CN109406680A - 超高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种超高效液相色谱‑串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，采用以下步骤：前处理；标准溶液的配制；获得液相色谱质谱图、回归方程；超高效液相色谱‑串联质谱法对样品进行分析检测。本研究采用超高效液相色谱‑电喷雾串联质谱法完成豆芽中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、洛美沙星10种喹诺酮物质的分析测定。对样品提取条件、净化手段、液相色谱‑质谱参数等条件进行了优化，对方法的基质效应进行了评价。结果表明，方法的建立，解决了豆芽中多种喹诺酮类抗生素同时测定的难题，为风险评估和政府监管提供技术参考。

Description

超高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生 素的方法

技术领域

本发明属于涉及一种超高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生素的方法，属于食品检测技术领域。

背景技术

豆芽是我国一种传统的蔬菜，富含蛋白质、B族维生素和微量元素。因其营养丰富、易于烹调，深受老百姓的喜爱。自2010年以来，关于“毒豆芽”的报道层出不穷，一些不良商贩将恩诺沙星等喹诺酮类药物添加到豆芽的生产过程中，以达到抑菌杀菌的目的。长期食用这种豆芽，会对人体造成一定的危害，产生耐药性或一些毒副作用。我国国家农业部公告第235号，明确规定了动物性食品中喹诺酮类抗生素(以环丙沙星和恩诺沙星之和计)最高残留限量不得超过100μg/kg，但对蔬菜中喹诺酮的使用并无特殊规定。据文献报道，豆芽中恩诺沙星的检出率高达37％。因此有必要建立一套豆芽中恩诺沙星等喹诺酮类抗生素的检测方法。

近年来，对喹诺酮类抗生素残留的分析研究，大多局限在动物性食品领域，而对蔬菜，尤其是豆芽基质中的残留分析研究较少，且研究对象仅限于恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星等一种或少数几种化合物，方法具有一定局限性。

目前报道的食品中喹诺酮类物质的检测方法多为液相色谱法和高效液相色谱-串联质谱法。由于高效液相色谱-串联质谱法具有选择性强、灵敏度高及检测通量大等优点，在非法添加及痕量物质残留检测方面，优势明显。

发明内容

本研究采用超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法完成豆芽中恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、洛美沙星10种喹诺酮物质的分析测定。对样品提取条件、净化手段、液相色谱-质谱参数等条件进行了优化，对方法的基质效应进行了评价。结果表明，方法的建立，解决了豆芽中多种喹诺酮类抗生素的同时测定的难题，为风险评估和政府监管提供技术参考。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种超高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生素的方法，采用以下步骤：

(1)前处理：

取均质样品，加入乙腈-0.1％甲酸水溶液，涡旋混匀，超声提取，离心，取上清液，注入PRIME HLB固相萃取柱中，溶液通过固相萃取柱，收集样品净化液，45℃氮吹浓缩近干，初始流动相复溶，滤膜过滤，供UPLC-MS/MS检测；

(2)标准溶液的配制：分别准确称取10种标准喹诺酮标准物质于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制质量浓度为1.00mg/mL的标准储备液，于-20℃避光保存；分别移取各标准物质储备液1.00mL于25mL容量瓶，用甲醇稀释，配制浓度为40μg/mL的混合标准中间液。移取适量混合标准中间液，用流动相逐级稀释，配制浓度为100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL的混合标准工作液，现用现配；10种标准喹诺酮标准物质为恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、洛美沙星；

(3)获得液相色谱质谱图、回归方程：取不含喹诺酮类抗生素的空白样品，分别加入10种喹诺酮混合标准工作液，按与样品相同的处理方法，制备不同浓度的基质加标样品溶液，得到标准谱图；以基质标准溶液中各分析物的色谱峰面积为纵坐标，各分析物质的浓度值为横坐标作图，形成基质加标曲线，得到线性回归方程；

(4)样品分析：超高效液相色谱-串联质谱法对样品进行分析检测。

上述方法中，前处理的步骤为：

(1)提取：取样品适量，均质，于-20℃保存，准确称取均质后的试样2.0g(精确至0.01g)于50mL具塞离心管中，加入10mL乙腈-0.1％甲酸水(8+2，v+v)溶液，涡旋混匀30s后，超声提取15min，于8000r/min离心5min，取上清液5mL，待净化；

(2)净化：将上述上清液，注入PRIME HLB固相萃取柱中，调节流速1滴/秒，使样品溶液慢慢通过固相萃取柱，收集样品净化液于15mL离心管中，45℃氮吹浓缩近干，用1mL乙腈-0.1％甲酸水(10+90，v+v)复溶，经0.22μm滤膜过滤，供UPLC-MS/MS检测。

