CN111426776B - Hqr作为鸭脚木蜂蜜特征性标志物的应用 - Google Patents

Hqr作为鸭脚木蜂蜜特征性标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及食品检测领域，具体涉及HQR（4‑羟基喹啉‑β‑芸香糖苷）作为鸭脚木蜂蜜特征性标志物的应用。同时，本发明提出了一种鸭脚木蜂蜜的真实性评价方法，以HQR为特征化合物，当其在蜂蜜中的含量介于8‑10 mg/kg时，可将其判定为鸭脚木蜂蜜；否则判定为其它蜂蜜或者掺假鸭脚木蜂蜜。本发明中提供的鸭脚木蜂蜜检测方法具有简单、高效等优点，便于操作和推广，对制定优质鸭脚木蜜的相关行业标准的具有一定的指导意义，同时对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业的健康发展具有重要的现实意义。

Description

HQR作为鸭脚木蜂蜜特征性标志物的应用
技术领域
本发明涉及食品检测领域，尤其涉及HQR作为鸭脚木蜂蜜特征性标志物的应用。
背景技术
蜂蜜是蜜蜂采集蜜源植物的花蜜与自身分泌物相混合，经充分酿造而成的天然甜物质。由于蜂蜜中营养物质丰富，且具有一定的养颜、润肠、保健等功效，深受人们喜爱。现有技术中，蜜源植物种类较多，包括椴树、向日葵、洋槐、枣花、荆条、板栗、棉花、老瓜头、枸杞、柠条、苜蓿、黄芪、党参、苕子、石榴、橡胶、野坝子、油菜、柑橘、乌桕、琵琶、荔枝、龙眼、鸭脚木等。同一种类的蜜源植物花期相同，且地理分布集中，这为蜂农生产单一蜜源的单花蜜形成了基础。由于不同单花蜜的口感、色泽、气味存在差异，形成了不同人群对某种单花蜜的偏好性，而单花蜜的价格也存在较大的差异，某一种类的花蜜可能比另一种类的花蜜价格高3-6倍。当前，单花蜜标识并无统一和强制性判定标准。这为不良企业胡乱标识提供了空隙。从单花蜜中识别和鉴定其特有的内源性物质，并基于此构建相应的单花蜜纯度和真实性的评价方法，已经成为蜂产品行业的共识。
鸭脚木又名鹅掌柴，花期一般2个月左右。鸭脚木蜂蜜又称为冬蜜，因色香味俱佳，略有微苦，深受消费者喜爱。由于鸭脚木蜜产量有限，生产成本较高，导致鸭脚木蜜售价显著高于常见的其它单花蜜。为了追逐高额利润，不良商家往往会采用其它单花蜜冒充鸭脚木蜜，或者在鸭脚木蜜中勾兑其它廉价的单花蜜，甚至勾兑果葡糖浆。严重损害了蜂蜜消费者的正当权益，危害了蜂产品消费行业的健康发展和市场秩序。因此，亟需开发一种切实有效的鸭脚木蜂蜜真实性和纯度评价方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了HQR作为鸭脚木蜂蜜特征性标志物的应用。
本发明在通过液相色谱串联高分辨质谱的正负模式对大量的鸭脚木蜂蜜与其他常见单花蜜扫描分析时发现了一种鸭脚木蜂蜜均在正模式情况下存在高含量的物质峰m/z 454.17077，并经过多步骤的检索、比对和分析，得出该物质峰对应的化合物HQR为4-羟基喹啉-β-芸香糖苷。
通过进一步地实验验证，本发明发现一方面，鸭脚木的鲜花、花蜜和鸭脚木蜜中均含有化合物HQR，这说明，HQR是鸭脚木的次级代谢产物，它通过蜜蜂的采集行为迁移、并富集在蜂蜜中；另一方面，鸭脚木蜂蜜中化合物HQR含量较高且稳定，非常适合作为鸭脚木蜂蜜的真实性鉴别及纯度评价指标，用于评价鸭脚木蜂蜜中是否掺入果葡糖浆或者混入其他廉价蜂蜜。
根据上述发现，本发明首先提出了4-羟基喹啉-β-芸香糖苷（以下简称HQR）作为鸭脚木蜂蜜特征性标志物的应用，所述HQR化学结构如下：
Figure 932928DEST_PATH_IMAGE001
。
本发明进一步提出一种鸭脚木蜜的真实性评价方法，以所述HQR为特征化合物对蜂蜜样本进行检测，若所述蜂蜜样本中所述HQR的含量介于8-10 mg/kg时，判断所述蜂蜜样本为鸭脚木蜜；否则，判定所述蜂蜜样本为其它蜂蜜或者掺假鸭脚木蜜：
作为优选，通过加入HQR的空白蜂蜜确认HQR的含量与峰面积间的线性关系，根据所述蜂蜜样本中HQR的峰面积推算其含量。
具体地，向空白蜂蜜中加入梯度浓度的HQR得到梯度浓度的HQR标准品后进行检测，计算峰面积并绘制HQR的含量与峰面积间关系的标准曲线。
作为优选，采用UHPLC-Q-Orbitrap (超高液相色谱-高分辨质谱)或 LC-MS/MS检测所述蜂蜜样本。
作为优选，HQR在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取粒子流色谱图中含有m/z 454.17077 [M+H]+准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5 ppm；优选HQR色谱峰的保留时间为5.42 min，保留时间偏差小于0.2 min。
