CN112162054A - 一种沙生槐蜂蜜的真实性评价方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于涉及食品检测领域，具体涉及一种沙生槐蜂蜜的真实性评价方法，以氧化苦参碱为特征化合物，当其在蜂蜜中的含量介于4‑17mg/kg时，可将其判定为沙生槐蜂蜜；当其在蜂蜜中的含量低于4mg/kg时，则判定为其它蜂蜜或者掺假沙生槐蜂蜜。本发明中提供的方法具有简单、高效等优点，便于操作和推广，对优质沙生槐蜂蜜的相关行业或国家标准的制定具有一定的指导意义，同时对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业的健康发展具有重要的现实意义。

Description

一种沙生槐蜂蜜的真实性评价方法
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体涉及一种沙生槐蜂蜜的真实性评价方法。
背景技术
蜜源植物是蜜蜂获得食物营养和生产蜂蜜的基础。目前，已知的蜜源植物种类高达几千种，其中泌蜜丰富，能够供蜜蜂大量生产的蜜源植物，通常称之为主要蜜源植物。当前，我国主要蜜源植物的种类非常有限，仅有40余种，如洋槐、椴树、荆条、枣花、荔枝、龙眼、向日葵、乌桕、鸭脚木、五倍子等。通常情况下，大部分蜜源植物的泌蜜有限，仅能基本维持蜂群生存繁衍，生产少量百花蜜，这些蜜源植物称之为辅助蜜源植物，其种类高达几千种。值得注意的是，部分具有药用价值的植物也能够大量的分泌花蜜，通常将其称之为药用蜜源植物。部分药用蜜源植物的花蜜或分泌物中含有具有药理活性的化合物，这些化合物通过蜜蜂采集的行为，迁移并富集在蜂蜜中，形成药用蜂蜜。风靡全球的新西兰麦卢卡蜂蜜便是药用蜂蜜的一种，因其蜂蜜含有丰富的甲基乙二醛等抗菌活性物质，使其具有更佳的营养保健等药用功效。我国药用单花蜜的研究尚处于起步阶段，相关研究较为匮乏，缺乏系统性研究，这严重制约了相关药用单花蜜的溢价空间和品牌价值。开展药用单花蜜的系统性研究，明确其化学组成及营养功能，已经成为广大蜂产品行业从业者的共识。
沙生槐是我国藏区主要的蜜源植物之一，而且是中草药特色蜜源植物。沙生槐单花蜜具有独特化学组成和功能活性，使其具有重大产业开发价值。众多试验结果表明沙生槐单花蜂蜜具有良好的抗菌、抗炎、抗肿瘤等功效，其效果甚至优于麦卢卡蜂蜜，但是有关沙生槐单花蜜中物质作用基础尚不清楚。
虽然在植物研究领域已经有一些对沙生槐中化学成分的研究，但是蜂蜜的形成是一个较为复杂的过程，难以判断在此过程中，哪些化合物可以过蜜蜂采集的行为，迁移并富集在蜂蜜中；也难以判断在该过程中，化学成分的结构会不会发生变化。此外，一些化学物质虽然能够迁移并富集到蜂蜜中，但是其在其他蜂蜜中的含量与在沙生槐单花蜜中的含量难以形成实质差别，或者在不同来源的沙生槐蜂蜜中的含量不稳定。基于上述情况，即使已经存在部分对蜜源植物本身的研究，仍然难以明确沙生槐蜂蜜的指示性物质。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了氧化苦参碱作为沙生槐蜂蜜指示性物质的应用，具体以沙生槐蜂蜜中的特征性内源性物质氧化苦参碱作为其指示性物质，用来评价沙生槐蜂蜜的真实性。
本发明首先通过液相色谱串联高分辨质谱的正负模式对大量的沙生槐蜂蜜以及其它常见的蜂蜜进样分析。最终发现了沙生槐蜂蜜在正模式下的总离子流色谱图中存在一个含量较高的化合物，与其他常见蜂蜜形成了较大的区别，该化合物的色谱保留时间为3.33min(图2中B图)，精确质量数为m/z 265.19021(图3中A图)，其MS/MS图谱中含有碎片离子m/z 134.09643、m/z 148.11208、m/z176.10712、m/z205.13324、m/z 220.19360和m/z247.17998(图3中B图)。基于高分辨质谱获得数据，通过检索m/z cloud数据库，对比其精确质量数的母离子和子离子，初步明确了该化合物为氧化苦参碱。此外，从市场上购买了氧化苦参碱的标准品，通过进样分析，对比其保留时间、精确质量数的母离子和碎片离子等信息，再次确认了该化合物便是氧化苦参碱。
基于获得的对照品，采用LC-MS初步建立了蜂蜜中氧化苦参碱的准确定量分析方法。另外，本发明从沙生槐蜂蜜的主产区(西藏山南市)共采集了20份蜂蜜样本，样本经前处理之后，由开发的LC-MS方法进样分析，结果发现沙生槐蜂蜜中氧化苦参碱的含量较为稳定为4-17mg/kg(图4)。而其它品种的蜂蜜中，该物质的含量很低，甚至检测不到。因此，可以将氧化苦参碱作为沙生槐蜂蜜的特征性物质，用于沙生槐蜂蜜的真实性鉴别及纯度评价。
本发明进一步提出一种沙生槐蜂蜜的真实性评价方法，以氧化苦参碱为特征化合物，若蜂蜜样本中氧化苦参碱的含量介于4-17mg/kg时，则判断所述蜂蜜样本为沙生槐蜂蜜；若氧化苦参碱的含量低于4mg/kg，则判定所述蜂蜜样本为其它蜂蜜或者掺假沙生槐蜂蜜。
作为优选，通过加入氧化苦参碱的空白蜂蜜(如洋槐蜂蜜，该蜂蜜中不含有此物质)确认氧化苦参碱的含量与峰面积间的线性关系，根据蜂蜜样本中氧化苦参碱的峰面积推算其含量。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap(超高液相色谱-高分辨质谱)和/或LC-MS/MS检测蜂蜜样本。