上述方法中，所述超高效液相色谱的条件为：

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18，柱长75mm，柱内径2.1mm，填料粒径1.7μm；所述超高效液相色谱的流动相A为0.1％甲酸水溶液，流动相B为乙腈。流速0.30mL/min，梯度洗脱程序：0～3min，10％B～20％B；3.0～5.0min，20％～35％B；5.0～6.0min，35％～50％B；6.0～6.1min，50％～95％B；保持2min；8.0～8.1min，95％～10％B；8.1～10min，10％B；超高效液相色谱的柱温：35℃，进样体积：3μL。

质谱条件为：电喷雾离子源，正离子模式；扫描模式：多反应监测；喷雾电压：5.0Kv；脱溶剂气温度：500℃；气帘气压力：35psi；雾化气压力：50psi；辅助雾化气：40psi；碰撞气压力：8psi。

国内公开的技术中仅仅能检测最多四种喹诺酮类的抗生素，而且喹诺酮类的抗生素性质相似，基质效应较强，很难实现精准定性定量。本方法建立了同时检测豆芽中10种喹诺酮抗生素残留的方法，通过优化提取溶剂，有效提高了提取效率；采用PRIME HLB固相萃取柱净化，减少了杂质的干扰；采用基质匹配标准溶液定量很好地消除了基质影响，提高了检测灵敏度。最终实现了快速、精准定性定量检测。为更有效地监控市场违法添加喹诺酮类抗生素的行为，提供了技术支持，保障了人民食品安全。

有益效果

本发明较现有技术，大大的缩短了分析时间，提高了检测效率；准确度高且稳定；本发明中除环丙沙星检出限为2μg/kg，其它9中喹诺酮类抗生素的检出限均为1μg/kg，检出限远低于现有文献报道水平，线性范围宽，提高了分析灵敏度，建立的豆芽中10种喹诺酮类抗生素中液质联用的分析方法，填补了国内豆芽中检测10种喹诺酮类抗生素质谱定性定量法的空白，对国内的探索研究具有重要意义。

附图说明

图1 4种提取剂对10种喹诺酮类抗生素回收率的影响；

图2豆芽基质中10种喹诺酮类抗生素的MRM谱图(20μg/kg)。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

1实验部分

1.1仪器、试剂及材料

AB Sciex 5500串联质谱仪(美国AB Sciex公司)；AQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪(美国waters公司)；MilliQ去离子水发生器(美国Millipore公司)、N-EVAP48氮吹仪(美国Orangaomation公司)、IKA MS3涡旋混合器；0.22μm有机相针式滤器(中国ANPEL公司)。

乙腈(美国Merck公司)；甲酸(美国Fisher Scientific公司)；PRIME HLB净化柱(100mg,6mL,美国waters公司)；恩诺沙星(CAS NO.93106-60-6)、环丙沙星(CAS NO.85721-33-1)、诺氟沙星(CAS NO.70458-96-7)、培氟沙星(CAS NO.70458-92-3)、氧氟沙星(CASNO.82419-36-1)、沙拉沙星(CAS NO.98105-99-8)、达氟沙星(CAS NO.112398-08-0)、司帕沙星(110871-86-8)、氟罗沙星(CAS NO.79660-72-3)、洛美沙星(CAS NO.98079-51-7)均来自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；喹诺酮母核及10种氟喹诺酮药物的化学结构式如下：

喹诺酮类抗生素母核及10种喹诺酮类抗生素的化学结构式

Chemical structures of mother nucleus of quinolones and the tenquinolones

1.2标准溶液的配制

分别准确称取10种标准喹诺酮标准物质于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制质量浓度为1.00mg/mL的标准储备液，于-20℃避光保存；分别移取各标准物质储备液1.00mL于25mL容量瓶，用甲醇稀释，配制浓度为40μg/mL的混合标准中间液。移取适量混合标准中间液，用流动相逐级稀释，配制浓度为100ng/mL、200ng/mL、1000ng/mL的混合标准工作液，现用现配。

1.3仪器分析条件

1.3.1液相色谱条件

色谱柱：Acquity UPLC BEH C18(75mm×2.1mm，1.7μm)；柱温：35℃；流动相A:0.1％甲酸水溶液；流动相B:乙腈。梯度洗脱程序：0～3min，10％B～20％B；3.0～5.0min，20％～35％B；5.0～6.0min，35％～50％B；6.0～6.1min，50％～95％B；保持2min；8.0～8.1min，95％～10％B；8.1～10min，10％B，流速0.3mL/min。进样量：3μL。