此外，为了提高鸭脚木蜂蜜的鉴别能力，HQR的精确质量数和保留时间除了满足上述条件之外，该物质的MS/MS图谱（子离子图谱）中应该含有其主要的碎片离子，本发明进一步确定了其特征碎片离子(HQR的MS/MS图谱中应含有以下一个或多个碎片离子蜂)：m/z146.06004、m/z 369.24829、m/z 85.02841、m/z 111.04406、m/z 129.05462，其精确质量数的误差应当小于10 ppm。基于上述MS/MS图谱中提供的主要碎片离子，即便是在无HQR对照品的情况，依然可以通过判定蜂蜜样本中含有鸭脚木蜂蜜，并可积分母离子峰面积用于鸭脚木蜂蜜含量的计算。
进一步地，采用UHPLC-Q-Orbitrap对所述蜂蜜样本进行检测时，液相色谱条件如下：
采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0 min，5%的流动相B；2.0-7.0 min，5-30%的流动相B；7.0-14 min，30-95%的流动相B；14-18 min，95%的流动相B；18.0-18.1 min，95-5%的流动相B；18.1-20.0min，5%的流动相B。
作为优选，液相的流速为0.30 mL/min。
作为优选，进样量为5.0 µL。
进一步地，采用UHPLC-Q-Orbitrap对蜂蜜样本进行检测时，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速45 arb；辅助气的流速10 arb；挡锥气的流速0 arb； 电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为 60；离子源的温度350℃；
作为优选，采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2，确保扫描范围包含551.19814Da，碰撞能量(NCE)为35 eV。其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：100-800 Da； Spectrum data：Centroid；其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.6e5；MaximumIT：50 ms；Loop count：1； Isolation window：2.0 Da； NCE：35 eV；Spectrum data：Centroid；dd settings中，Minimum AGC： 8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
采用LC-MS/MS对所述蜂蜜样本进行检测时，由于检测仪器的不同，LC-MS/MS的液相和质谱设置条件与UHPLC-Q-Orbitrap差异较大。
进一步地，采用LC-MS/MS对所述蜂蜜样本进行检测时，液相色谱条件如下：采用C18色谱柱（优选采用较短的C18色谱柱），柱温为25℃，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0-0.8 min，5%的流动相B；0.8-1.2 min，5-40%的流动相B；1.2-2.5 min，40-90%的流动相B；2.5-3.5 min，90%的流动相B；3.5-3.6min，90-5%的流动相B；3.6-6.0 min，5%的流动相B。
作为优选，液相的流速为0.30 mL/min。
作为优选，进样量为3.0 µL。
作为优选，为了准确定量蜂蜜中的HQR，采用LC-MS/MS对蜂蜜样本进行检测时，采集的模式为正离子模式下的多反应监测(MRM)，MRM关键参数的设置如下：130 V, 454.2>146.0 (定量离子)，22 eV，454.2>85.0 (定性离子)，33 eV。
质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；离子喷雾电压：3500V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：5 L/min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11 L /min。
其中，HQR的详细MRM参数设置参见表1。
Figure 872065DEST_PATH_IMAGE002
为验证建立的LC-MS/MS方法科学合理性，本发明考察了该方法的准确度和精密度，变异系数均小于10%，完全符合残留检测分析的要求。