作为优选，氧化苦参碱在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z265.19105([M+H]+)准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5ppm；优选氧化苦参碱色谱峰的保留时间为3.33min，保留时间允许的偏差应小于0.2min。
此外，为了提高沙生槐蜂蜜的鉴别能力，氧化苦参碱的精确质量数和保留时间除了满足上述条件之外，该物质的MS/MS图谱(子离子图谱)中应该含有其主要的碎片离子，本发明进一步发现了其特征碎片离子：m/z 134.09643、m/z 148.11208、m/z176.10712、m/z205.13324、m/z 220.19360和m/z 247.17998(图3中B图)，其精确质量数的误差应当小于10ppm。基于上述MS/MS图谱中提供的主要碎片离子，即便是在无氧化苦参碱对照品的情况，依然可以通过判定蜂蜜样本中含有沙生槐蜂蜜，并可积分母离子峰面积用于沙生槐蜂蜜含量的计算。
为了能使目标色谱峰得到明显分离，本发明对液相条件进行了优化。作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，液相条件如下：
采用C18色谱柱，以0.1％的甲酸水为流动相A，0.1％的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0min，5％的流动相B；2.0-7.0min，5-30％的流动相B；7.0-14.0min，30-95％的流动相B；14-18min，95％的流动相B；18.0-18.1min，95-5％的流动相B；18.1-20.0min，5％的流动相B。
优选液相的流速为0.30mL/min。
优选进样量为5.0μL。
为了能够使目标离子响应值更高，作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速45arb；辅助气的流速10arb；挡锥气的流速0arb；电喷雾电压3.5kV；离子导管的温度320℃；S-lens RF level设为60V；离子源的温度350℃；
优选采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2，其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100ms；Scan range：80-1200Da；Spectrum data：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.0e5；Maximum IT：50ms；Loop count：2；Isolation window：2.0Da；Scan range：200-2000Da；NCE：35eV；Spectrum data：Centroid；dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apextrigger：2-6s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0s。
采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，由于检测仪器的不同，LC-MS/MS的液相和质谱设置条件与UHPLC-Q-Orbitrap差异较大。
优选液相条件如下：采用C18色谱柱(优选采用较短的C18色谱柱)，柱温为25℃，以0.1％的甲酸水为流动相A，0.1％的甲酸乙腈为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0-0.8min，5％的流动相B；0.8-1.2min，5-40％的流动相B；1.2-2.5min，40-90％的流动相B；2.5-3.5min，90％的流动相B；3.5-3.6min，90-5％的流动相B；3.6-6.0min，5％的流动相B。
优选液相的流速为0.30mL/min。
优选进样量为3.0μL。
作为优选，为了准确定量蜂蜜中的氧化苦参碱，采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，采集的模式为正离子模式下的多反应监测(MRM)，MRM关键参数的设置如下：氧化苦参碱的Fragementor 130V，265.2>247.2，32eV(定量离子)；265.2>205.1，38eV(定性离子)。
质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子喷雾电压：3500V；雾化气压力：45psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：5L/min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11L/min。
其中，氧化苦参碱的详细MRM参数设置参见表1。
表1 LC-MS/MS在定量分析检测蜂蜜中氧化苦参碱的MRM关键参数设置
