CN111812254A - 2-癸烯二酸作为蜂蜜真实性评价的指示性物质及其在蜂蜜掺假鉴别中的应用 - Google Patents

2-癸烯二酸作为蜂蜜真实性评价的指示性物质及其在蜂蜜掺假鉴别中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及食品检测领域，具体涉及2‑癸烯二酸作为蜂蜜真实性评价的指示性物质及其在蜂蜜掺假鉴别中的应用。在蜂蜜的真实性评价方法中，以2‑癸烯二酸为指示性物质，若蜂蜜样本中2‑癸烯二酸的含量介于4.0‑8.0 mg/kg时，判断所述蜂蜜样本为真实蜂蜜；若蜂蜜样本中2‑癸烯二酸的含量低于4.0 mg/kg，则判定所述蜂蜜样本为掺假蜂蜜。本发明中提供的方法具有简单、高效等优点，便于操作和推广，对制定蜂蜜真实性评价的相关行业或国家标准具有一定的指导意义，同时对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业的健康发展具有重要的现实意义。

Description

2-癸烯二酸作为蜂蜜真实性评价的指示性物质及其在蜂蜜掺 假鉴别中的应用
技术领域
本发明涉及食品检测领域，具体涉及2-癸烯二酸作为蜂蜜真实性评价的指示性物质及其在蜂蜜掺假鉴别中的应用。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜、蜜露与自身分泌物相混合，经充分酿造，储存在蜂巢中的一种天然甜味食品。由于蜂蜜中含有丰富氨基酸、酚酸、黄酮、维生素等有益物质，且具有良好的养颜、润肠、滋补等功效，深受广大人们群众的喜爱，但是市场上销售的蜂蜜却存在一定的掺假行为。果糖、葡萄糖和水分是蜂蜜中最主要的组成部分，三者占到了蜂蜜总质量的95%以上，因此，蜂蜜是一种非常易于掺假的商品。据欧盟食品药品管理委员会统计，蜂蜜掺假在所有食品掺假中位居第三，仅次于果汁和橄榄油掺假。蜂蜜掺假的形式多种多样，其中最为普遍是在蜂蜜中勾兑大量的果葡糖浆，勾兑比例高达30-100%。蜂蜜的生产依赖蜜蜂养殖，具有养殖环境恶劣、费工费时、生产周期较长等弊端；而高纯度果葡糖浆的原料来源有大米、淀粉、玉米、甜菜等，同过现代酶解和纯化工艺可以进行工厂化生产，生产成本显著低于蜜蜂养殖收获的蜜蜂。当前，我国现行的蜂蜜国家标准中主要是按照食品卫生标准进行制定，缺乏有关蜂蜜真实性评价的相关指标。基于同位素比值构建的蜂蜜掺假判别方法能够有效的鉴别蜂蜜中勾兑玉米等C4植物生产的果葡糖浆，而对当前以大米、小麦等C3植物生产的果葡糖浆束手无策。此外，随着果葡糖浆生产工艺的提升，其纯度不断提高，当前开发的蜂蜜掺假判别方法往往滞后于果葡糖浆工艺的改进，这使得基于糖浆特征性物质构建蜂蜜掺假判别方法的生命周期日益缩短。如何有效地鉴别蜂蜜掺假，评价蜂蜜的真实性已经成为广大蜂产品行业从业者的共识。
基于果葡糖浆特征性物质构建的蜂蜜掺假判别方法属于被动策略，它需要针对糖浆制备工艺的提升，不断升级改造蜂蜜掺假鉴别方法。而基于蜂蜜中固有的内源性物质构建的蜂蜜掺假判别方法可以有效地弥补基于糖浆特征物进行掺假鉴别的不足。蜂蜜中内源性物质非常丰富，包含数千种小分子化合物和大分子蛋白质等物质。但这些物质的来源主要两个途径：一是蜜源植物的花蜜或蜜露；二是蜜蜂在酿蜜过程中混入的分泌物。由于蜜源植物的种类高达数千种，难以基于蜜源植物来源的物质，构建统一的蜂蜜掺假鉴别方法。而我国饲养蜜蜂品种非常有限，仅有意大利蜜蜂和中华蜜蜂，其中我国意大利蜜蜂约600万群，是我国蜂蜜供给的主要来源，占到市场上流通商品蜂蜜的90%以上。因此，基于蜜蜂来源的物质非常适合构建统一的蜂蜜掺假判别方法。基于蜜蜂来源的物质主要是由蜜蜂咽下腺和上额腺分泌的物质，主要有各种酶类、王浆主蛋白等大分子，以及部分中长链脂肪酸等小分子物质。蜂蜜中部分来源于蜜蜂的小分子物质具有含量稳定等优点，当蜂蜜中勾兑果葡糖浆等物质之后，其固有的内源性物质发生稀释，含量降低。因此，基于蜂蜜中固有的内源性物质含量范围，设定含量阈值，制定统一的蜂蜜真实性评价方法。本发明基于该策略提供了一种新型的蜂蜜掺假判别方法，该方法具有简单、快速、方便、实用性强等优点，非常适合蜂蜜样本的掺假鉴别。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明首先采用高效液相色谱串联高分辨质谱(UHPLC-HRMS)的正负模式对来自不同年份、产地和蜜源植物的蜂蜜样品进样分析，发现所有蜂蜜在负模式情况下存在一个特征性的色谱峰(m/z 199.09758)，显著区别于花蜜，而且该物质的MS/MS图谱中存在一个丰度较高的碎片离子m/z 155.10666。基于高分辨质谱提供的精确质量数m/z 199.09758，获得该物质的元素组成为C10H15O4 -，采用Compound Discoverer 2.0软件对该物质进行多重化学物质数据库进行检索，如m/z Cloud、Chem Bank等。