基于本方法采用的仪器和公布的参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱或者液相串联三重四极杆质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整。
进一步地，在检测前，还包括利用甲醇水对所述蜂蜜样本进行提取的步骤；
作为优选，在所述甲醇水中，优选甲醇与水的体积比为2：(7~9)，优选为2：8。
作为优选，对蜂蜜样本进行检测前， 将蜂蜜按1：(9~11)的质量体积比充分溶于甲醇水中，进行提取；更优选为1：10。
作为优选，所述提取包括如下步骤：按0.8 g蜂蜜样品: 7.2 mL甲醇水的比例将其混合，并使蜂蜜充分化开后，20194 g，4℃离心20 min，取上清过0.22 µm滤膜，再取50 µL的提取液，添加至950 µL甲醇水中再次稀释。
本发明涉及到的试剂和标准品在市场上均可获得，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
本发明的有益效果在于：
（1）本发明首次公布了鸭脚木蜂蜜中一种高含量物质为HQR，并提出了HQR可作为鸭脚木蜂蜜真实性和纯度评价的指标，并可进一步采用液相色谱串联质谱（UHPLC-Q-Orbitrap或LC-MS/MS）对蜂蜜中HQR进行定性和定量分析。基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度，检出限可以达到2 µg/kg 。
（2）本发明对HQR的LC-MS/MS检测方法和关键的检测参数进行了优化，可以准确定量鸭脚木蜂蜜中HQR含量。
（3）本发明提供的检测方法简单、高效，便于操作和推广，对保护蜂蜜消费者的合法权益和维护蜂蜜消费行业的健康发展具有重要的现实意义。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的LC-HRMS检测鸭脚木蜜的总离子流色谱图(TIC)；
图2为本发明实施例1提供的LC-HRMS检测鸭脚木蜜中HQR的提取离子流色谱图(EIC)；
图3为本发明实施例1提供的HQR精确质量数的Full Mass和MS/MS质谱图，其中上图为Full Mass质谱图，下图为MS/MS质谱图；
图4为本发明实施例1提供的化合物m/z 146的Full Mass和MS/MS质谱图，其中上图为Full Mass质谱图，下图为MS/MS质谱图；
图5为本发明实施例1提供的鸭脚木蜂蜜中生物标志物HQR的化学结构；
图6为本发明实施例2提供的UHPLC-Q-Orbitrap检测HQR分别在鸭脚木蜂蜜和空白蜂蜜样本中的精确提取离子流色谱图，其中上图为鸭脚木蜂蜜，下图为空白蜂蜜，提取的质量窗口偏差小于5 ppm；
图7为本发明实施例2提供的UHPLC-Q-Orbitrap的Full MS-ddMS2模式检测定量21种蜜源蜂蜜样品中HQR的含量；
图8为本发明实施例3提供的LC-MS/MS的MRM模式下HQR的定量、定性离子提取离子流色谱图；
图9为本发明实施例3提供的市场上50个鸭脚木蜂蜜样品中HQR的含量情况。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
仪器与试剂：
1. 质谱仪(Q-Exactive Plus)，美国Thermo Fisher Scientific公司；
2. 1200 series液相色谱-6460三重四级杆质谱，美国Agilent Technologies公司；
3.台式低温离心机(1-15Pk)，德国Sigma公司；
4.电子分析天平(PL203)，德国METTLERTOLEDO公司；
5.超纯水机(Milli-Q Gradient)，美国Millipore公司；
6.涡动仪(G560E)，美国Scientific Industries公司；
HQR(化学结构见图5)；β-葡萄糖醛酸酶购买于默克化工技术(上海)有限公司；甲酸(FA)从上海安谱实验科技股份有限(CNW)公司购买；乙腈(ACN)和甲醇(MeOH)购买于Fisher公司。
实施例1