Figure BDA0002659157610000051
为验证建立的LC-MS/MS方法科学合理性，本发明考察了该方法的准确度和精密度，变异系数均小于10％，完全符合残留检测分析的要求。
作为优选，在检测前，还包括利用甲醇水对所述蜂蜜样本进行提取的步骤；
在所述甲醇水中，优选甲醇与水的体积比为2：(7～9)，优选为2：8。
作为优选，对蜂蜜样本进行检测前，将蜂蜜按1：(9～11)的质量体积比充分溶于甲醇水中，进行提取；更优选为1：10。
作为优选，所述提取具体包括如下步骤：按0.8g蜂蜜样品，7.2mL甲醇水的比例将其混合，并使蜂蜜充分化开后，20194g，4℃离心20min，再取100μL提取液：900μL甲醇水的比例稀释一次。
本发明涉及到的试剂和标准品在市场上均可获得，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到本发明的较佳实施例。
本发明的有益效果在于：
本发明首次发现了沙生槐蜂蜜中一种高含量物质为氧化苦参碱，并提出了高含量氧化苦参碱可作为沙生槐蜂蜜真实性和纯度评价的指示性物质，以及采用液相串联质谱(UHPLC-Q-Orbitrap或LC-MS/MS)检测蜂蜜中氧化苦参碱的方法。
此外，为了准确定量沙生槐蜂蜜中氧化苦参碱含量，本发明还对该物质的检测方法和关键的检测参数进行了优化。基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度，检出限可以达到2μg/kg。
同时，本发明中的方法还具有简单、高效等优点，便于操作和推广，对优质沙生槐蜂蜜的相关行业或国家标准的制定具有一定的指导意义，同时对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业的健康发展具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本发明实施例1提供沙生槐蜂蜜中指示性物质氧化苦参碱的化学结构。
图2为本发明实施例1提供的沙生槐蜂蜜在UHPLC-Q-Orbitrap正离子模式下的总离子流色谱图(A)和氧化苦参碱的精确提取离子流色谱图(B)，其中提取的质量窗口为5mDa.。
图3为本发明实施例1提供的氧化苦参碱在UHPLC-Q-Orbitrap正离子模式下全扫描质谱图(A)、精确质量数的子离子质谱图(B)。
图4为本发明实施例2提供的LC-MS/MS的MRM模式检测22种主要的不同品种蜂蜜中氧化苦参碱的含量。
图5为本发明实施例3提供的20种商品化沙生槐蜂蜜中的氧化苦参碱含量情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
仪器与试剂
1.质谱仪(Q-Exactive Plus)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
2.1200series液相色谱-6460三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司；
3.台式低温离心机(1-15Pk)，德国Sigma公司；
4.电子分析天平(PL203)，德国METTLERTOLEDO公司；
5.超纯水机(Milli-Q Gradient)，美国Millipore公司；
6.涡动仪(G560E)，美国Scientific Industries公司；
甲酸(FA)从上海安谱实验科技股份有限(CNW)公司购买；乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)购买于Fisher公司。
实施例1
本实施例首先通过液相色谱串联高分辨质谱的正负模式对大量的沙生槐蜂蜜以及其它常见的蜂蜜进样分析。实验结果表明沙生槐蜂蜜在正模式下的总离子流色谱图中存在一个含量较高的化合物，如图2所示，其中的A图为沙生槐蜂花粉总离子流色谱图，B图为发现的含量较高的化合物的精确提取离子流色谱，其色谱保留时间为3.33min。
基于高分辨质谱提供的精确质量数m/z 265.19105(如图3中A图)，本实施例获得该物质的元素组成为C15H25N2O+。在该物质的MS/MS图谱中；该物质峰的主要碎片含有m/z134.09643、m/z148.11208、m/z176.10712、m/z 205.13324、m/z 220.19360和m/z247.17998(如图3中B图)。随后，本实施例采用Compound Discoverer2.0软件对该物质进行多重化学物质数据库进行检索，如m/z Cloud、Chem Bank等。实验结果表明数据库中检索到该化合物为氧化苦参碱(如图1)。
此外，为保证氧化苦参碱鉴定结果的有效性，通过与购买的氧化苦参碱标准品进行了对比，发现两者具有相同的保留时间、母离子(MS)和碎片离子(MS/MS)。该结果再次验证了该物质为氧化苦参碱。
同时，通过对不同地区采集的沙生槐蜂蜜进行分析，发现氧化苦参碱在不同来源的沙生槐蜂蜜中含量相对稳定。而且，通过对不同年份采集的沙生槐蜂蜜进样分析，发现沙生槐蜂蜜中氧化苦参碱的化学性质非常稳定，即便是常温放置2年的蜂蜜样本，氧化苦参碱未见显著降解。因此，氧化苦参碱可以作为指示性物质用于评价沙生槐蜂蜜的真实性与纯度。