试验结果表明，该化合物与癸二酸具有相识的质谱和色谱特征，两者在m/z上仅存在2个氢原子的差异，暗示着该化合物为癸二酸的脱氢产物。此外，在m/z 199.09758物质的MS/MS图谱中的碎片离子m/z 137.09609、m/z 181.08592与癸二酸MS/MS谱图中m/z 139.11174、m/z 183.10157同样相差2个氢原子，再次表明上述推断的正确性。癸二酸是蜜蜂体内脂肪酸氧化代谢的一个中间产物，他主要是通过长链脂肪酸通过β-氧化途径生成。同样的，癸二酸会继续通过β-氧化生成其它降解产物。β-氧化的第一步便是对β位置的C原子发生脱氢反应，故推测m/z199.09758为2-癸烯二酸，结构如下：
Figure 572537DEST_PATH_IMAGE001
。
为保证2-癸烯二酸鉴定结果的准确性，本发明采用半制备色谱从蜂蜜样本中提取、纯化出了少量该物质，然后采用核磁共振(NMR)获得该物质的氢谱(1H-NMR)和碳谱(13H-NMR)信息，详细数据见表1。由该化合物的碳谱和氢谱数据可知，与癸二酸的相比，该物质2位和3位的碳原子发生了显著的位移，3位的碳谱由原来的24.7 ppm位移至153.6 ppm，而2位的碳谱由原来的34 ppm位移至120.4 ppm，而其它位置的碳原子的位移不显著，表明2-癸烯二酸结构的正确性。此外，氢谱数据表明：与癸二酸的相比，该物质2位和3位的氢原子均减少了1个，而且3位的氢谱由原来的1.54 ppm位移至7.11 ppm，而9位的碳谱由原来的2.11ppm位移至6.02 ppm，再次验证2-癸烯二酸化学结构的正确性。
表1 2-癸烯二酸的核磁共振碳谱和氢谱信息
Figure 522300DEST_PATH_IMAGE002
此外，本发明通过对大量蜂蜜样本的分析，发现不同年份、产地和蜜源植物的蜂蜜样本中2-癸烯二酸的含量均介于4.0-8.0 mg/kg，足见该物质在蜂蜜中的含量较为稳定。因此，可以基于2-癸烯二酸含量作为蜂蜜的真实性鉴别的指示性物质，用于评价蜂蜜中是否掺假。
基于上述发现，本发明首先提供2-癸烯二酸在蜂蜜的真实性评价中的应用。
进一步的，本发明提供一种蜂蜜的真实性评价方法，包括：以2-癸烯二酸为指示性物质，若蜂蜜样本中2-癸烯二酸的含量介于4.0-8.0 mg/kg时，判断所述蜂蜜样本为真实蜂蜜；若蜂蜜样本中2-癸烯二酸的含量低于4.0 mg/kg，则判定所述蜂蜜样本为掺假蜂蜜。
作为优选，通过加入2-癸烯二酸的花蜜确认癸烯二酸的含量与峰面积间的线性关系，根据蜂蜜样本中2-癸烯二酸的峰面积推算其含量。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap和/或LC-MS/MS检测蜂蜜样本。
作为优选，2-癸烯二酸在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/ z199.09758([M-H]-)准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5 ppm；优选2-癸烯二酸色谱峰的保留时间为9.38 min，保留时间允许的偏差应小于0.2 min。
此外，为了提高蜂蜜的鉴别能力，2-癸烯二酸的精确质量数和保留时间除了满足上述条件之外，该物质的MS/MS图谱(子离子图谱)中应该含有其主要的碎片离子，本发明进一步发现了其特征碎片离子：m/z 155.10666、m/z 137.09609、m/z 156.10982、m/z164.83499、m/z 83.04867，其精确质量数的误差应当小于10 ppm。基于上述MS/MS图谱中提供的主要碎片离子，即便是在无2-癸烯二酸对照品的情况，依然可以通过判定蜂蜜样本中含有蜂蜜，并可积分母离子峰面积用于蜂蜜含量的计算。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，液相条件如下：
采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0 min，5%的流动相B；2.0-7.0 min，5-30%的流动相B；7.0-14.0min，30-95%的流动相B；14.0-18.0 min，95%的流动相B；18.0-18.1 min，95-5%的流动相B；18.1-20.0 min，5%的流动相B。
优选液相的流速为0.30 mL/min。
优选进样量为5.0 µL。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速45 arb；辅助气的流速10 arb；挡锥气的流速0 arb；电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为60 V；离子源的温度350 ℃；