本实施例首先通过液相色谱串联高分辨质谱的正负模式对大量的鸭脚木蜂蜜与其他常见单花蜜扫描分析，发现鸭脚木蜂蜜均在正模式（如图1所示）情况下存在高含量的物质峰m/z 454.17077（如图2所示），显著区别于其他常见单花蜜，该物质峰的主要碎片含有m/z 146.06004（如图3所示）。基于高分辨质谱提供的精确质量数m/z 454.17077，获得该物质的元素组成为C21H28NO10 +，与主要碎片m/z 146.06004相比，元素组成中减少了C12H20O9；由于质谱碎裂过程中可能存在脱水反应，猜测减少的物质可能为C12H22O10。基于上述分析，可知，该物质的元素组成为C22H34O13，主要构成为C9H7NO与C12H22O10。随后，本发明基于高分辨质谱获得了化合物m/z 146的Full Mass和MS/MS质谱图（如图4所示），采用CompoundDiscoverer 2.0软对对该物质进行多重化学物质数据库进行检索，如m/z Cloud、ChemBank等。试验结果表明，HQR的MS/MS图谱中的碎片离子m/z 146.06004 (C9H8NO+)对应化合物为羟基喹啉。此外，HQR的MS/MS图谱中另外一个关键的碎片离子m/z 327.12857(C12H23O10 +)对应的化学物质为芸香二糖。基于上述数据，初步将化合物HQR鉴定为羟基喹啉-芸香糖苷。为了详细的表征本发明指出HQR的化学结构，本发明委托中国农业大学动物医学院从鸭脚木蜜中提出、纯化出了该化合物，并获得该化合物的高纯度的对照品20 mg。随后采用获得HQR对照品采用NMR(核磁共振)的1H谱和13C的化学结构表征，详细的结果见表2。NMR的结果表明HQR的化学结构为4-羟基喹啉-β-芸香糖苷（如图5所示）。
Figure 477490DEST_PATH_IMAGE003
此外，为保证HQR鉴定结果的准确性，本发明采用β-葡萄糖醛酸酶对纯化后的HQR进行了酶解处理，然后再次采用液相串联高分辨质谱分析，结果发现了高含量的m/z146.06004 (C9H8NO+；4-羟基喹啉)和m/z 327.12857 (C12H23O10 +；芸香二糖)，并且，两者的色谱和质谱性质均与标准品进行了对比，结果完全一致，酶解获得结果再次证明了HQR化学结构鉴定的准确性。另外，本发明采集了鸭脚木的鲜花、花蜜和鸭脚木蜜等样本，样本经过前处理之后，由LC-HRMS进样分析，发现鸭脚木的鲜花、花蜜和鸭脚木蜜中均含有化合物HQR，这说明，HQR是鸭脚木的次级代谢产物，它通过蜜蜂的采集行为迁移、并富集在蜂蜜中。因此，可以采用高含量的HQR做为鸭脚木蜂蜜的真实性鉴别及纯度评价指标，用于评价鸭脚木蜂蜜中是否掺入果葡糖浆或者混入其他廉价蜂蜜。
实施例2
1.样品来源
从市场或者蜂农处购买常见的真实蜂蜜样本共90份用于检测各种蜂蜜中HQR的含量，具体的包括：洋槐、枣花、油菜、荔枝、龙眼、荆条、桉树、雪脂莲、向日葵、乌桕、石榴、野桂花、野坝子、柠条、麦卢卡、老瓜头、枸杞、党参、五倍子、柑橘蜂蜜各四个样品，以及10个鸭脚木样品。
2. 溶液配制
提取溶液：移取甲醇20 mL，超纯水定容到100 mL。4 ℃保存。
HQR标准溶液：称取10 mg的HQR标准品，甲醇定容至10 mL。4 ℃保存，有效期2个月。
3. Q Exactive plus测试条件如下：
（1）样品处理：
称取0.8 g蜂蜜加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜，进样瓶中加入900 µL提取液，再取过膜后的液体100 µL转移至进样品瓶涡旋混匀，等待上机分析。
（2）质控样本：
称取0.8 g空白蜂蜜（不含HQR）加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜，进样瓶中加入890 µL提取液，再取过膜后的液体10 µL转移至进样瓶中涡旋混匀，再移取100 µL浓度为5 mg/L的HQR标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
（3）Q Exactive plus仪器设置
色谱条件为：分析柱为C18色谱柱。以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0 min，5%的B； 2.0-7.0 min，5-30%的B； 7.0-14min，30-95%的B； 14-18 min，95%的B； 18.0-18.1 min，95-5%的B；18.1-20.0 min，5%的B；流速：0.30 mL/min；进样量：5.0 µL。
离子源参数：鞘气的流速45； 辅助气的流速10；挡锥气的流速0； 电喷雾电压3.5kV；离子导管的温度320℃；S-lens RF level设为 60； 离子源的温度350 ℃。
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2。
