于作为含量较高的原料和药物使用方面，如苦参作物，中药饮片、复方苦参汤和抗妇炎胶囊等。目前，还鲜见关于蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱检测的报道。

发明内容

本申请的目的在于提供一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法，此检测方法对于蜂蜜产品中苦参碱和氧化苦参碱具有可靠性高和快速准确的优点。

本申请解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。

本申请实施例提供一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法，包括以下步骤：

称取苦参碱和氧化苦参碱标准品，采用甲醇配制成浓度为1.0μg/mL 的标准使用溶液；将标准使用溶液采用乙腈-水溶液配制成浓度为1.0、5.0、 10、20、50、80、100ng/mL的标准工作液；

往蜂蜜样品中加水溶解，然后加入氨水乙腈和无水硫酸钠混合，离心后取上清液进行氮吹，然后采用乙腈-水溶液溶解得到样品待测液；

将标准工作液与样品待测液采用超高效液相色谱-串联质谱仪进行质谱和色谱测试，对比得到蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的含量。

相对于现有技术，本申请的实施例至少具有如下优点或有益效果：

本研究建立了液液萃取结合UPLC-MS/MS检测蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的分析方法。此方法前处理简单，灵敏度高，回收率稳定，将该方法用于市售蜂蜜的测定，可以成功检测出蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的含量，方法可靠性高，快速准确，适用于蜂蜜样品的批量检测，可以成为蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱残留的常规检测技术。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本申请实验例中标准溶液与不同样品的MRM色谱图；

图2为本申请实验例中不同萃取体系及盐种类的回收率；

图3为本申请实验例中不同比例的蜂蜜质量(m)与加水体积(V)的回收率；

图4为本申请实验例中不同比例萃取剂用量的回收率；

图5为申请实验例中不同盐析剂用量的回收率。

具体实施方式

为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考具体实施例来详细说明本申请。

一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法，包括以下步骤：

在本申请的一些实施例中，上述标准使用溶液的配制过程为：称取苦参碱和氧化苦参碱标准品，先采用甲醇配制成100～1000.0μg/mL标准溶液储备溶液，然后用甲醇将标准溶液储备溶液稀释成5.0～50.0μg/mL的中间液，最后用甲醇将中间液稀释成1.0μg/mL的标准使用溶液。

在本申请的一些实施例中，上述乙腈-水溶液中乙腈的含量为85～92％，乙腈-水溶液中含有0.1～0.2％质量的甲酸。

在本申请的一些实施例中，上述蜂蜜样品与水的比例为1g：3～4mL；蜂蜜样品与氨水乙腈的比例为1g：5～8mL，氨水乙腈的体积比为0.1～ 0.15％；蜂蜜样品与无水硫酸钠的质量比为1：1.5～3.0。

在本申请的一些实施例中，上述加水溶解和混合均采用涡旋振荡，振荡时间为3～8min。

在本申请的一些实施例中，上述离心速率为10000～15000r/min，离心时间为3～8min。

在本申请的一些实施例中，上述质谱测试的条件为：采用电喷雾离子源，正离子模式扫描，离子源温度为130～160℃，喷雾电压为1.8～2.2KV，多重反应监测模式，加热气温度为450～550℃，脱溶剂气流量为800～ 1200L/H。

在本申请的一些实施例中，上述质谱测试时的苦参碱的定量离子对为 249.2＞148.2，定性离子对为249.2＞110.2，氧化苦参碱的定量离子对为 265.2＞205.2，定性离子对为265.2＞148.2。

本申请中苦参碱与氧化苦参碱特征离子对及碰撞能量参数如表1所示。

表1苦参碱和氧化苦参碱的质谱参数

本申请选用信号较高的例子为定量离子对，因此苦参碱的定量离子对为249.2＞148.2，定性离子对为249.2＞110.2，氧化苦参碱的定量离子对为 265.2＞205.2，定性离子对为265.2＞148.2。

在本申请的一些实施例中，上述色谱测试的条件为：采用Inspire HILIC 色谱柱，流动A相为0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵溶液，流动B相为乙腈；柱温为32～38℃，进样量为4.0～6.0μL。

在本申请的一些实施例中，上述色谱测试的梯度洗脱程序为：0～ 2.0min，10％A；2.0～3.0min，10％～80％A；3.0～6.0min，80％A；6.0～ 6.5min，80％～10％A；6.5～10.0min，10％A。

