CN107462656A - 一种快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法 - Google Patents

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Abstract

一种快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法，以液质联用技术为基础，进行等度洗脱，以液相色谱串联二级质谱，在正离子扫描下以Full MS/dd‑MS2模式或MRM模式进行分析，能快速提取并准确定性定量分析石蒜科植物中的生物碱类物质加兰他敏，大幅缩短分析时间，提高分析准确度，可在3.0min以内的程序时间内得到检测结果，加兰他敏的保留时间在1min以内，回收率为95.7～97.1％，相对标准偏差为1.3～2.7％，无其他特征峰干扰，分离度为完全分离，大大提高了分析速度和准确性，为研究石蒜科植物中加兰他敏的积累规律和合成代谢调控提供了有效且准确的分析方法。

Description

一种快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法
技术领域
本发明属于生物碱类物质检测领域，具体涉及一种快速检测石蒜中加兰他敏含量的方法。
背景技术
石蒜(Lycoris spp.)和朱顶红(Hippestrum spp.)是石蒜科(Amaryllidaceae)球根草本植物，很多种是中国特有的观赏和药用花卉，富含多种石蒜科植物特有的生物碱成分。
迄今为止，从石蒜科植物中分离出超过500种结构各异的生物碱类化合物，植物化学研究表明，这类化合物具有多种药理学功能，药用价值极高。其中，加兰他敏是一种异喹啉生物碱，作为乙酰胆碱酯酶抑制剂，可影响大脑尼古丁受体以及抑制乙酰胆碱酯酶活性，是治疗阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，老年痴呆症早期症状)的首选药物之一，该药已在欧美和中国主要市场批准上市(袁菊红，2007；孙长生等，2011)。
尽管早在1962年Barton等研究者就首次人工合成了加兰他敏，但由于其中手性碳的存在，合成条件严苛、步骤复杂、产率低、消旋产物不易拆分等因素的存在，化学合成的制备成本甚至高于从植物中直接提取。至今，野生的石蒜资源仍然是药用加兰他敏最重要的来源，因此，对石蒜中加兰他敏的含量进行准确定性和定量分析是育种和生物碱类物质合成代谢研究的重要内容之一。
目前，对石蒜中加兰他敏含量进行分析的方法主要有薄层色谱分离技术(thinlayer chromatography，TLC)、高效液相色谱检测技术(high-performance liquidchromatography)、气相色谱-质谱联用分析技术(Gas Chromatography-MassSpectrometry)和高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析技术(HPLC-electrosprayionization-mass spectrometry,HPLC-ESI-MS)。
李明凯(石蒜生物碱分析方法的建立及其生物合成的研究，安徽农业大学，2012：1-69)利用薄层色谱分离技术，实现了加兰他敏等生物碱类物质的初步分离，并且发现双向薄层色谱比单向色谱更适合多种不同生物碱类物质的分离，该方法主要通过与已知的生物碱标样(加兰他敏、力可拉敏、石蒜碱)的迁移率进行对比，实现对样品中生物碱种类的初步定性，但不能用于准确的结构和定量分析。
Quan等(Quan et al.,Photosynthetic characteristics of Lycoris aureaand monthly dynamics of alkaloid contents in its bulbs，African Journal ofBiotechnology，11(15)：3686-3691，2012)利用高效液相色谱检测技术，通过样品与已知的生物碱标准品在同样条件下的保留时间和峰面积的对比，进行了石蒜属忽地笑中石蒜碱和加兰他敏的定量研究，其单次提取石蒜鳞茎材料需要鲜样20g(含水量90％左右)，折合石蒜鳞茎干样2g，需要消耗甲醇110ml，盐酸10ml，氯仿15ml，对植物样本和试剂消耗极大，同时，其仅采用HPLC的方法，根据物质的保留时间进行含量检测，无法对待测物质进行准确定性，因此物质定量结果不可靠，不能进行结构、定性和精确定量分析。