其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100 ms；Scan range：200-800 Da； Spectrum data：Centroid。其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：17500；AGC Target：1.6e5；Maximum IT：50 ms；Loop count：1； Isolationwindow：2.0 Da； NCE：35 eV；Spectrum data：Centroid。而dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger：2-6 s；Exclude isotope：on；Dynamic exclusion：8.0 s。
质谱生成的数据通过Xcalibur软件收集并存储，将质谱采集的raw数据通过Xcalibur的Qualitative browser分析，比较样品与空白加标样品中HQR的Full MS及MS/MS图谱，确定样品中含有HQR。检测HQR分别在空白蜂蜜和鸭脚木蜂蜜样本中的精确提取粒子流色谱图，其中提取的质量窗口偏差小于5 ppm，得到图6。
（4）标准曲线的绘制：在空白蜂蜜样品提取后过滤膜的稀释10倍的溶液中制备一系列HQR溶液(5，10，20，50，100，200 ng/mL)。并指定100 µg/L的空白添加为质控样本。数据通过Trace Finder软件处理，定量蜂蜜样品中HQR的含量。得到标准曲线公式为Y=1.7364e4X+4.9643e5，R2=0.996 (X为浓度Y定量离子响应积分值)。
通过Trace Finder软件即可分析蜂蜜样品中的HQR含量。通过浓度稀释计算，得到蜂蜜中HQR的含量，见图7。当样品中HQR的含量介于8-10 mg/kg时，可以被认为样品蜂蜜的蜜源为鸭脚木，该样品为鸭脚木蜂蜜。
实施例3
1.样品来源
从市场购买标签为鸭脚木蜂蜜的多种品级或品牌的蜂蜜样本共50份。
2. 实验步骤
（1）溶液配制
提取溶液：移取甲醇20 mL，超纯水定容到100 mL。4 ℃保存。
HQR标准溶液：称取10 mg的HQR标准品，甲醇定容至10 mL。4 ℃保存，有效期2个月。
（2）样品处理：
称取0.8 g蜂蜜加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜，进样瓶中加入950 µL提取液，再取过膜后的液体50 µL转移至进样瓶中涡旋混匀，等待上机分析。
（3）质控样品：
称取0.8 g空白蜂蜜（不含HQR）加入7.2 mL 提取溶液，在室温下涡旋至完全溶解，并在20194 g，4 ℃下离心20 min。收集上清液过0.22 µm滤膜，进样瓶中加入850 µL提取液，再取过膜后的液体50 µL转移至进样瓶中涡旋混匀，再移取100 µL浓度为500 µg/L的HQR标准溶液。涡旋混匀，等待上机分析。
3. Agilent1200液相色谱-6460三重四级杆质谱分析条件如下：
液相条件中采用较短的C18色谱柱分离，是以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为B，采用较短的梯度洗脱程序分离：0-0.8 min，5%的流动相B；0.8-1.2 min，5-40%的流动相B；1.2-2.5 min，40-90%的流动相B；2.5-3.5 min，90%的流动相B；3.5-3.6 min，90-5%的流动相B；3.6-6.0 min，5%的流动相B。优选液相的流速为0.30 mL/min。优选进样量为3.0 µL。
LC-MS/MS的质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测(MRM)；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300 ℃；干燥气流速：5 L /min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11 L /min。
采集的模式为正离子模式下的MRM模式。MRM参数： Fragementor：130 V, 454.2>146.0 （定量离子），22 eV，454.2>85.0 （定性离子），33 eV。
LC-MS/MS的MRM模式下HQR的定量、定性离子提取图如图8所示。
4.标准曲线的绘制：在空白蜂蜜样品提取后过滤膜的稀释20倍的溶液中制备一系列HQR溶液(5，10，20，50，100，200 ng/mL)。并指定50 µg/L的空白添加为质控样本。
通过Agilent 的Mass Hunter定量软件分析样品及空白加标样品。外标法定量，得到标准曲线公式为Y=98471.1*X+216702.6，R2=0.998 (X为浓度Y定量离子响应积分值)。