以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法，包括以下步骤：

标准使用溶液配制：准确称取定量苦参碱和氧化苦参碱标准品用甲醇溶解，分别配制成1000.0μg/mL标准溶液储备溶液，再准确量取定量的 1000.0μg/mL标准溶液，用甲醇稀释成10.0μg/mL的中间液，再将10.0μg/mL 的中间液稀释成1.0μg/mL的混合标准使用溶液，放置于冰箱内4℃冷藏保存；

纯溶剂标准溶液配制：分别移取一定体积的1.0μg/mL的混合标准使用溶液，用90％的乙腈-水溶液(含0.1％甲酸)定容，配制成浓度分别为1.0、 5.0、10、20、50、80、100ng/mL的标准工作液。

蜂蜜搅拌均匀，取试样1.0g(精确至0.01g)于15mL离心管中，加入 3mL超纯水涡旋振荡使蜂蜜充分溶解，加入6.0mL0.1％氨水乙腈，加入无水硫酸钠1.5g，涡旋振荡5min，使0.1％氨水乙腈与样品溶液充分萃取， 10000r/min离心5min，准确吸取3.0mL上清液氮吹至近干，然后采用乙腈- 水溶液溶解获得样品待测液；

分别将苦参碱标准工作液、氧化苦参碱标准工作液与样品待测液采用超高效液相色谱-串联质谱仪进行质谱和色谱测试，对比得到蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的含量。

本实施例中的质谱条件为：MS条件离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式扫描；离子源温度：150℃；喷雾电压2.0KV；质谱扫描方式：多重反应监测模式(MRM)；加热气温度：500℃；脱溶剂气：1000L/H；苦参碱的定量离子对为249.2＞148.2，定性离子对为249.2＞110.2，氧化苦参碱的定量离子对为265.2＞205.2，定性离子对为265.2＞148.2。

色谱条件为：LC色谱柱：InspireHILIC色谱柱(150mm×2.1mm×3μm)；流动相：A相为0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵溶液，B相为乙腈；柱温：35℃；进样量：5.0μL；梯度洗脱程序：0～2.0min，10％A；2.0～3.0min，10％～ 80％A；3.0～6.0min，80％A；6.0～6.5min，80％～10％A；6.5～10.0min， 10％A。

实施例2

一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法，包括以下步骤：

标准使用溶液配制：准确称取定量苦参碱和氧化苦参碱标准品用甲醇溶解，分别配制成100.0μg/mL标准溶液储备溶液，再准确量取定量的100.0 μg/mL标准溶液，用甲醇稀释成5.0μg/mL的中间液，再将5.0μg/mL的中间液稀释成1.0μg/mL的混合标准使用溶液，放置于冰箱内4℃冷藏保存；

纯溶剂标准溶液配制：分别移取一定体积的1.0μg/mL的混合标准使用溶液，用92％的乙腈-水溶液(含0.1％甲酸)定容，配制成浓度分别为 1.0、5.0、10、20、50、80、100ng/mL的标准工作液。

蜂蜜搅拌均匀，取试样1.0g(精确至0.01g)于15mL离心管中，加入 4mL超纯水涡旋振荡使蜂蜜充分溶解，加入8.0mL0.1％氨水乙腈，加入无水硫酸钠2.0g，涡旋振荡5min，使0.1％氨水乙腈与样品溶液充分萃取， 15000r/min离心8min，准确吸取3.0mL上清液氮吹至近干，然后采用乙腈- 水溶液溶解获得样品待测液；

本实施例中的质谱条件为：MS条件离子源：电喷雾离子源(ESI)，正离子模式扫描；离子源温度：160℃；喷雾电压2.2KV；质谱扫描方式：多重反应监测模式(MRM)；加热气温度：550℃；脱溶剂气：800L/H；苦参碱的定量离子对为249.2＞148.2，定性离子对为249.2＞110.2，氧化苦参碱的定量离子对为265.2＞205.2，定性离子对为265.2＞148.2。

色谱条件为：LC色谱柱：InspireHILIC色谱柱(150mm×2.1mm×3μm)；流动相：A相为0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵溶液，B相为乙腈；柱温：32 ℃；进样量：5.5μL；梯度洗脱程序：0～2.0min，10％A；2.0～3.0min，10％～ 80％A；3.0～6.0min，80％A；6.0～6.5min，80％～10％A；6.5～10.0min， 10％A。