除了洋槐苦参碱之外，在探究指示性物质的过程中还发现了较多在沙生槐中含有或特有的其他化学物质。比如，在沙生槐蜂蜜中还检测到了痕量的苦参碱和槐果碱这两种生物碱，其精确质量数的母离子分别为m/z 249.19614和m/z 247.18049；保留时间分别为2.18min和2.49min。而且，通过与购买的标准品对比，再次确认了苦参碱和槐果碱鉴定结果的准确定。但是，值得注意的是：苦参碱和槐果碱在沙生槐蜂蜜中的含量很低，其最高浓度也不及氧化苦参碱的1/100；而且，两种生物碱在不同地区采集的沙生槐蜂蜜中的浓度差异较大，高低浓度的样本差异通常高达几十倍。因此，苦参碱和槐果碱难以作为潜在的指示性物质用于评价沙生槐蜂蜜的真实性与纯度。
实施例2
1.样品来源
从市场或者蜂农处购买常见的真实蜂蜜样本用于检测各种蜂蜜中氧化苦参碱的含量，具体的包括：洋槐、枣花、沙生槐、油菜、荔枝、龙眼、荆条、桉树、雪脂莲、向日葵、乌桕、石榴、野桂花、野坝子、柠条、麦卢卡、老瓜头、枸杞、党参、五倍子、柑橘蜂蜜、鸭脚木各四个样品，且四个样品的来源不同(产地不同和/或加工程度不同)。
2.溶液配制
提取溶液：移取甲醇20mL，超纯水定容到100mL。4℃保存。
氧化苦参碱标准溶液：称取10mg的氧化苦参碱标准品，甲醇定容至10mL。4℃保存，有效期2个月。
3.Q Exactive plus测试条件如下
(1)样品处理
称取0.8g蜂蜜加入7.2mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194g，4℃下离心20min。收集上清液过0.22μm滤膜，再取100μL提取液：900μL甲醇水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。
(2)质控样本：
称取0.8g空白蜂蜜(不含氧化苦参碱)加入7.2mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194g，4℃下离心20min。收集上清液过0.22μm滤膜转移至进样品中，再吸取100μL提取液，800μL甲醇水和100μL浓度为100mg/kg的氧化苦参碱标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
(3)UHPLC-Q Exactive plus仪器设置
色谱条件为：分析柱为C18色谱柱。以0.1％的甲酸水为流动相A，0.1％的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0min，5％的流动相B；2.0-7.0min，5-30％的流动相B；7.0-14min，30-95％的B；14-18min，95％的流动相B；18.0-18.1min，95-5％的流动相B；18.1-20.0min，5％的流动相B；流速：0.30mL/min；进样量：5.0μL。
离子源参数：鞘气的流速45arb；辅助气的流速10arb；挡锥气的流速0arb；电喷雾电压3.5kV；离子导管的温度320℃；S-lens RF level设为60V；离子源的温度350℃。
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2，其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100ms；Scan range：80-1200Da；Spectrumdata：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.0e5；Maximum IT：50ms；Loop count：2；Isolation window：2.0Da；Scan range：200-2000Da；NCE：35eV；Spectrum data：Centroid；dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger：2-6s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0s。
质谱生成的数据通过Xcalibur软件收集并存储，将质谱采集的raw数据通过Xcalibur的Qualitative browser分析，比较样品与空白加标样品中氧化苦参碱的Full MS及MS/MS图谱，确定样品中含有氧化苦参碱。
(4)标准曲线的绘制：
在空白蜂蜜样品提取后过滤膜的稀释溶液中制备一系列氧化苦参碱溶液(1，2，5，10，20，50μg/kg)。并指定5μg/kg的空白添加为质控样本。数据通过Trace Finder软件处理，定量蜂蜜样品中氧化苦参碱的含量。得到标准曲线公式为Y＝1.4272e4X-0.46e4，R2＝0.996(X为浓度Y定量离子响应积分值)
通过Trace Finder软件即可分析蜂蜜样品中的氧化苦参碱含量。通过浓度稀释计算，得到蜂蜜中氧化苦参碱的含量，见图4。当样品中氧化苦参碱的含量介于4-17mg/kg时，可以被认为样品蜂蜜的蜜源为沙生槐，该样品为沙生槐蜂蜜。
实施例3
1.样品来源
从市场购买标签为沙生槐蜂蜜的多种品级或品牌的蜂蜜样本共20份。
2.实验步骤
(1)溶液配制
提取溶液：移取甲醇20mL，超纯水定容到100mL。4℃保存。