现有的GC-MS，HPLC-ESI-MS等技术，可以实现目标代谢产物的定性和定量分析，至今已经在许多模式生物如水稻(Oryza sativa)(Li et al.,2014)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)和菊花(Chrysanthemum spp.)中得到了较好应用，而且此类技术无物种的限制性，为石蒜等非模式生物的重要次生代谢产物检测提供了重要参考。
Sahar等(Sahar et al.,4’-O-Methylnorbelladine feeding enhancesgalanthamine and lycorine production by Leucojum aestivum L.shoot cultures，Engineering in Life Sciences，00：1-6，2015)采用HPLC-ESI-MS的方法，对夏雪片莲芽中的加兰他敏和石蒜碱进行定量分析，采用梯度洗脱，梯度洗脱前期和后期都需要很长的分析时间，检测程序时长为36min，加兰他敏的洗脱时间为33min，HPLC分析时间相对较长，大约需要36分钟，其根据保留时间和母离子信息进行含量检测，此方法较Quan等的方法，准确性有所提升，但明显的缺陷在于，相同洗脱时间和母离子大小的物质成分可能有很多种，因此在定性定量准确性上仍有缺陷。
并且，现有技术中，还存在提取时间长，操作繁琐的问题，如Quan等的方法中，主要提取步骤为烘干、过滤、甲醇提取3h、过滤、蒸发、调PH值、氯仿提取3次、蒸发、甲醇复溶、过滤。Sahar等(Sahar et al.,2015)的方法中，主要提取步骤为：甲醇提取24h、浓缩、硫酸酸化、氯仿抽提、蒸发、复溶、过滤，都为加兰他敏的快速定量分析带来不便。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法，能够对石蒜科植物中的生物碱类物质加兰他敏进行快速提取并定性定量分析，大幅度缩短分析时间，可在3分钟之内完成检测程序，加兰他敏保留时间在1分钟以内，快速得到检测结果，通过二级质谱提供的加兰他敏母离子和子离子信息监测，能提高定性及定量分析的准确性，加兰他敏的回收率为95.7～97.1％，相对标准偏差(RSD)为1.3％～2.7％，分离度为完全分离。实现加兰他敏的快速洗脱分离，检测加兰他敏的多个母离子/子离子对信息，确保定性和定量的准确性。
为了达到上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法，包括如下步骤：
1)配制待测样品液
称取待测样品，冷冻干燥后研磨成粉，以乙醇、甲醇等有机溶剂作为提取剂，进行至少两次超声提取、混匀、离心，合并上清，浓缩，再复溶，稀释至浓度0.5～100ng/ml，得待测样品溶液；
2)检测
利用液相色谱-串联二级质谱对待测样品溶液进行检测，获得样品中加兰他敏的峰面积数据；
其中，色谱条件：
液相色谱柱：硅胶型反相色谱柱；
柱温：40～50℃；
进样量：5～10μL；
流速：0.4～1.0ml/min；
流动相：流动相A：甲酸-水溶液，流动相B：乙腈或甲醇；
洗脱方法：等度洗脱，洗脱时间≤3.0min，流动相A和流动相B的体积比为10～50：50～90；
质谱条件及扫描方式：
离子源：加热电喷雾离子源或电喷雾离子源；
离子源喷雾电压：2500～4500V；
扫描方式：正离子扫描下以一级质谱全扫描-数据依赖子离子扫描(Full MS/dd-MS2)或质谱多反应检测(MRM)模式进行分析；
监测离子对：母离子m/z 288±1和至少一个加兰他敏的子离子；
加兰他敏保留时间：≤1min；
3)含量计算
根据步骤2)的峰面积数据和加兰他敏的标准曲线获得待测样品溶液中加兰他敏的浓度，再结合步骤1)中复溶溶剂体积以及待测样品干重，计算样品中加兰他敏的含量。
