CN108132319A - 一种同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱‑串联质谱法，包括样品制备步骤：取畜禽肉组织制成肉泥，获取待测样品；提取剂制备步骤：取乙腈、水和甲酸，混合均匀得提取剂；样品提取步骤：称取待测样品，加入内标工作混合液；加入提取剂均质，进行离心分离，取上层清液；样品净化步骤：用Oasis PriMe HLB固相萃取柱进行萃取，再用提取剂洗涤固相萃取柱，合并流出液；接着进行氮吹，定容后，离心分离，取上层清液，过滤，获取测试液；测试步骤：测试液进行UPLC‑MS/MS测定。该方法能在15分钟内完成94种残留药物的检测，极大提高了检验工作效率，大大降低了人力，节约试剂耗材的使用，绿色环保。

Description

一种同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质 谱法

技术领域

本发明涉及分析化学技术领域，尤其涉及一种同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法。

背景技术

畜禽在饲养的过程中，大部分都会使用到兽药，因此畜禽的体内一般会有兽药残留。而不同类别的兽药，其分子结构、 分子量、官能团不同，导致其化学性质大相径庭。所以常规检测方法大多数只能同时检验某一类或两类药物。而畜禽养殖过 程中往往是多类药物同时使用，所以在检验过程中往往是要采用多个不同的检验方法，这样既耗时又费力，检验人员的工作 量很大。例如，2017年浙江省农产品例行监测任务中，畜肉产品的药物残留检测项目为克伦特罗、沙丁胺醇、莱克多巴胺、 西马特罗、恩诺沙星(以恩诺沙星与环丙沙星之和计)、达氟沙星、氟甲喹、呋喃唑酮代谢物、呋喃它酮代谢物、呋喃西林 代谢物、呋喃妥因代谢物、多西环素(强力霉素)、土霉素、金霉素、四环素、林可霉素、红霉素、替米考星、氯霉素、甲 砜霉素、氟苯尼考、磺胺类(5种总量)、氯丙嗪、地塞米松、喹乙醇代谢物、庆大霉素、五氯酚酸钠，涉及12大类共30多 项，常规检验一般一天能做1-2个项目，因此完成一批样品需要用时2周，日常检测压力很大。

虽然目前也有了一些方法实现了多残留检测，但是相对来说，方法稳定性比较差，操作依然很繁琐，前处理的工作量依 然很大。往往采用的是用一种固定相去吸附目标化合物。而不同类别的兽药其化学性质大相径庭，导致检测结果的可靠性和 稳定性很差。

固相萃取(SPE)是目前大量且广泛应用于兽药残留检测的样品前处理技术，该技术利用目标化合物在溶液和吸附剂之间 的保留能力不同，会保留在保留作用高的吸附剂上的原理，从样品溶液中吸附目标化合物使其与溶液分离，再通过洗脱液洗 脱来分离与富集目标化合物。但是固相小柱也是有相对局限性，也只能适用于多种兽药的净化，而不能实现多类兽药的同时 净化。因此，畜禽中多兽药残留一直是业界研究的热点。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，该 方法能够在15分钟内完成94种残留药物的检测，快速、灵敏、高效、稳定，极大的提高了检验检测工作的效率，大大降低 了检验过程的人工劳力，大大节约了试剂耗材的使用，绿色环保，节能。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，包括：

样品制备步骤：取畜禽肉样品，去皮去骨后，取肉组织部分制成肉泥，获取待测样品，混匀封装后冷冻保存；

提取剂制备步骤：取乙腈、水和甲酸，混合均匀，获取提取剂；其中乙腈、水的体积比在75:25到90:10之间，甲酸的 体积为乙腈和水的体积之和的0.1-0.3％；

样品提取步骤：称取所述待测样品，置于离心管中，加入内标工作混合液；然后加入所述提取剂，摇匀，获取第一分析 液；将所述第一分析液进行离心分离，取上层清液，记为第一上层清液；

样品净化步骤：取所述第一上层清液，用Oasis PriMe HLB固相萃取柱进行杂质吸附，收集流出液，再用所述提取剂洗 涤所述固相萃取柱，合并流出液，获取第二分析液；接着，对所述第二分析液进行氮吹，定容后，离心分离，取上层清液， 记为第二上层清液，过滤，获取测试液；