优选采集的模式为负离子模式下的Full MS-ddMS2，其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：80-1200 Da；Spectrum data：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.0e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：2；Isolation window：2.0 Da；Scan range：100-1000 Da；NCE：35 eV；Spectrum data：Centroid；dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apextrigger：2-6 s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，由于检测仪器的不同，LC-MS/MS的液相和质谱设置条件与UHPLC-Q-Orbitrap差异较大。
优选液相条件如下：采用C18色谱柱（优选采用较短的C18色谱柱），柱温为25 ℃，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0-0.8min，5%的流动相B；0.8-1.2 min，5-40%的流动相B；1.2-2.5 min，40-90%的流动相B；2.5-3.5 min，90%的流动相B；3.5-3.6 min，90-5%的流动相B；3.6-6.0 min，5%的流动相B。
优选液相的流速为0.30 mL/min。
优选进样量为3.0 µL。
作为优选，为了准确定量蜂蜜中的2-癸烯二酸，采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，采集的模式为负离子模式下的多反应监测(MRM)，MRM关键参数的设置如下：199.1>155.1(定量离子)，10 eV，199.1>137.1(定性离子)，9 eV。
质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；离子喷雾电压：3500V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：5 L/min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11 L/min。
其中，2-癸烯二酸的详细MRM参数设置参见表2。
表2 液相串联三重四极杆质谱检测2-癸烯二酸的MRM主要参数
Figure 957830DEST_PATH_IMAGE003
为验证建立的LC-MS/MS方法科学合理性，本发明考察了该方法的准确度和精密度，变异系数均小于10%，完全符合仪器定量检测分析的要求。
作为优选，在检测前，还包括利用18~22%甲醇水对所述蜂蜜样本进行提取的步骤。
作为优选，对蜂蜜样本进行检测前，将蜂蜜按1:(9-11)的质量体积比充分溶于甲醇水中，进行提取；更优选为1:10。
作为优选，所述提取具体包括如下步骤：按0.8 g蜂蜜样品，7.2 mL甲醇水的比例将其混合，并使蜂蜜充分化开后，20194 g，4 ℃离心20 min，再取100 µL提取液：900 µL甲醇水的比例稀释一次。
本发明涉及到的试剂和标准品在市场上均可获得，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
本发明首次公布了蜂蜜中一种内源性物质：2-癸烯二酸，并提出了2-癸烯二酸可作为蜂蜜真实性评价的指示性物质，采用液相串联质谱（UHPLC-Q-Orbitrap或LC-MS/MS）检测蜂蜜中2-癸烯二酸的方法。基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度，检出限可以达到2.0 µg/kg。
此外，为了准确定量蜂蜜中2-癸烯二酸含量，本发明还对该物质的LC-MS/MS检测方法和关键的检测参数进行了优化。
同时，本发明中的方法还具有简单、高效等优点，便于操作和推广，对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业的健康发展具有重要的现实意义。
附图说明
图1为蜂蜜中内源性物质2-癸烯二酸的化学结构图。
图2为UHPLC-Q-Orbitrap在负离子模式下检测蜂蜜的总离子流色谱图(A)和2-癸烯二酸的精确提取离子流色谱图(B)，其中提取的质量窗口偏差小于5 ppm。
图3为2-癸烯二酸在UHPLC-Q-Orbitrap负离子模式下全扫描质谱图(A)、精确质量数的子离子质谱图(B)。