1.3.2质谱条件

电喷雾(ESI)离子源，正离子模式；扫描模式：多反应监测(MRM)；喷雾电压：5.0Kv；脱溶剂气温度：500℃；气帘气压力：35psi；雾化气压力：50psi；辅助雾化气：40psi；碰撞气压力：8psi。10种目标物的监测离子对、去簇电压(DP)及碰撞能参数见表1。

表1 10种喹诺酮抗生素的保留时间、母离子、子离子及其它质谱参数

Table 1 Retention times(t_R),precursor ions,daughter ions and other MSparameters of the ten quinolones

*Quantitative ion.

1.4样品前处理

1.4.1提取

分别取黄豆芽、绿豆芽样品适量，均质，于-20℃保存。准确称取均质后的试样2.0g(精确至0.01g)于50mL具塞离心管中，加入10mL乙腈-0.1％甲酸水(8+2，v+v)溶液，涡旋混匀30s后，超声提取15min，于8000r/min离心5min，取上清液5mL，待净化。

1.4.2净化

将上述提取液，注入PRIME HLB固相萃取柱中，调节流速1滴/秒，使样品溶液慢慢通过固相萃取柱。收集样品净化液于15mL离心管中。45℃氮吹浓缩近干，用1mL初始流动相[乙腈-0.1％甲酸水(10+90，v+v)]复溶。经0.22μm滤膜过滤，供UPLC-MS/MS检测。

2结果与讨论

2.1质谱条件的优化

配制浓度为1.0μg/mL的喹诺酮类标准溶液，采用流动注射的方式注入质谱仪。由于喹诺酮类物质分子结构中含有叔氨基，在酸性条件正离子扫描模式下，极易形成[M+H]⁺准分子离子。以[M+H]⁺为母离子，优化去簇电压(DP)；对获得的母离子进行二级质谱扫描，得到碎片离子信息，选择相对丰度强、干扰小的离子对；通过优化碰撞能，确定最佳质谱条件，见表1。

2.2色谱条件的优化

10种目标化合物，均为喹诺酮类物质，其分子结构极其相似。采用等度洗脱较难实现理想的分离效果。实验采用BEH C18色谱柱，对目标物进行梯度洗脱。考察了乙腈-水、乙腈-0.1％甲酸水为流动相时，目标物的分离效果及色谱峰形。实验表明，采用乙腈-0.1％甲酸水流动相体系，能有效改善峰形，抑制了目标物因电离导致的拖尾现象。且酸性流动相能大大提高目标物的离子化效率，使目标物信号增强。因此，最终选择乙腈-0.1％甲酸水(v+v)溶液为流动相。

2.3前处理条件的选择

2.3.1提取剂的选择

喹诺酮类抗生素为两性化合物，在酸性和碱性溶液中均具有较好的溶解性。兼顾流动相的选择，本实验探究了四种常用提取剂：a.乙腈；b.含0.1％甲酸的乙腈；c.乙腈-水(8+2,v+v)；d.乙腈-0.1％甲酸水(8+2,v+v)。考察了四种提取剂对10种喹诺酮类抗生素的提取效率(以目标物的回收率表示,如图1)。由图1可以看出，无论黄豆芽(A图)还是绿豆芽(B图)，提取剂a的提取效率最差，可能的原因，目标物在含水量较多的豆芽基质中，以解离形式存在，以纯乙腈为提取剂，离子形式的目标物很难分散到乙腈层，从而降低了目标物在提取剂中的分配比，使目标物回收率下降。与提取剂a相比，提取剂c因增加了水的比例，使得目标物的回收率大大提高。提取剂d的提取效率明显优于提取剂b和c，尤其表现在绿豆芽基质。综合考虑，选择提取剂d为样品提取溶剂。

2.3.2净化和浓缩条件的选择

本实验最先探究了豆芽样品经10mL乙腈-0.1％甲酸水(8+2,v+v)直接提取后，进UPLC-MS/MS进行测定的方法。结果发现：黄豆芽中环丙沙星、沙拉沙星、司帕沙星、氟罗沙星的离子对存在明显干扰；环丙沙星的色谱峰形较差；环丙沙星、培氟沙星、诺氟沙星、氧氟沙星均远达不到相关食品安全国家标准中喹诺酮类抗生素的检出限要求。因此必须优化样品前处理步骤，需要增加净化或浓缩操作，以提高方法的检测灵敏度。