进一步，步骤3)中所述加兰他敏的标准曲线是通过以下方法获得的：取加兰他敏标准品，配制成浓度在0.5ng/ml～100ng/ml的系列标准溶液，利用液相色谱-串联二级质谱对加兰他敏标准溶液进行测定，利用测得的峰面积数据和加兰他敏标准溶液浓度绘制标准曲线，得到线性方程
优选地，步骤3)中所述测定加兰他敏标准溶液的色谱条件及质谱条件与步骤2)相同。
优选地，步骤2)中所述流动相A的甲酸-水溶液中，甲酸的含量0.1～1％，v/v。
优选地，步骤2)中所述二级质谱监测加兰他敏子离子的质荷比范围为57～288Da。
进一步，步骤2)中所述加兰他敏的子离子选自质荷比m/z为231±1Da、213±1Da和198±1Da中的至少一种
优选地，步骤2)中所述的洗脱时间为3.0min，加兰他敏的保留时间为0.77～0.99min。
进一步，步骤2)中所述复溶溶剂为甲醇，提取剂为甲醇或乙醇，待测样品鲜重与提取剂的质量体积比为1：2-5。
优选地，步骤2)中所述柱温为40℃，进样量为5μL，流速为0.4ml/min，离子源为加热电喷雾离子源，扫描方式为正离子Full MS/dd-MS2，离子源喷雾电压2500V。
优选地，步骤2)中超声提取时间为28min。
本发明以高效液相色谱-加热电喷雾离子源-二级质谱(HPLC-HESI-MS/MS)技术为基础，进行等度洗脱，将分析时间由现有技术高效液相色谱-电喷雾离子源-一级质谱(HPLC-ESI-MS)方法的36分钟缩短至3分钟以内，且串联了二级质谱，分析了加兰他敏子离子的信息，经方法学确认，取得了很好的提取和分析效果，大大提高了分析速度和准确性，为研究石蒜属加兰他敏的积累规律和合成代谢调控提供了一种有效且准确的分析方法。
本发明在处理待测样品时，选用的提取液较为安全，既能保证分析效果同时也可以提高操作的安全性。同时，进行提取时，消耗的植物样本和试剂量少，待测样品鲜重与提取剂的质量体积比为1：2-5。在保证提取效果的前提下，极大节约了植物材料和提取试剂。并且，本发明采取快速简化的提取方法，经过2次以上超声波辅助提取15-40min，离心，蒸发，复溶，过滤，经计算，回收率达95％以上，提取过程快速简单，回收率高。
梯度洗脱适用于多种复杂成分的物质分离，梯度洗脱前期和后期都需要很长的分析时间，而本发明在检测待测样品时，检测目标仅为加兰他敏一种物质，在一定的保留时间范围内，没有其他特征离子对的干扰，因此，采用等度洗脱方式，缩短检测程序时间，检测程序时间≤3min，加兰他敏的洗脱时间≤1min，优选0.77-0.99min，提高了检测速度。
本发明在检测时，液相色谱串联了二级质谱，通过物质的保留时间，母离子，子离子的三级信息整合，特别是二级质谱中多组母离子/子离子对的信息监测，能确保定性和定量的准确性。
本发明优选的方案中，采用加热电喷雾离子源(HESI)，待测物在正离子扫描下以Full MS/dd-MS2模式进行分析，在正离子模式下进行扫描，母离子[M+H]+m/z 288的响应值最高，再选择相对丰度较高两个子离子m/z231和m/z213为监测离子，可以大大提高灵敏度。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
利用本发明的检测方法，在利用液相色谱分离样品时，采用等度洗脱，洗脱过程中流动相的组成不变，检测目标物质为加兰他敏，在一定的保留时间范围内，目标单一，没有其他特征离子的干扰，能够大幅度缩短分析时间，将分析时间缩短至3min以内，实现加兰他敏的完全分离。
本发明的液相色谱串联了二级质谱，通过二级质谱条件下对多组母离子-子离子对的信息监测，提高了加兰他敏定性和定量的准确性，所建立的提取分析方法准确可靠，加兰他敏的回收率为95.7～97.1％，相对标准偏差(RSD)为1.3～2.7％。
附图说明
图1为本发明实施例1中加兰他敏标准曲线。
图2为本发明实施例1中的加兰他敏色谱图。
图3为本发明实施例1中加兰他敏的MS2质谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1一种快速检测石蒜中加兰他敏含量的方法，包括如下步骤：
1)绘制标准曲线
用分析天平精密称取适量加兰他敏标准品0.010g(Gal，Galanthamine，C17H21NO3，分子量287.359)，用甲醇溶解并定容到100ml，得到其标准储备液，储备液浓度均为100μg/mL；