图4为我国21种主要单花蜂蜜中2-癸烯二酸的含量。
图5为20种商品化蜂蜜中的2-癸烯二酸含量情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例中所使用的仪器与试剂如下：
1. 超高效液相色谱串联四极杆/高分辨静电轨道阱质谱仪(UHPLC-Q/ExactivePlus)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
2. 1200 series液相色谱-6460三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司；
3.台式低温离心机(1-15Pk)，德国Sigma公司；
4.电子分析天平(PL203)，德国METTLERTOLEDO公司；
5.超纯水机(Milli-Q Gradient)，美国Millipore公司；
6.涡动仪(G560E)，美国Scientific Industries公司；
甲酸(FA)从上海安谱实验科技股份有限(CNW)公司购买；乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)购买于Fisher公司。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1 蜂蜜中内源性物质2-癸烯二酸的发掘与结构鉴定
本实施例首先通过液相色谱串联高分辨质谱的正负模式对大量的蜂蜜以及其它常见的蜂蜜进样分析。实验结果表明蜂蜜在负模式下的总离子流色谱图中存在一个含量较高的化合物，如图2所示，其中的A为蜂蜜样本的总离子流色谱图，B为蜂蜜样本中2-癸烯二酸的精确提取离子流色谱(质量提取窗口为5 ppm)，其色谱保留时间为9.38 min，精确质量数为m/z 199.09702。
基于高分辨质谱提供的精确质量数m/z 199.09758(R如图3中A图)，本实施例获得该物质的元素组成为C10H15O4 -。在该物质的MS/MS图谱中；该物质峰的主要碎片含有m/z155.10666、m/z 137.09609、m/z 156.10982、m/z 164.83499、m/z 83.04867(如图3中B图)。随后，本实施例采用Compound Discoverer 2.0软件对该物质进行多重化学物质数据库进行检索，如m/z Cloud、Chem Bank等。数据库检索结果表明该化合物为癸二酸类似物质，具体为癸二酸的脱氢产物。
此外，为了探究该物质的详细化学结构，本发明采用半制备色谱分离纯化出了该物质，并采用NMR获得了该物质的碳谱和氢谱数据(见表1)。通过对氢谱和碳谱数据的详细解析，最后明确了该物质的化学结构为2-癸烯二酸，化学结构如图1所示。
实施例2 不同蜂蜜样本中2-癸烯二酸的含量情况
1.样品来源
在全国范围内，于不同季节和年份从蜂农处直接采集常见的真实蜂蜜样本，共计约500余份，用于考察各种蜂蜜中2-癸烯二酸的含量。蜜蜂的品种具体为：洋槐、枣花、油菜、荔枝、龙眼、荆条、桉树、雪脂莲、向日癸、乌桕、石榴、野桂花、野坝子、柠条、麦卢卡、老瓜头、枸杞、鸭脚木、党参、五倍子、柑橘蜂蜜样本，每个品种单花蜜样本数量不少20个。
2.溶液配制
提取溶液：移取甲醇20 mL，超纯水定容到100 mL，4 ℃保存。
2-癸烯二酸标准溶液：称取2 mg的癸烯二酸标准品，甲醇定容至2 mL，-20 ℃冷冻保存，有效期6个月。
3.UHPLC-Q Exactive plus测试条件如下
（1）样品处理
称取0.8 g蜂蜜加入7.2 mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜，再取100 µL提取液：900 µL甲醇水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。
（2）质控样本：
称取0.8 g花蜜(不含癸烯二酸)加入7.2 mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜转移至进样品中，再吸取100 µL提取液，800 µL甲醇水和100 µL浓度为50 mg/kg的癸烯二酸标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
（3）UHPLC-Q Exactive plus仪器设置
色谱条件为：分析柱为C18色谱柱。以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0 min，5%的流动相B；2.0-7.0 min，5-30%的流动相B；7.0-14.0min，30-95%的流动相B；14.0-18.0 min，95%的流动相B；18.0-18.1 min，95-5%的流动相B；18.1-20.0 min，5%的流动相B；流速：0.30 mL/min；进样量：5.0 µL。