氮气吹干浓缩是常用的样品浓缩手段之一。取样品提取液5mL于45℃，进行氮吹浓缩至近干，用初始流动相定容至1.00mL，经UPLC-MS/MS测定。结果发现：除环丙沙星外，其它目标物的检出限都可以满足要求。但是经过浓缩，样品的基质效应明显增大。其中，司帕沙星呈现为基质抑制效应，而恩诺沙星等9种喹诺酮类抗生素则呈现明显的基质增强效应。在豆芽样品中添加不同质量浓度的混合标准溶液，以各目标物的峰面积对质量浓度绘制标准曲线，同时按相同的计算方式，绘制每种目标物的试剂标准曲线。各分析物质的基质效应以基质标准曲线与试剂标准曲线的斜率比表示。黄豆芽的基质效应为：58.4％～254％；绿豆芽基质效应为：80.7％～300.2％，基质效应过高，偏离了方法定量的要求。而且，直接氮吹浓缩方法重现性较差，达氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氟罗沙星的RSD超过10％。因此，氮气吹干浓缩的方法不宜采用。

固相萃取前处理方式，能同时实现样品的净化和浓缩。实验选取PRIME HLB柱对豆芽样品进行净化。因豆芽基质中含有大量磷脂类物质，采用PRIME HLB柱净化，能有效去除样品中磷脂类物质的干扰，降低基质效应。其次，PRIME HLB柱是直接滤过型固相萃取柱，对目标物无保留，损失较小。净化过程无需样品溶剂转换、柱活化、淋洗等步骤，大大节约实验的时间。结果表明，样品经PRIME HLB柱过净化后，基质效应明显减弱。

2.4基质效应的校正

尽管样品经固相萃取柱得到了较好地净化，但仍无法完全消除基质效应。综合考虑，本方法采用豆芽空白基质加标，按与样品相同的处理方式，制备基质匹配标准溶液，以此作为定量基准，能很好地消除了基质影响(见表2)，实现了喹诺酮类抗生素残留精准检测的要求。

表2基质效应消除前后10种喹诺酮抗生素的回收率

Table 2 Recoveries of 10QNs before and after matrix effectelimination

2.5方法的线性范围和检出限

实验采用基质加标工作曲线外标法定量。称取一定量的空白基质，加入一定体积的混合标准工作液，按上述方法进行提取、净化、浓缩、测定，得到基质加标工作曲线。实验表明，在1.0～250ng/mL浓度范围内，10种喹诺酮抗生素的线性方程相关系数(r²)均大0.997。按照本方法对该样品进行前处理并测定，以色谱峰的信噪比(S/N)≥3对应的加标浓度为方法的检出限(LOD)，以S/N≥10对应的加标浓度为方法的定量下限(LOQ)，结果见表3。方法的LOD为1.0μg/kg和2.0μg/kg，LOQ为3.0μg/kg和6.0μg/kg。

表3 10种喹诺酮类抗生素的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量下限

Table 3 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of 10 quinolones

2.6方法的回收率和精密度

选取喹诺酮空白豆芽基质，分别添加3μg/kg、10μg/kg、200μg/kg三个浓度水平的混合标准溶液，每个水平重复测定6次，采用外标法进行定量，计算回收率和精密度。由表4可以看出，10种目标物回收率范围为78.1％～106.4％，RSD均小于8.1％，能满足喹诺酮类抗生素痕量分析的要求。豆芽基质中10种喹诺酮类抗生素的MRM谱图见图2，其中A图为黄豆芽基质中目标物的质量色谱图，B图为绿豆芽基质中目标物的质量色谱图。

2.7实际样品测定

选取山东省不同地区超市和农贸市场豆芽样本50批次，按本方法进行检测。1批次黄豆芽样品中检出恩诺沙星(300.9μg/kg)、环丙沙星(5.0μg/kg)、诺氟沙星(137.5μg/kg)。高于我国对动物性食品中喹诺酮类抗生素(以环丙沙星和恩诺沙星之和计)最高残留限量(为100μg/kg)的要求，其余样品均未检出10种喹诺酮类抗生素残留。

2.8对比试验

前处理：准确称取5g(精确至0.01g)豆芽样品置于50mL具塞离心管中，在均质器中均质30s(转速为9500r/min)，准确加人50pL混合内标标准工作液(1.0μg/mL)，涡旋混合30s，避光放置10min。加入10g灼烧过的无水硫酸钠(650℃灼烧4h)，再加人15mL酸化乙腈[V(甲酸):V(乙腈)＝1:99]，涡旋混合1min，超声波提取10min。4 000r/min离心5min，取上清液于50mL浓缩管中。残渣中加15mL酸化乙腈，重复提取1次。合并2次提取液，于50℃平衡定量浓缩仪中浓缩至干。加1.0mI甲醇溶液[V(甲醇):V(水)＝20:80]涡旋溶解残留物。再加入2.0mL正已烷涡旋混合30s，吸取下层溶液1.5mL置于2mL离心管中，以10000r/min离心5min，弃上层液，取下层清液，过0.2μm滤膜；