通过定量软件即可分析蜂蜜样品中的HQR含量。结果如图9所示，其中54%的样品中HQR的含量小于8mg/kg，这表明市场上销售的商品鸭脚木蜂蜜存在严重的质量问题，纯度较低。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.HQR作为鸭脚木蜂蜜特征性标志物的应用，所述HQR的化学结构如下：
Figure 980796DEST_PATH_IMAGE001
。
2.一种鸭脚木蜂蜜的真实性评价方法，其特征在于，以HQR为特征化合物对蜂蜜样本进行检测，若所述蜂蜜样本中所述HQR的含量介于8-10 mg/kg时，判断所述蜂蜜样本为鸭脚木蜜；否则，判定所述蜂蜜样本为其它蜂蜜或者掺假鸭脚木蜜，所述HQR的化学结构如下：
Figure 505318DEST_PATH_IMAGE002
。
3.根据权利要求2所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap，和/或，LC-MS/MS检测所述蜂蜜样本。
4.根据权利要求3所述的真实性评价方法，其特征在于，所述HQR在UHPLC-Q-Orbitrap的精确提取粒子流色谱图中含有m/z 454.17077 [M+H]+准分子离子峰，其精确质量数的误差小于5 ppm；HQR色谱峰的保留时间为5.42 min，保留时间偏差小于0.2min。
5.根据权利要求3所述的真实性评价方法，其特征在于，所述HQR的MS/MS图谱中含有m/ z 146.06004、m/z 369.24829、m/z 85.02841、 m/z 111.04406、m/z 129.05462中的一个或多个碎片离子峰，其精确质量数的误差小于10 ppm。
6.根据权利要求3或4所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对所述蜂蜜样本进行检测时，液相色谱条件如下：
采用C18色谱柱，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B，采用梯度洗脱程序分离：0-2.0 min，5%的流动相B；2.0-7.0 min，5-30%的流动相B；7.0-14min，30-95%的流动相B；14-18 min，95%的流动相B；18.0-18.1 min，95-5%的流动相B；18.1-20.0 min，5%的流动相B。
7.根据权利要求3或4所述的真实性评价方法，其特征在于，采用UHPLC-Q-Orbitrap对所述蜂蜜样本进行检测时，质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速45 arb；辅助气的流速10 arb；挡锥气的流速0 arb； 电喷雾电压3.5 kV；离子导管的温度320 ℃；S-lens RF level设为 60；离子源的温度350 ℃；采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2，扫描范围包含454.17077 Da，碰撞能量为35eV。
8.根据权利要求3或5所述的真实性评价方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对所述蜂蜜样本进行检测时，液相色谱条件如下：采用C18色谱柱，柱温为25 ℃，以0.1%的甲酸水为流动相A，0.1%的甲酸乙腈为流动相B；采用梯度洗脱程序分离：0-0.8 min，5%的流动相B；0.8-1.2 min，5-40%的流动相B；1.2-2.5 min，40-90%的流动相B；2.5-3.5 min，90%的流动相B；3.5-3.6 min，90-5%的流动相B；3.6-6.0 min，5%的流动相B。
9.根据权利要求3或5所述的真实性评价方法，其特征在于，采用LC-MS/MS对所述蜂蜜样本进行检测时，质谱条件如下：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；离子喷雾电压：3500 V；雾化气压力：45 psi；干燥气温度：300℃；干燥气流速：5 L/min；鞘气温度：250 ℃；鞘气流速：11 L/min；采集的模式为正离子模式下的MRM模式，MRM参数如下：454.2>146.0，22 eV，454.2>85.0，33 eV。
10.根据权利要求2或3所述的真实性评价方法，其特征在于，在所述检测前，还包括利用甲醇水对所述蜂蜜样本进行提取的步骤；所述蜂蜜样本与所述甲醇水的质量体积比1：（9~11），在所述甲醇水中，甲醇与水的体积比为2：（7~9）。
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