氧化苦参碱标准溶液：称取10mg的氧化苦参碱标准品，甲醇定容至10mL，4℃保存，有效期2个月。
(2)样品处理
称取0.8g蜂蜜加入7.2mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194g，4℃下离心20min。收集上清液过0.22μm滤膜，再取100μL提取液：900μL甲醇水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。
(3)质控样品
称取0.8g空白蜂蜜(不含氧化苦参碱)加入7.2mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194g，4℃下离心20min。收集上清液过0.22μm滤膜转移至进样品中，再吸取100μL提取液，800μL甲醇水和100μL浓度为5mg/kg的氧化苦参碱标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
3.Agilent1200液相色谱-6460三重四级杆质谱分析条件如下
液相条件中采用较短的C18色谱柱分离，是以0.1％的甲酸水为流动相A，0.1％的甲酸乙腈为B，采用较短的梯度洗脱程序分离：0-0.8min，5％的流动相B；0.8-1.2min，5-40％的流动相B；1.2-2.5min，40-90％的流动相B；2.5-3.5min，90％的流动相B；3.5-3.6min，90-5％的流动相B；3.6-6.0min，5％的流动相B。液相的流速为0.30mL/min。进样量为3.0μL。
LC-MS/MS的质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测(MRM)；离子喷雾电压：3500V；雾化气压力：45psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：5L/min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11L/min。
采集的模式为正离子模式下的MRM模式。MRM参数：Fragementor：130V，265.2>247.2，32eV(定量离子)；265.2>205.1，38eV(定性离子)。
4.标准曲线的绘制
在空白蜂蜜样品提取后过滤膜的稀释溶液中制备一系列氧化苦参碱溶液(1，2，5，10，20，50μg/kg)。并指定5μg/kg的空白添加为质控样本。
通过Agilent的Mass Hunter定量软件分析样品及空白加标样品。外标法定量，得到标准曲线公式为Y＝1.4752e4X-0.61e4，R2＝0.997(X为浓度Y定量离子响应积分值)。
通过定量软件即可分析蜂蜜样品中的氧化苦参碱含量。结果如图5所示，其中30％的样品中氧化苦参碱的含量小于4mg/kg。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种沙生槐蜂蜜的真实性评价方法，其特征在于，以氧化苦参碱为指示性物质，若蜂蜜样本中氧化苦参碱的含量介于4-17mg/kg时，则判断所述蜂蜜样本为沙生槐蜂蜜；若氧化苦参碱的含量低于4mg/kg，则判定所述蜂蜜样本为其它蜂蜜或者掺假沙生槐蜂蜜。
2.根据权利要求1所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap和/或LC-MS/MS检测蜂蜜样本。
3.根据权利要求2所述的真实性评价方法，其特征在于，氧化苦参碱在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z265.19105准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5ppm；氧化苦参碱色谱峰的保留时间为3.33min，保留时间偏差小于0.2min。
4.根据权利要求2所述的真实性评价方法，其特征在于，氧化苦参碱在MS/MS图谱中应含有m/z 134.09643、m/z 148.11208、m/z176.10712、m/z 205.13324、m/z 220.19360和m/z247.17998中的一个或多个碎片离子峰，其精确质量数的误差应当小于10ppm。
5.根据权利要求3所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，液相色谱条件如下：采用C18色谱柱，以0.1％的甲酸水为流动相A，0.1％的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0min，5％的流动相B；2.0-7.0min，5-30％的流动相B；7.0-14.0min，30-95％的流动相B；14-18min，95％的流动相B；18.0-18.1min，95-5％的流动相B；18.1-20.0min，5％的流动相B。
6.根据权利要求3或5所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，质谱条件如下：离子源参数：鞘气的流速45arb；辅助气的流速10arb；挡锥气的流速0arb；电喷雾电压3.5kV；离子导管的温度320℃；S-lens RF level设为60V；离子源的温度350℃；采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2，碰撞能量为35eV。