标准中间液：准确移取1mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用甲醇定容配成1.0μg/mL的混合标准中间液；
标准工作液：根据需要移取适量混合标准中间液，分别用甲醇稀释成浓度2ng/mL、6ng/mL、20ng/mL、60ng/mL和100ng/mL的标准工作溶液。
利用串联了二级质谱仪的色谱仪对加兰他敏标准溶液进行测定，利用测得的峰面积数据和加兰他敏标准溶液浓度绘制标准曲线，得到线性方程，参见图1。
结果表明加兰他敏在2ng/ml-100ng/ml的范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性关系方程为Y＝6.449e6X+6.584e6，相关系数R2＝0.9992，检出限及定量范围如表1所示：
表1
以实际检测时的S/N＝3确定方法的检出限为0.2ng/g，仪器的检出限为0.1ng/ml。
2)处理待测样品
以石蒜的鳞茎为待测样品1g(含水量90％左右)，冷冻干燥后，研磨成粉，得石蒜鳞茎干样0.1g，混匀后取石蒜鳞茎干样0.1g于EP管中加入2mL 70％乙醇，超声提取28min，12000rpm离心10min，取上清，滤渣加入1.5mL 70％乙醇再次超声提取28min，涡旋1min，12000rpm离心10min，取上清，合并两次上清，氮吹浓缩至近干，1mL甲醇复溶，稀释D倍(本实例中为1000倍)至浓度0.5～100ng/ml，过0.22μm滤膜。
3)色谱检测
利用超高效液相色谱-热电喷雾离子源-二级质谱联用分析技术(UHPLC-HESI-MS/MS)，对待测样品进行检测，获得样品中加兰他敏的峰面积数据；
其中，色谱条件：
液相色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus(4.6×100mm，3.5μm)；
柱温：40度；
进样量：5μL；
流速为0.4ml/min；
流动相：流动相A：甲酸体积分数为0.1％的甲酸-水溶液，流动相B：乙腈；
洗脱条件：等度洗脱，洗脱程序为0～3.0min，10％A+90％B；
色谱图参见图2，由图2可见，在上述条件下，加兰他敏洗脱时间为0.77min，且在程序分析时间内，无其他特征峰干扰，可实现完全分离。
质谱条件：
质谱采用的是Thermo ScientificTM Q ExactiveTM质谱检测系统，配有电喷雾(ESI)离子源和Xcalibur工作站。
离子源：加热电喷雾离子源(HESI)；
扫描方式：正离子扫描下以Full MS/dd-MS2模式进行分析；
一级质谱分辨率为70000，二级为35000；
离子源喷雾电压2500V；
毛细管温度350℃；
气体：氮气；鞘气流量：10；辅助气流量：2；
吹扫气流速：0；
S-透镜水平：55；
加热器温度40℃，气帘气30；雾化气温度550℃；
监测离子对：288.2/231.1和288.2/213.1，参见表2；
保留时间为0.77min；
表2目标化合物离子信息
质谱图参见图3，由图3可见，母离子[M+H]+m/z 288的响应值最高，相对丰度较高的两个子离子m/z231和m/z213为监测子离子。
4)含量计算
将待测样品的质谱峰面积数据代入步骤1)所得到的线性方程中，获得待测样品溶液中加兰他敏的浓度C(单位为ng/ml)，再根据步骤2)中复溶的甲醇体积1ml，稀释倍数D，以及样品质量0.1g，带入含量计算公式I，计算样品中加兰他敏的含量m(单位为ng/g干重)。
含量计算公式I为：m＝(C×V×D)/M。
其中，m＝样品中加兰他敏含量，单位为ng/g干重；C＝待测溶液中加兰他敏浓度，单位ng/ml；V＝复溶的甲醇体积，单位为ml；D＝稀释倍数；M＝样品质量，干重，单位为g。
本实施例中测定某份石蒜鳞茎样本，C＝15.146ng/ml，V＝1ml，D＝1000，M＝0.1035g，根据公式计算最后得出：m＝146338ng/g干重。
待测样品冷冻干燥后研磨成粉的重量为干重。