测试步骤：所述测试液进行UPLC-MS/MS测定。

进一步地，在所述样品制备步骤中，所述肉组织部分采用绞肉机制成肉泥，获取待测样品，混匀后装入封口包装袋中， 在-18℃以下冷冻保存，备用。

进一步地，在所述提取剂制备步骤中，乙腈、水和甲酸的体积比为80:20:0.1。

进一步地，在所述样品提取步骤中，准确称取待测样品2.0g，置于50mL离心管中，精确加入同位素内标工作混合液 0.2mL，然后加入9.8mL所述提取剂，以12000r/min的速度匀浆2min，获取第一分析液；将所述第一分析液以10000r/min 的转速在5℃的条件下，离心10min，取上层清液，记为第一上层清液。

进一步地，在所述样品提取步骤中，所述内标工作混合液的制备方法如下：精密移取0.050mL 0.1mg/mL的内标储备液 至20mL容量瓶中，用甲醇定容，获得浓度为250ng/mL内标工作混合液。

进一步地，在所述样品净化步骤中，取2mL所述第一上层清液，置于PriMe HLB固相萃取柱上，调节流速为1-2滴/ 秒，收集流出液，再用2mL所述提取剂洗涤所述固相萃取柱，合并流出液于刻度试管中，获取第二分析液；接着，用氮气 将所述第二分析液吹至1.0mL以下，加入水定容至1.0mL，涡旋充分溶解残渣，以10000r/min的速度在5℃的条件下离心10min，取上层清液，记为第二上层清液，所述第二上层清液过0.22μm有机微孔滤膜，获取测试液。

进一步地，在所述测试步骤中，色谱的测试条件如下：正离子模式下，采用WatersACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1 mm×100mm，1.7μm)；柱温30℃，样品温度为15℃，进样体积为2μL，流速为0.35mL/min；流动相A：5mmol/L乙酸 铵水溶液和甲酸的混合液，流动相B：5mmol/L乙酸铵甲醇溶液和甲酸的混合液，梯度洗脱；

负离子模式下，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，柱温30℃，样品温度为15℃， 进样体积为2μL，流速为0.30mL/min；流动相为甲醇水溶液，其中甲醇和水的体积比为40：60，等度洗脱。

进一步地，在正离子模式下，梯度洗涤的条件如下：

流动相A中，乙酸铵水溶液与甲酸的体积比为99.9:0.1；流动相B中，乙酸铵甲醇溶液和甲酸的体积比为99.9:0.1。

进一步地，在所述测试步骤中，质谱的测试条件如下：

质谱仪：三重四级杆串联质谱仪；离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描和负离子扫描；检测方式：多反应监测；

电离电压：4500v/-3500v；离子源温度：500℃；

碰撞气流量：0.15mL/min。

进一步地，还包括校正步骤：制备空白样品，空白样品的制备与所述样品提取步骤、样品净化步骤和测试步骤一致，但 在样品提取步骤中，不需要加入所述待测样品；所述空白样品进行UPLC-MS/MS测定；

还包括定量步骤：首先制备空白基质液：取不含目标检测物的空白样品，除不加内标工作混合液外，处理过程与所述样 品提取步骤、样品净化步骤和测试步骤一致，制得空白样品基质液；

然后配置标准曲线：精密移取标准中间溶液和内标工作混合液，用空白样品基质液配置成0.2-20ng/mL的系列标准工作 混合液，接着分别进行UPLC-MS/MS测定，获取标准曲线。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

本发所提供的同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，能够在15分钟内完成94种残留药物的检测， 前处理方法和检测方法快速、灵敏、高效、稳定，极大的提高了检验检测工作的效率，大大降低了检验过程的人工劳力，大 大节约了试剂耗材的使用，绿色环保，节能。依据该方法进行测定，畜禽中10类药物的回收率大致都能达到在64.7％～108.2％ 之间，RSD在3.11～13.99％之间，均符合兽药残留检测的要求。