实验例

1、仪器条件的优化

1.1、质谱条件的优化

由于苦参碱和氧化苦参碱具有内酰胺结构，在正喷雾电离模式下很容易获得稳定的准分子离子[M+H]⁺，采用1000ng/mL的混合标准溶液在流动相存在条件下注入电喷雾离子源进行质谱参数优化，采用全扫模式下，采用质谱(MS)和质谱(MS)/质谱(MS)扫描相结合，结果显示，正离子模式 (ESI⁺)下，合成了准分子离子[M+H]⁺，苦参碱和氧化苦参碱的响应灵敏度高，通过改变碰撞能量，观察到信号较强的子离子，最后采用MRM模式，对确定的子离子的碰撞能进行优化，以获得最佳的质谱参数。

1.2、色谱柱选择

苦参碱和氧化苦参碱属于极性相对较高的化合物，很难在传统的C₁₈柱中获得满意的保留效果，实验结果显示C₁₈柱中，需要较高比例的水相才能获得一定的保留，然而较高比例的水相不利于样品杂质组分的分离和洗脱，同时高比例水相不利于目标物蒸发电离，导致目标物的ESI-MS灵敏度下降。HILIC色谱柱采用极性较强的固定相，提高了极性化合物的保留，采用HILIC色谱柱测定苦参碱和氧化苦参碱，获得了满意的保留效果，且目标物峰型较好，因此选择HILIC柱为分离色谱柱。

1.3、色谱条件的优化

在HILIC色谱柱系统，通常采用乙腈/水体系为流动相，本文中的目标物采用正离子模式，适当加入甲酸有利于其离子化，形成[M+H]⁺，提高分析的灵敏度，试验中考察了乙腈-0.1％甲酸，乙腈-0.1％甲酸/5mmol/L乙酸铵缓冲液，结果显示在0.1％甲酸中，目标物峰严重拖尾，且响应信号低。在0.1％甲酸中加入5mmol/L的乙酸铵，峰型也得到明显改善，且响应信号增强。可能由于生物碱测定中碱基与色谱柱中阴离子硅醇官能团相互作用导致的峰尾效应，加入缓冲盐降低其相互作用，明显改善目标化合物的峰型。所以采用0.1％甲酸-5mmol/L乙酸铵缓冲液和乙腈进行梯度洗脱程序，并在10min内完成单个样品的分析测试，采用优化好的色谱条件，样品基质对目标物检测干扰小，峰型良好，标准品、阳性样品及阴性样品的MRM 图谱见图1。

图1为标准溶液与不同样品的MRM色谱图，图中a为标准品，b为阳性样品，c为阴性样品。从图1中可以看出，目标物峰型良好，样品基质对目标物检测干扰小，表明该仪器条件设定合理。

2、提取条件的优化

2.1、提取溶剂和盐析剂的优化

液液萃取中，常用的萃取溶剂有正己烷、乙酸乙酯和乙腈等，正己烷和乙酸乙酯的极性较弱，对极性化合物的提取效果较差，乙腈对极性或非极性化合物的提取率较高，乙腈虽能与水互溶，但在水相的体系中加入适量盐就能促使乙腈与水分离，使得目标物被富集于乙腈层中。根据苦参碱和氧化苦参碱易溶于极性溶剂的性质，本文选用乙腈体系作为萃取溶剂。

试验中1g蜂蜜采用3mL水溶解，采用加标回收形式考察不同溶剂及盐析剂的萃取效率，以回收率表示。考察的溶剂包括乙腈、1％甲酸乙腈，0.1％氨水乙腈，同时，对盐析剂的种类进行考察，蜂蜜中含果糖和葡萄糖，在一定浓度下，本身也能促使乙腈和水分离，因此，蜂蜜水-乙腈体系，在不加盐的情况下也能产生相分离。本研究考察了不加盐、加入NaCl、Na₂SO₄、 MgSO₄、QuEChERS试剂(4g无水MgSO₄、1g NaCl、0.5g柠檬酸氢二钠和1g柠檬酸钠)1.5g，考察对回收率影响，结果如图2所示，从图2中可以看出，直接采用乙腈萃取，苦参碱和氧化苦参碱的回收率都不高，除加入QuEChERS盐析剂后目标物的回收率分别为56％和54％外，其他几种盐析剂的回收率未超过50％。当采用酸性乙腈提取时，加入MgSO₄的回收率最高，其中苦参碱的回收率为78％，氧化苦参碱的回收率为76％。当采用碱性乙腈提取时，苦参碱的回收率明显升高，不加盐和不同盐析剂下的回收率均超过80％，其中Na₂SO4的回收率最高达99％，盐析剂种类对苦参碱的影响较小，但对氧化苦参碱的影响较大，不加盐情况下氧化苦参碱回收率不足40％，加入NaCl，回收率降低，可能NaCl抑制氧化苦参碱从水相中转移至乙腈中，其他几种盐的回收率依次为Na₂SO₄＞MgSO₄＞ QuEChERS，Na₂SO₄的回收率达到83％。苦参碱和氧化苦参碱为碱性化合物，萃取溶剂中加入碱能促使目标物化合物以分子形式存在，增加其在乙腈中的溶解度，从而提高回收率。试验中改变氨水浓度，比较了0.1％、0.2％、 0.5％、1.0％和2.0％氨水乙腈对目标物提取效果的影响，结果发现氨水浓度为对回收率无显著的影响，综合考虑，以0.1％氨水乙腈作为萃取溶剂，并采用Na₂SO₄作为盐析剂。