进一步，利用石蒜的鳞茎样品进行加标回收实验，在4μg/ml添加水平下进行加标回收率测定，按照步骤2-3)的方法进行，每个水平重复3次，结果测定到石蒜鳞茎样品中加兰他敏的含量在146338～153117ng/g(即0.146～0.153mg/g)干重之间，回收率为95.7％，RSD为2.7％，表明所建立的提取分析方法准确可靠。
实施例2一种快速检测朱顶红中加兰他敏含量的方法，包括如下步骤
1)绘制标准曲线
用分析天平精密称取适量加兰他敏标准品0.010g(Gal，Galanthamine，C17H21NO3，分子量287.359)，用甲醇溶解并定容到100ml，得到其标准储备液，储备液浓度均为100μg/mL；标准中间液：准确移取1mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用甲醇定容配成1.0μg/mL的混合标准中间液；标准工作液：根据需要移取适量混合标准中间液，分别用甲醇稀释成浓度0.5ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的标准工作溶液。
利用串联了二级质谱仪的色谱仪对加兰他敏标准溶液进行测定，利用测得的峰面积数据和加兰他敏标准溶液浓度绘制标准曲线。
结果表明加兰他敏在0.5ng/ml-100ng/ml的范围内其质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，线性关系方程为Y＝7.9e6X+8.7e3，相关系数R2＝0.9999，检出限及定量范围如表3所示：
表3
以实际检测时的S/N＝3确定方法的检出限为0.2ng/g，仪器的检出限为0.1ng/ml。
2)处理待测样品
以石蒜科植物朱顶红的叶片为待测样品，待测样品冷冻干燥后，研磨成粉，混匀后取0.10g于EP管中加入2mL 70％乙醇，超声提取28min，12000rpm离心10min，取上清，滤渣加入1.5mL 70％乙醇再次超声提取28min，涡旋1min，12000rpm离心10min，取上清，合并两次上清，氮吹浓缩至近干，1mL甲醇复溶，稀释D倍(本实例中为1000倍)至浓度0.5～100ng/ml，过0.22μm滤膜，得待测样品溶液。
3)色谱检测
利用串联了二级质谱仪的液相色谱对待测样品进行检测，获得样品中加兰他敏的峰面积数据；
其中，色谱条件：
液相色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18(150×2.1mm，1.7um)；
柱温：50℃；
进样量：10μL；
流速为1.0ml/min；
流动相：流动相A：甲酸体积分数为0.1％的甲酸-水溶液，流动相B：甲醇；
洗脱条件：等度洗脱，洗脱程序为0～3.0min，50％A+50％B；
在上述条件下，加兰他敏洗脱时间为0.99min，且在程序分析时间内，无其他特征峰干扰，可实现完全分离。
质谱条件：
质谱系统采用的是美国AB Sciex公司的Qtrap 6500质谱检测系统，配有电喷雾(ESI)离子源和Analyst 1.6.2工作站。
离子源：电喷雾离子源(ESI)；
扫描方式：正离子扫描下以多反应检测(MRM)模式进行分析；
离子源喷雾电压4500V；
温度：550℃；
气帘气30；
离子源Gas1：55；Gas2：55；
监测离子对：288.1/231.1和288.1/213.0，参见表4；
保留时间为0.99min；
表4
4)含量计算
将待测样品的质谱峰面积数据代入步骤1)所得到的线性方程中，获得待测溶液中加兰他敏的浓度C(单位为ng/ml)，再根据步骤2)中复溶的甲醇体积1ml，稀释倍数D，以及样品质量0.1g，带入含量计算公式I，计算样品中加兰他敏的含量m(单位为ng/g干重)。
含量计算公式I为：m＝(C×V×D)/M。
其中，m＝样品中加兰他敏含量，单位为ng/g干重；C＝待测溶液中加兰他敏浓度，单位ng/ml；V＝复溶的甲醇体积，单位为ml；D＝稀释倍数；M＝样品质量，干重，单位为g。
本实施例中测定某份朱顶红叶片样本，C＝24.487ng/ml，V＝1ml，D＝1000，M＝0.1020g，根据公式计算最后得出：m＝240068ng/g干重。