附图说明

图1为本发明实施例色谱分离正离子模式下磺胺类药物的提取离子流叠加图；

图2为本发明实施例色谱分离正离子模式下激动剂类药物的提取离子流叠加图；

图3为本发明实施例色谱分离正离子模式下皮质激素类药物的提取离子流叠加图；

图4为本发明实施例色谱分离正离子模式下硝基咪唑类药物的提取离子流叠加图；

图5为本发明实施例色谱分离正离子模式下雄激素类药物的提取离子流叠加图；

图6为本发明实施例色谱分离正离子模式下苯并咪唑类药物的提取离子流叠加图；

图7为本发明实施例色谱分离正离子模式下大环内酯类药物的提取离子流叠加图；

图8为本发明实施例色谱分离正离子模式下氯羟吡啶药物的提取离子流叠加图；

图9为本发明实施例色谱分离正离子模式下喹诺酮类药物的提取离子流叠加图；

图10为本发明实施例色谱分离正离子模式下氯霉素类药物的提取离子流图；

图11为本发明实施例色谱分离后10类兽药的提取离子流叠加图；

图12为本发明实施例Oasis PRiME HLB固相萃取柱对磷脂净化效果图。

具体实施方式

下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施 例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。

一种同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，包括：

样品制备步骤：取畜禽肉样品，去皮去骨后，取肉组织部分制成肉泥，获取待测样品，混匀封装后冷冻保存；

提取剂制备步骤：取乙腈、水和甲酸，混合均匀，获取提取剂；其中乙腈、水和甲酸的体积比为80:20:0.1；

样品提取步骤：称取待测样品，置于离心管中，加入内标工作混合液；然后加入提取剂，摇匀，获取第一分析液；将第 一分析液进行离心分离，取上层清液，记为第一上层清液；

样品净化步骤：取第一上层清液，用Oasis PriMe HLB固相萃取柱进行杂质吸附，收集流出液，再用提取剂洗涤固相萃 取柱，合并流出液，获取第二分析液；接着，对第二分析液进行氮吹，定容后，离心分离，取上层清液，记为第二上层清液， 过滤，获取测试液；

测试步骤：测试液进行UPLC-MS/MS测定。

作为进一步的实施方式，在样品制备步骤中，肉组织部分采用绞肉机制成肉泥，获取待测样品，混匀后装入封口包装袋 中，在-18℃以下冷冻保存，备用。

作为进一步的实施方式，在提取剂制备步骤中，乙腈、水和甲酸的体积比为80:20:0.1(即含0.1％的甲酸)。

作为进一步的实施方式，在样品提取步骤中，准确称取待测样品2.0g，置于50mL离心管中，精确加入同位素内标工作 混合液0.2mL，然后加入9.8mL提取剂，以12000r/min的速度匀浆2min，获取第一分析液；将第一分析液以10000r/min 的转速在5℃的条件下，离心10min，取上层清液，记为第一上层清液。

作为进一步的实施方式，在样品提取步骤中，内标工作混合液的制备方法如下：精密移取0.050mL 0.1mg/mL的内标储 备液至20mL容量瓶中，用甲醇定容，获得浓度为250ng/mL内标工作混合液。实际操作过程中，内标具体浓度根据实际需 要可以采用不同的浓度，如果按照实际的浓度一个一个写可能比较繁琐，这边为了方便设定相同的浓度。另外，内标的浓 度只是作为一个参考标尺，其具体数值对实验的结果不影响，只要在某一次实验过程中用的是同一个内标工作液就可以，在 实际的运算过程中，浓度一般都设置为1，一般不需用到其真实的浓度。

作为进一步的实施方式，在样品净化步骤中，取2mL第一上层清液，置于PriMe HLB固相萃取柱上，调节流速为1-2 滴/秒，收集流出液，再用2mL提取剂洗涤固相萃取柱，合并流出液于刻度试管中，获取第二分析液；接着，用氮气将第二 分析液吹至1.0mL以下，加入水定容至1.0mL，涡旋充分溶解残渣，以10000r/min的速度在5℃的条件下离心10min，取 上层清液，记为第二上层清液，第二上层清液过0.22μm有机微孔滤膜，获取测试液。

作为进一步的实施方式，在测试步骤中，色谱的测试条件如下：正离子模式下，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；柱温30℃，样品温度为15℃，进样体积为2μL，流速为0.35mL/min；流动相A为： 5mmol/L乙酸铵水溶液和甲酸的混合液，流动相B为：5mmol/L乙酸铵甲醇溶液和甲酸的混合液，梯度洗脱；

负离子模式下，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，柱温30℃，样品温度为15℃， 进样体积为2μL，流速为0.30mL/min；流动相为甲醇水溶液，其中甲醇和水的体积比为40：60，等度洗脱。