离子源参数：鞘气的流速45 arb；辅助气的流速10 arb；挡锥气的流速0 arb；电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320℃；S-lens RF level设为60 V；离子源的温度350 ℃。
采集的模式为负离子模式下的Full MS-ddMS2。
优选采集的模式为负离子模式下的Full MS-ddMS2，其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：80-1200 Da；Spectrum data：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.0e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：2；Isolation window：2.0 Da；Scan range：100-1000 Da；NCE：35 eV；Spectrum data：Centroid；dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apextrigger：2-6 s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
质谱生成的数据通过Xcalibur软件收集并存储，将质谱采集的raw数据通过Xcalibur的Qualitative browser分析，比较样品与空白加标样品中2-癸烯二酸的Full MS及MS/MS图谱，确定样品中含有2-癸烯二酸。
（4）标准曲线的绘制：
在空白蜂蜜样品提取后过滤膜的稀释溶液中制备一系列2-癸烯二酸溶液(0.2，0.5，1，2，5，10，20 mg/kg)。并指定5 mg/kg的空白添加为质控样本。数据通过Trace Finder软件处理，定量蜂蜜样品中2-癸烯二酸的含量。
通过Trace Finder软件即可分析蜂蜜样品中的2-癸烯二酸含量。通过浓度稀释计算，得到不同蜂蜜中2-癸烯二酸的含量，见图4。当样品中2-癸烯二酸的含量介于4.0-8.0mg/kg时，可以认为样品蜂蜜样品为真实蜂蜜。
实施例3 2-癸烯二酸作为指示性物质在蜂蜜掺假鉴别中的应用
1.样品来源
从市场购买标签为蜂蜜的多种品级或品牌的蜂蜜样本共20份。
2.实验步骤
（1）溶液配制
提取溶液：移取甲醇20 mL，超纯水定容到100 mL。4 ℃保存。
2-癸烯二酸标准溶液：称取2 mg的癸烯二酸标准品，甲醇定容至2 mL，-20 ℃保存，有效期6个月。
（2）样品处理
称取0.8 g蜂蜜加入7.2 mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜，再取100 µL提取液：900 µL甲醇水的比例稀释一次。稀释液转移至进样瓶中等待上机分析。
（3）质控样品
称取0.8 g果葡糖浆样本(不含2-癸烯二酸)加入7.2 mL提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜转移至进样品中，再吸取100 µL提取液，800 µL甲醇水和100 µL浓度为50 mg/kg的2-癸烯二酸标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
3. Agilent1200液相色谱-6460三重四级杆质谱分析条件如下
液相条件中采用较短的C18色谱柱分离，是以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用较短的梯度洗脱程序分离：0-0.8 min，5%的流动相B；0.8-1.2 min，5-40%的流动相B；1.2-2.5 min，40-90%的流动相B；2.5-3.5 min，90%的流动相B；3.5-3.6 min，90-5%的流动相B；3.6-6.0 min，5%的流动相B。液相的流速为0.30 mL/min。进样量为3.0 µL。
LC-MS/MS的质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：负离子扫描；监测方式：多反应监测(MRM)；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：5 L/min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11 L/min。
采集的模式为负离子模式下的MRM模式。MRM参数： 199.1>155.1 (定量离子)，10eV；199.1>137.1 (定性离子)，9 eV。