2.2、蜂蜜样品与加水量的优化

蜂蜜的含糖量一般在60％～80％之间，粘稠度较大。如直接用有机试剂提取，提取样品易形成胶质状，目标物可能会被蜂蜜中糖分吸附，进而导致提取效果较差，故本研究先用适量的水溶解蜂蜜，使其成为均相体系。为保证实验参数一致，增加水量同时增加溶剂用量，萃取溶剂与加水体积溶剂的比为2：1，按照蜂蜜的质量(g)与加水的体积(mL)比(m:V)计算，结果见图3，从图3中结果表明加水稀释体积影响目标物的提取，其中对氧化苦参碱的影响大于苦参碱，当m：V未达到1：3时，样品中氧化苦参碱的回收率较低，继续加大水体积是二者回收率均降低。可能由于当加水量过多，目标物应在水中溶解增加难以萃取完全。因此，本申请采用 1g蜂蜜加3mL溶解。

2.3、萃取溶剂用量的优化

采用蜂蜜:水的质量体积比为1:3条件下加入不同量的萃取溶剂，萃取溶剂的用量依次为4mL、5mL、6mL、8mL，回收率见图4，随萃取溶剂用量提高，回收率增加，当萃取溶剂用量达到6mL，回收率无明显增加，且继续溶剂用量会增加糖在萃取剂乙腈中溶解，故采用6mL0.1％氨水乙腈萃取。

2.4、盐析剂用量的优化

采用蜂蜜：水(1:3)的比例，加入6mL萃取溶剂，加入盐析剂Na₂SO₄质量分别为0.5g，1.0g，1.5g，2.0g，2.5g，3.0g，结果见图5，从图5中可以看出当随Na₂SO₄用量增加，回收率提高，当Na₂SO₄加入量超过1.5g时，二者回收率无明显增加，故盐析剂用量采用1.5g。

3、基质效应

依据基质效应(ME)＝(基质匹配标准曲线斜率/溶剂标准曲线的斜率)×100来评估样品检测中的基质效应，低于100％表明存在基质抑制，高于100％存在基质增强，基质效应在80％～120％之间，通常认定基质效应对定量检测的影响可被接受。在已优化的条件下，基质效应结果见表2。

表2蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的基质效应

从表2中可以看出，苦参碱的基质效应为91.5％，氧化苦参碱的基质效应为89.9％，均存在一定的基质抑制，但处于可被接受的范围内，常规检测可采用溶剂配制标准工作曲线进行定量分析。同时，试验发现流动相的组成和比例对基质效应有影响，适当提高溶剂极性，如适当提高流动相中水相比例能一定程度降低基质干扰，试验中可考虑优化流动相比例降低基质效应的影响。这可能由于样品中某些极性化合物与目标物出峰时间相近，干扰目标物电离，适当提高水相比例，有助于杂质与目标物的分离，降低了其对样品分析的干扰。

4、方法的线性关系、检出限、定量限、回收率和精密度

4.1、方法的线性关系、检出限、定量限

按照优化好的条件将标准溶液进行测定，以质量浓度(X，ng/mL)为横坐标，以峰面积(Y)为纵坐标绘制各化合物的标准曲线。以3倍信噪比(S/N＝3)计算得到该方法检测限；以10倍信噪比(S/N＝10)计算得到该方法的定量限，如表3所示。

表3标准曲线方程、相关系数、检出限和定量限

化合物	溶剂标准曲线方程	相关系数(r²)	检出限(μg/kg)	定量限(μg/kg)
					苦参碱	Y＝1964.49X+551.338	0.9995	0.1	0.3
氧化苦参碱	Y＝3472.83X-472.323	0.9996	0.1	0.3