作为进一步的实施方式，在正离子模式下，梯度洗涤的条件如下：

流动相A中，乙酸铵水溶液与甲酸的体积比为99.9:0.1；流动相B中，乙酸铵甲醇溶液和甲酸的体积比为99.9:0.1。

作为进一步的实施方式，在测试步骤中，质谱的测试条件如下：

质谱仪：三重四级杆串联质谱仪；离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描和负离子扫描；检测方式：多反应监测；

电离电压：4500v/-3500v；离子源温度：500℃；

碰撞气流量：0.15mL/min。

作为进一步的实施方式，还包括校正步骤：制备空白样品，空白样品的制备与样品提取步骤、样品净化步骤和测试步骤 一致，但在样品提取步骤中，不需要加入待测样品；空白样品进行UPLC-MS/MS测定；

还包括定量步骤：首先制备空白基质液：取不含目标检测物的空白样品，除不加内标工作混合液外，处理过程与样品提 取步骤、样品净化步骤和测试步骤一致，制得空白样品基质液；

然后配置标准曲线：精密移取标准中间溶液和内标工作混合液，用空白样品基质液配置成0.2-20ng/mL的系列标准工作 混合液，接着分别进行UPLC-MS/MS测定，获取标准曲线。

本发明所提供的同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，基于不同类别兽药中化学结构和性质差异 非常大，难以实现同时萃取富集净化的前提，另辟新径从去除畜禽肉中蛋白质、脂肪、无机盐和磷脂这四类主要的干扰物入 手，从而实现目标物的提取；该提取剂配方简单，包括乙腈、水和甲酸三大物质，在提取和离心步骤中，样品中的蛋白质在 含甲酸的乙腈溶液中会发生变性，再通过高速冷冻离心沉淀进行去除，在冷冻的过程中同时去除一部分的脂肪；脂肪在乙腈 中可以部分溶解，但是在含有水的乙腈中，脂肪几乎不溶，因此也能够很有效地被除去；至于无机盐原本就不溶于有机溶剂， 在含有少量水的乙腈中溶解也很少；而在净化步骤中，Oasis PriMe HLB固相萃取柱能够进一步实现磷脂和脂肪的净化和吸附 作用。也就是说，通过提取和离心步骤，该提取剂能够去除蛋白质、脂肪、无机盐这三大类杂质；再通过净化步骤，能够进 一步去除剩下的脂肪和磷脂，从而实现蛋白质、脂肪、无机盐和磷脂这四类主要干扰物的去除，最终获取的液体则为溶解了 各种类型残留药物的待测液。

接着，待测液进行UPLC-MS/MS测定，该方法能够在15分钟内完成94种残留药物的检测，快速、灵敏、高效、稳定， 极大的提高了检验检测工作的效率，大大降低了检验过程的人工劳力，大大节约了试剂耗材的使用，绿色环保，节能。依据 该方法进行测定，畜禽中10类药物的回收率大致都能达到在64.7％～108.2％之间，RSD在3.11～13.99％之间，均符合兽药残 留检测的要求。

以下是本发明具体的实施例，在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过购买方式获得。

一、测试对象及研究的残留兽药类型

本发明实施例以肉鸡为测试对象，鸡肉组织一种很复杂的基质，主要的基质干扰是蛋白质、脂肪和磷脂等三大类物质， 如何去除这三类基质的干扰是最困扰实验检测人员的一大问题。鸡肉中残留兽药包括磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、苯并 咪唑类、硝基咪唑类、糖皮质激素类、β-受体激动剂类、氯羟吡啶、氯霉素和雄激素共10类，94种药物。