7.根据权利要求4所述的真实性评价方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，液相条件如下：采用C18色谱柱，柱温为25℃，以0.1％的甲酸水为流动相A，0.1％的甲酸乙腈为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0-0.8min，5％的流动相B；0.8-1.2min，5-40％的流动相B；1.2-2.5min，40-90％的流动相B；2.5-3.5min，90％的流动相B；3.5-3.6min，90-5％的流动相B；3.6-6.0min，5％的流动相B。
8.根据权利要求4或7所述的真实性评价方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，质谱条件如下：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；离子喷雾电压：3500V；雾化气压力：45psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：5L/min；鞘气温度：250℃；鞘气流速：11L/min；采集的模式为正离子模式下的MRM模式，MRM参数如下：Fragementor 130V，265.2>247.2，32eV；265.2>205.1，38eV。
9.根据权利要求2所述的真实性评价方法，其特征在于，在检测前，还包括利用甲醇水对所述蜂蜜样本进行提取的步骤；所述蜂蜜样本与甲醇水的质量体积比1：(9～11)，在所述甲醇水中，甲醇与水的体积比为2：(7～9)。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112697931A (zh) * 2021-03-24 2021-04-23 中国农业科学院蜜蜂研究所 三叶豆苷作为胡枝子蜜特征性标志物的应用
CN114324629A (zh) * 2021-12-01 2022-04-12 安徽蜜之源食品集团有限公司 一种蜂蜜中总苦参碱残留量的检测方法
CN114924015A (zh) * 2022-06-16 2022-08-19 中南大学 一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法
CN116930378A (zh) * 2023-07-25 2023-10-24 江苏蜂奥生物科技有限公司 一种野桂花蜂蜜的检测鉴别方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766143A (zh) * 2012-07-30 2012-11-07 安徽省科学技术研究院 一种从砂生槐种子中提取氧化苦参碱的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102766143A (zh) * 2012-07-30 2012-11-07 安徽省科学技术研究院 一种从砂生槐种子中提取氧化苦参碱的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
伍国强 等: "西藏山南地区特色蜜源植物砂生槐", 《中国蜂业》 *
李长印 等: "LC-MS技术同时测定抗肿瘤中药复方提取液中13种化学成分", 《时珍国医国药》 *
王聚乐 等: "西藏不同区域砂生槐在不同采收时间的花、茎、叶及种子中苦参碱、氧化苦参碱含量比较", 《西藏大学学报(自然科学版）》 *
翁泽斌 等: "山西产苦参种子生物碱类化学成分分析及其资源化价值探讨", 《中国中药杂志》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112697931A (zh) * 2021-03-24 2021-04-23 中国农业科学院蜜蜂研究所 三叶豆苷作为胡枝子蜜特征性标志物的应用
CN112697931B (zh) * 2021-03-24 2021-06-18 中国农业科学院蜜蜂研究所 三叶豆苷作为胡枝子蜜特征性标志物的应用
CN114324629A (zh) * 2021-12-01 2022-04-12 安徽蜜之源食品集团有限公司 一种蜂蜜中总苦参碱残留量的检测方法
CN114924015A (zh) * 2022-06-16 2022-08-19 中南大学 一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法
CN114924015B (zh) * 2022-06-16 2023-06-27 中南大学 一种苦参碱和氧化苦参碱的快速检测方法
CN116930378A (zh) * 2023-07-25 2023-10-24 江苏蜂奥生物科技有限公司 一种野桂花蜂蜜的检测鉴别方法

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