由表3可知，苦参碱和氧化苦参碱的线性关系良好，相关系数r均达到0.999以上，符合定量要求，定量限为0.3μg/kg。

4.2、方法的回收率和精密度

在阴性蜂蜜样品中按1.0、10、100ug/kg的加标水平加入混合标准溶液，按照本申请实施例方法每个添加水平重复做6个平行实验，计算平均回收率和相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)，其结果见表4。

表4阴性蜂蜜样品的加标回收率和相对标准偏差(n＝6)

从表4中可知苦参碱的加标回收率在90.9％～95.1％，相对标准偏差为 2.98％～6.78％，氧化苦参碱的回收率在80.9～84.3，相对标准偏差为 4.45％～5.06％，可见3个加标水平6次平行的回收率和RSD均符合 GB/T27404-2008附录F的要求，该方法的准确性和重复性良好。

5、实际样品测定

采用本申请实施例1所建立的定性和定量分析方法对收集到的45批次蜂蜜进行测定，其结果见表5。

表5不同的蜂蜜样品苦参碱和氧化苦参碱的含量分布

从表5中可以看出，同一样品中一般苦参碱和氧化苦参碱同时检出，土蜂蜜和百花蜂蜜虽有检出，但含量较低，其中洋槐蜜11份，检出8份，检出率为72.7％，且检出样品的含量相对较高，苦参碱含量最高达 58.40μg/kg，氧化苦参碱的含量最高达93.17μg/kg，考虑内源性成分可能性大，可能由于狼牙刺、砂生槐类植物中含苦参碱和氧化苦参碱，洋槐和这两类植物同属豆科植物，花期和地理分布相近，洋槐蜜源容易遭受狼牙刺、砂生槐蜜源的影响，导致洋槐蜜中检出苦参碱和氧化苦参碱。

以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

Claims

1.一种蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

称取苦参碱和氧化苦参碱标准品，采用甲醇配制成浓度为1.0μg/mL的标准使用溶液；将标准使用溶液采用乙腈-水溶液配制成浓度为1.0、5.0、10、20、50、80、100ng/mL的标准工作液；

往蜂蜜样品中加水溶解，然后加入氨水乙腈和无水硫酸钠混合，离心后取上清液进行氮吹，然后采用乙腈-水溶液溶解得到样品待测液；所述蜂蜜样品与水的比例为1g：3～4mL；所述蜂蜜样品与所述氨水乙腈的比例为1g：5～8mL，所述氨水乙腈的体积比为0.1～0.15%；所述蜂蜜样品与所述无水硫酸钠的质量比为1：1.5～3.0；

将标准工作液与样品待测液采用超高效液相色谱-串联质谱仪进行质谱和色谱测试，对比得到蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的含量；

所述质谱测试的条件为：采用电喷雾离子源，正离子模式扫描，离子源温度为130～160℃，喷雾电压为1.8～2.2KV，多重反应监测模式，加热气温度为450～550℃，脱溶剂气流量为800～1200L/H；质谱测试时的苦参碱的定量离子对为249.2＞148.2，定性离子对为249.2＞110.2，氧化苦参碱的定量离子对为265.2＞205.2，定性离子对为265.2＞148.2；

所述色谱测试的条件为：采用Inspire HILIC色谱柱，流动A相为0.1%甲酸-5mmol/L乙酸铵溶液，流动B相为乙腈；柱温为32～38℃，进样量为4.0～6.0μL；色谱测试的梯度洗脱程序为：0～2.0min，10%A；2.0～3.0 min，10%～80%A；3.0～6.0 min，80%A；6.0～6.5 min，80%～10%A；6.5～10.0min，10%A。

2.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法，其特征在于，所述标准使用溶液的配制过程为：称取苦参碱和氧化苦参碱标准品，先采用甲醇配制成100～1000.0μg/mL标准溶液储备溶液，然后用甲醇将标准溶液储备溶液稀释成5.0～50.0μg/mL的中间液，最后用甲醇将中间液稀释成1.0μg/mL的标准使用溶液。

3.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法，其特征在于，所述乙腈-水溶液中乙腈的含量为85～92%，所述乙腈-水溶液中含有0.1～0.2%质量的甲酸。

4.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法，其特征在于，所述加水溶解和混合均采用涡旋振荡，振荡时间为3～8min。

5.根据权利要求1所述的一种蜂蜜中苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法，其特征在于，所述离心速率为10000～15000r/min，离心时间为3～8min。