二、仪器

Acquity^TM超高效液相色谱仪和XevoTM TQ-MS质谱仪：美国Waters公司产品，配有电喷雾电离接口(ESI)及Masslynx 数据处理系统；

Milli-Q超纯水器：美国Millipore公司产品；

Agilent1260高效液相色谱仪：带DAD二极管阵列检测器和FLD荧光检测器(美国Agilent公司)；

高速冷冻离心机(Multifuge X1美国Thermo)；

超声仪(KH-500DV，昆山永创超声仪器有限公司)；

涡旋混合器(QT-1，上海琪特分析仪器有限公司)；

往复式恒温培养振荡器(WS-bcoR，Wiggeas公司)；

氮吹仪(Turbo Vap LV，Biotage公司)；

Waters固相萃取装置(美国Waters公司)；

电子天平(XPE205，瑞士公司)；

高速冷冻离心机9LYNX 6000，美国Thermo公司)。

三、试剂和标准物质

试剂：甲醇、乙腈、甲酸、乙酸、氨水、乙酸铵(色谱纯，美国Merk公司)；PriME HLB固相萃取柱；其它试剂均为分 析纯。

标准物质：磺胺类(磺胺醋酰(N-Sulfanilylacetamide,99.0％)、磺胺嘧啶(Sulfadiazine,99.0％)、磺胺噻唑(Sulfathiazloe, 99.0％)、磺胺吡啶(Sulfapyridine,99.0％)、磺胺甲基嘧啶(Sulfamerazine,99.2％)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole,99.5％)、磺胺 二甲嘧啶(Sulfadimidine,99.0％)、磺胺甲氧哒嗪(Sulfamethoxypyridazine,99.2％)、磺胺-6-甲氧嘧啶钠(sulfamonomethoxine,98.0％)、磺胺氯哒嗪(sulfachloropyridazine,99.0％)、磺胺邻二甲氧嘧啶(Sulfadoxine,98.0％)、磺胺二甲恶唑(Sulfamoxol, 98.0％)、磺胺二甲异恶唑(sulfisoxazole,98.0％)、苯甲酰磺胺(Sulfabenzamide,99.3％)、磺胺间二甲氧嘧啶(磺胺二甲氧嘧啶 Sulfadimethoxine,98.5％)、磺胺喹恶啉(Sulfaquinoxaline,99.0％)、磺胺-5-甲氧嘧啶(Sulfameter,99.0％)、磺胺氯吡嗪(磺胺氯 吡嗪水化物Sulfaclozinesodium monohydrate,99.0％))；

喹诺酮类(恩诺沙星(Enrofloxacin,98.5％)、环丙沙星(Ciprofloxacin,98.0％)、诺氟沙星(Norfloxacin,99.0％)、氧氟沙星 (Ofloxacin,99.5％)、氟甲喹(Flumequine,98.3％)、盐酸双氟沙星(Difloxacin hydrochloride,98.0％)、盐酸沙拉沙星(Sarafloxacin hydrochloride,97.0％)、司帕沙星(Sparfloxacin,98.9％)、丹诺沙星(Danofloxacin mesylate,93.5％)、氟罗沙星(Fleroxacin,98.0％)、 马波沙星(Marbofloxacin,99.0％)、伊诺沙星(Enoxacin,91.1％)、奥比沙星(Orbifloxacin,99.0％)、吡哌酸(Pipemidic acid,98.0％)、 培氟沙星(Pefloxacin,71.1％)、洛美沙星(Lomefloxacin,90.3％)、萘啶酸(Nalidixic acid,99.5％)、西诺沙星(Cinoxacin,99.5％)、 恶喹酸(Oxolinic acid,98.0％))；

苯并咪唑类(奥芬达唑(Oxfendazole,99.0％)、芬苯达唑(Fenbendazole,98.5％)、奥芬达唑砜(芬苯达唑砜Fenbendazole, 98.0％)、阿苯达唑(Albendazole,99.0％)、阿苯达唑-2-氨基砜(2-Amino-5-propylsulphonylbenzimidazole,99.0％)、阿苯达唑 亚砜(methyl(5-propylsulfinyl-3H-benzoimidazol-2-yl)aminoformate,98.5％)、阿苯达唑砜(Albendazole sulfone,98.3％)、甲苯 咪唑(Mebendazole,99.5％)、氨基甲苯咪唑(2-氨基-5-苯并咪唑Mebendazole,98.0％)、羟基甲苯咪唑(5-羟甲基苯基苯并 咪唑5-hydroxymebendazole,99.3％)、噻苯咪唑(Thiabendazol,98.3％)、5-羟基噻苯咪唑(Thiabendazole-5-Hydroxy,99.1％)、 氟苯咪唑(Thiabendazole-5-Hydroxy,98.3％)、2-氨基氟苯咪唑(2-Aminoflubendazole,99.9％)、噻苯咪唑酯(坎苯达唑 Cambendazol,98.5％)、丙氧苯咪唑(奥苯哒唑Oxibendazole,98.0％))；

大环内酯类{林可霉素(Lincomycin,98.2％)、克林霉素(Clindamycinhydrochloride,98.0％)、红霉素(Erythromycin 95.3％)、竹桃霉素(Oleandomycinphosphate,100ng/μL)、替米考星(Tilmicosin,99.0％)、泰乐霉素(Tylosin,97％)、螺旋霉素(Spiramycin,97％)、吉他霉素(Leucomycin hydrate,92.0％)、交沙霉素(Josamycin,98.0％)、罗红霉素(Roxithromycin 97％))；