进一步，利用朱顶红的叶片样品进行加标回收实验，在4μg/ml添加水平下进行加标回收率测定，按照步骤2-3)的方法进行，每个水平重复3次，结果测定到加兰他敏的含量在239962～241285ng/g(即0.239～0.241mg/g)干重之间，回收率为97.1％，RSD为1.3％，表明所建立的提取分析方法准确可靠。

Claims (10)

1.一种快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法，包括如下步骤：
1)配制待测样品液
称取待测样品，冷冻干燥后研磨成粉，以醇类有机溶剂作为提取剂，进行至少两次超声提取、混匀、离心，合并上清，浓缩，再复溶，稀释至浓度0.5～100ng/ml，得待测样品溶液；
2)检测
利用液相色谱-串联二级质谱对待测样品溶液进行检测，获得样品中加兰他敏的峰面积数据；
其中，色谱条件：
液相色谱柱：硅胶型反相色谱柱；
柱温：40～50℃；
进样量：5～10μL；
流速：0.4～1.0ml/min；
流动相：流动相A：甲酸-水溶液，流动相B：乙腈或甲醇；
洗脱方法：等度洗脱，洗脱时间≤3.0min，流动相A和流动相B的体积比为10～50：50～90；
质谱条件及扫描方式：
离子源：加热电喷雾离子源或电喷雾离子源；
离子源喷雾电压：2500～4500V；
扫描方式：正离子扫描下以一级质谱全扫描-数据依赖子离子扫描模式或多反应检测模式进行分析；
监测离子对：母离子m/z 288±1Da和至少一个加兰他敏的子离子；
加兰他敏保留时间：≤1min；
3)含量计算
根据步骤2)的峰面积数据和加兰他敏的标准曲线获得待测样品溶液中加兰他敏的浓度，再结合步骤1)中复溶溶剂体积以及待测样品干重，计算样品中加兰他敏的含量。
2.根据权利要求1所述快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法，步骤3)中所述加兰他敏的标准曲线是通过以下方法获得的：取加兰他敏标准品，配制成浓度在0.5ng/ml～100ng/ml的系列标准溶液，利用液相色谱-串联二级质谱对加兰他敏标准溶液进行测定，利用测得的峰面积数据和加兰他敏标准溶液浓度绘制标准曲线，得到线性方程。
3.根据权利要求2所述快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤3)中所述测定加兰他敏标准溶液的色谱条件及质谱条件与步骤2)相同。
4.根据权利要求1所述快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤3)中所述流动相A的甲酸-水溶液中，甲酸的含量0.1～1％，v/v。
5.根据权利要求1所述快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤2)中二级质谱监测加兰他敏子离子的质荷比m/z范围为57～288Da。
6.根据权利要求1或5所述快速检测石蒜科植物中加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤2)中所述加兰他敏的子离子选自质荷比m/z为231±1Da、213±1Da和198±1Da中的至少一种。
7.根据权利要求1所述快速检测加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤3)中所述的洗脱时间为3.0min，加兰他敏的保留时间为0.77～0.99min。
8.根据权利要求1-7任一项所述快速检测加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤2)中所述复溶溶剂为甲醇，提取剂为甲醇或乙醇，待测样品鲜重与提取剂的质量体积比为1：2-5，g/ml。
9.根据权利要求1-7任一项所述快速检测加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤2)中所述柱温为40℃，进样量为5μL，流速为0.4ml/min，离子源为加热电喷雾离子源，扫描方式为正离子Full MS/dd-MS2，离子源喷雾电压2500V。
10.根据权利要求1-7任一项所述快速检测加兰他敏含量的方法，其特征在于，步骤2)中超声提取时间为15-40min。
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