其他条件与上述实验相同，液相色谱-串联质谱仪测定。该方法仅能检测出2种喹诺酮类药物，分别为：氧氟沙星、恩诺沙星，其他8种不能分析测定。

3结论

本方法建立了同时检测豆芽中10种喹诺酮抗生素残留的方法。通过优化提取溶剂，有效提高了提取效率；采用PRIME HLB固相萃取柱净化，减少了杂质的干扰；采用基质匹配标准溶液定量很好地消除了基质影响，提高了检测灵敏度。最终实现了快速、精准定性定量检测。为更有效地监控市场违法添加喹诺酮类抗生素的行为，提供了技术支持，保障了人民食品安全。

表4豆芽中10种喹诺酮抗生素的回收率及相对标准偏差(n＝6)

Table 4 Recoveries and relative standard deviations(RSDs)of the10quinolones spiked in bean sprouts(n＝6)

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (5)

1.一种超高效液相色谱-串联质谱法测定豆芽中10种喹诺酮类抗生素的方法，其特征在于，采用以下步骤：

（1）前处理：

取样品均质，加入乙腈-0.1%甲酸水溶液，涡旋混匀，超声提取，离心，取上清液，注入PRIME HLB固相萃取柱中，溶液通过固相萃取柱，收集样品净化液，45℃氮吹浓缩近干，初始流动相复溶，滤膜过滤，供UPLC-MS/MS检测；

（2）标准溶液的配制：分别准确称取10种标准喹诺酮标准物质于10mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制质量浓度为1.00mg/mL的标准储备液，于-20℃避光保存；分别移取各标准物质储备液1.00mL于25mL容量瓶，用甲醇稀释，配制浓度为40μg/ mL的混合标准中间液；

移取适量混合标准中间液，用流动相逐级稀释，配制浓度为100 ng/mL、200 ng/mL 、1000 ng/mL的混合标准工作液，现用现配；10种标准喹诺酮标准物质为恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、达氟沙星、司帕沙星、氟罗沙星、洛美沙星；

（3）获得液相色谱质谱图、回归方程：取不含喹诺酮类抗生素的空白样品，分别加入10种喹诺酮混合标准工作液，按与样品相同的处理方法，制备不同浓度的基质加标样品溶液，得到标准谱图；以基质标准溶液中各分析物质量色谱图的色谱峰面积为纵坐标，各标准物质的浓度值为横坐标作图，形成基质加标曲线，得到线性回归方程；

（4）样品分析：超高效液相色谱-串联质谱法对样品进行分析检测。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，前处理的步骤为：

（1）提取：取样品适量，均质，于-20℃保存，准确称取均质后的试样2.0g（精确至0.01g）于50mL具塞离心管中，加入10mL乙腈-0.1%甲酸水（8+2，v+v）溶液，涡旋混匀30s后，超声提取15min，于8000r/min离心5min，取上清液5mL，待净化；

（2）净化：将上述上清液，注入PRIME HLB固相萃取柱中，调节流速1滴/秒，使样品溶液慢慢通过固相萃取柱，收集样品净化液于15mL离心管中，45℃氮吹浓缩近干，用1mL乙腈-0.1%甲酸水（10+90，v+v）复溶，经0.22μm滤膜过滤，供UPLC-MS/MS检测。

3.根据权利要求1-2之一所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的色谱柱为：Acquity UPLC BEH C18，柱长75mm，柱内径2.1mm，填料内径1.7μm；所述超高效液相色谱的流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱的柱温：35℃，进样体积：3μL，流速0.30 mL/min，梯度洗脱程序：0～3min，10%B～20%B；3.0～5.0min，20%～35%B；5.0～6.0min，35%～50% B；6.0～6.1min，50%～95% B；保持2min；8.0～8.1min，95%～10%B；8.1～10min，10% B。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，质谱条件为：电喷雾离子源，正离子模式；扫描模式：多反应监测；喷雾电压：5.0Kv；脱溶剂气温度：500℃；气帘气压力：35psi；雾化气压力：50psi；辅助雾化气：40psi；碰撞气压力：8psi。