氯霉素类(氯霉素(Chloramphenicol,98.5％)、甲砜霉素(Thiamphenicol,98.5％)、氟甲砜霉素(Florfenicol,99.0％))；

氯羟吡啶(Clopidol,98.5％)；

皮质激素类(泼尼松(Prednisone,99.7％)、可的松(Cortisone,97.2％)、氢化可的松(Hydrocortison)、氟米松(Flumethasone, 99.8％)、地塞米松(Dexamethasone,99.8％)、乙酸氟氢可的松(Fludrocortisone acetate,99.8％)、曲安奈德(Triamcinoloneacetonide,98.8％)、醋酸氟氢松(Fluocinolone acetonide,)氟米龙(Fluoromethalone,97.9％)、布地奈德(S-budesonide,98.9％))、 硝基唑类(甲硝唑(Metronidazole,99.8％)、二甲硝基咪唑(Dimetridazole,97.5％)、羟基二甲硝基咪唑(纯度≥99.0％)、洛硝 哒唑(Ronidazole,97.0％)、异丙硝唑(Ipronidazole,99.0％)、羟基异丙硝唑(Ipronidazole-OH,99.6％)、羟基甲硝唑 (Metronidazole-hydroxy,99.9％))；

β受体激动剂类(克伦特罗(Clenbuterol,98.2％)、莱克多巴胺(Ractopamine,97.0％)、沙丁胺醇(Salbutamol,99.0％)、 西马特罗(Cimaterol,99.8％)、特布他林(Terbutaline,99.5％)、妥布特罗(Tulobuterol,99.3％))；

雄激素(群勃龙(trenbolone98.0,％)、勃地龙(boldenone,93.6％)、诺龙(nandrolone,99.0％)、睾酮(testosterone,99.5％)、甲基 睾丸素(methyltestosterone,98.0％)、丙酸诺龙(nandrolone propionat,97.5％))；

上述标准品均购于德国Dr.Ehrenstor GmbH公司。

四、内标液和标准液的配制：

A、内标储备液的制备：

用甲醇分别将1mg磺胺甲嘧啶-d5、磺胺二甲基嘧啶-D5、地美硝唑-D3、氢化可的松-D3、甲砜霉素-D3、氟苯尼考-D3、 克林霉素-D3、红霉素-13CD2、分别溶于10mL容量瓶中，配制得浓度为100μg/mL内标储备溶液，-18℃下避光保存，有效 期1年。萘啶酸-D5、诺氟沙星-D5、培氟沙星-D5、恩诺沙星-D5、氟沙星-D3、氯霉素-D5为商品化对照品溶液，浓度为100μg/mL。

B、同位素内标工作混合液的配制：精密量取上述标准储备液各0.050mL于一个20.0mL容量瓶中，用甲醇稀释定容， 配制得浓度分别为250μg/L的混合标准工作液，-18℃下避光保存，有效期2个月。

C、标准储备液的配制：用甲醇将对照品配制成1.0mg/mL的标准储存液，所有标准储存液均需避光、-18℃下保存；

D、混合标准品工作溶液的配制：分别精密移取0.1mL 1.0mg/mL的各药物储备液至10mL容量瓶中，用甲醇定容，的 10mg/L对照品中间工作液，再精密移取1mL混合液至另一10mL容量瓶中，用甲醇定容，制成1mg/L的混合标准品工作 溶液，于4℃下保存备用。

五、色谱条件的优化

本实验分别考察了Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)、Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×50mm，1.7μm)、Shimadu Shim-pack XR-ODSⅡ色谱柱(2.0mm×75mm，2.2μm)在不同溶剂系统、梯度 洗脱等条件。发现Waters ACQUITYUPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)色谱柱的分离效果最佳，且各类化合 物的峰型都比较好。

正离子模式下，均含5mmol/L乙酸铵和0.1％甲酸的甲醇-水或乙腈-水，相比于甲醇水、乙腈-水有较好的峰型和分离度； 另外，5mmol/L乙酸铵和0.1％甲酸的甲醇-水，比5mmol/L乙酸铵和0.1％甲酸的乙腈-水分离效果好。分离效果见图1-10。 因此，正离子模式下，选定流动相A为：5mmol/L乙酸铵水溶液和甲酸的混合液，乙酸铵水溶液与甲酸的体积比为99.9:0.1 (含体积浓度为0.1％的甲酸)；流动相B为：5mmol/L乙酸铵甲醇溶液和甲酸的混合液，乙酸铵甲醇溶液和甲酸的体积比为 99.9:0.1(含体积浓度为0.1％的甲酸)，梯度洗脱。