4.标准曲线的绘制
在空白蜂蜜样品提取后过滤膜的稀释溶液中制备一系列2-癸烯二酸溶液（0.2，0.5，1，2，5，10，20 mg/kg），并指定4 mg/kg的空白添加为质控样本。
通过Agilent 的Mass Hunter定量软件分析样品及空白加标样品，外标法定量。
通过定量软件即可分析蜂蜜样品中的2-癸烯二酸含量。结果如图5所示，其中约20%的样品中2-癸烯二酸的含量小于4 mg/kg。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.2-癸烯二酸在蜂蜜的真实性评价中的应用。
2.一种蜂蜜的真实性评价方法，其特征在于，包括：以2-癸烯二酸为指示性物质，若蜂蜜样本中2-癸烯二酸的含量介于4.0-8.0 mg/kg时，判断所述蜂蜜样本为真实蜂蜜；若蜂蜜样本中2-癸烯二酸的含量低于4.0 mg/kg，则判定所述蜂蜜样本为掺假蜂蜜。
3.根据权利要求2所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap和/或LC-MS/MS检测蜂蜜样本。
4.根据权利要求3所述的真实性评价方法，其特征在于，2-癸烯二酸在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取离子流色谱图中含有m/z 199.09758 [M-H]-准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5 ppm；2-癸烯二酸色谱峰的保留时间为9.38 min，保留时间偏差小于0.2 min。
5.根据权利要求3所述的真实性评价方法，其特征在于，2-癸烯二酸的MS/MS图谱中应含有m/z 155.10666、m/z 137.09609、m/z 156.10982、m/z 164.83499、m/z 83.04867中的一个或多个碎片离子峰，其精确质量数的误差应当小于10 ppm。
6.根据权利要求3或4所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，液相色谱条件如下：采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0 min，5%的流动相B；2.0-7.0min，5-30%的流动相B；7.0-14.0min，30-95%的流动相B；14.0-18.0 min，95%的流动相B；18.0-18.1 min，95-5%的流动相B；18.1-20.0 min，5%的流动相B。
7.根据权利要求3或4所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，质谱条件如下：离子源参数：鞘气的流速45 arb；辅助气的流速10arb；挡锥气的流速0 arb；电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为60 V；离子源的温度350 ℃；采集的模式为负离子模式下的Full MS-ddMS2，碰撞能量为35 eV。
8.根据权利要求3或5所述的真实性评价方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，液相条件如下：采用C18色谱柱，柱温为25 ℃，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0-0.8 min，5%的流动相B；0.8-1.2min，5-40%的流动相B；1.2-2.5 min，40-90%的流动相B；2.5-3.5 min，90%的流动相B；3.5-3.6 min，90-5%的流动相B；3.6-6.0 min，5%的流动相B。
9.根据权利要求3或5所述的真实性评价方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，质谱条件如下：电喷雾离子源；扫描方式：负离子扫描；监测方式：多反应监测；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：5 L/min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11 L/min；采集的模式为负离子模式下的MRM模式，MRM参数如下：199.1>155.1，10 eV，199.1>137.1，9 eV。
10.根据权利要求3所述的真实性评价方法，其特征在于，在检测前，还包括利用18~22%甲醇水对所述蜂蜜样本进行提取的步骤。
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