在负离子模式下，以甲醇-水为流动相时，氯霉素类均有较好峰型峰型与离子响应强度都较好，分离效果见图11。

六、质谱参数的优化

由于电喷雾电离(ESI)是一种软电离方式，应用极为广泛，产生碎片峰基本上为化合物的特征分子离子峰和准分子离 子峰。在电喷雾质谱正离子和负离子监测模式下，分别使用各类兽药的标准溶液对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量和选择 离子等参数进行优化，选取经碰撞后所得丰度较高的两个子离子作为定量和定性离子，并确定其最佳碰撞能量的电压值。最 终所选择确定的母离子、子离子和碰撞能量等参数见表1。

表1 10类残留兽药的质谱参数

注：表格中第95-108种兽药为同位素内标物，在检测过程中作为内标参考用。

实施例1：

一种同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，包括：

样品制备步骤：取鸡肉样品，去皮去骨后，肉组织部分采用绞肉机制成肉泥，获取待测样品，混匀后装入封口包装袋中， 在-18℃以下冷冻保存，备用；

提取剂制备步骤：取乙腈、水和甲酸，混合均匀，获取提取剂；其中，水、乙和腈和甲酸的体积比为20：80：0.1；

样品提取步骤：准确称取待测样品2.0g，置于50mL离心管中，精确加入同位素内标工作混合液0.2mL，然后加入9.8 mL所述提取剂，以12000r/min的速度匀浆2min，获取第一分析液；将所述第一分析液以10000r/min的转速在5℃的条件 下，离心10min，取上层清液，记为第一上层清液；

样品净化步骤：取2mL所述第一上层清液，置于PriMe HLB固相萃取柱上，调节流速为1-2滴/秒，收集流出液，再用 2mL所述提取剂洗涤所述固相萃取柱，合并流出液于刻度试管中，获取第二分析液；接着，用氮气将所述第二分析液吹至 1.0mL以下，加入水定容至1.0mL，涡旋充分溶解残渣，以10000r/min的速度在5℃的条件下离心10min，取上层清液，记为第二上层清液，所述第二上层清液过0.22μm有机微孔滤膜，获取测试液；

测试步骤：所述测试液进行UPLC-MS/MS测定；

其中，色谱的测试条件如下：正离子模式下，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)； 柱温30℃，样品温度为15℃，进样体积为2μL，流速为0.35mL/min；流动相A：5mmol/L乙酸铵水溶液(含体积浓度为 0.1％的甲酸)；流动相B：5mmol/L乙酸铵的甲醇溶液含(含体积浓度为0.1％的甲酸)，梯度洗脱，梯度洗脱的条件见下表2；

负离子模式下，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，柱温30℃，样品温度为15℃， 进样体积为2μL，流速为0.30mL/min；流动相为甲醇水溶液，其中甲醇和水的体积比为40：60，等度洗脱。

表2正离子模式下流动相梯度洗脱条件

Time(min)	Flow(mL/min)	％A	％B
				0	0.35	98	2
0.25	0.35	98	2
				11.25	0.35	0	100
13.00	0.35	0	100
				13.10	0.35	98	2

质谱的测试条件如下：

质谱仪：三重四级杆串联质谱仪；离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描和负离子扫描；检测方式：多反应监测；

电离电压：4500v/-3500v；离子源温度：500℃；

碰撞气流量：0.15mL/min。

实施例2：

实施例2与实施例1的不同之处在于：提取剂中，水和乙腈的体积比为10:90。其它与具体实施例1相同。

实施例3：

实施例3与实施例1的不同之处在于：提取剂中，水和乙腈的体积比为30:70。其它与具体实施例1相同。

实施例4：

实施例4与实施例1的不同之处在于：提取剂中，水和乙腈的体积比为40:60。其它与具体实施例1相同。

实施例5：

实施例5与实施例1的不同之处在于：提取剂中，不含甲酸。其它与具体实施例1相同。

实施例6：

实施例6与实施例1的不同之处在于：提取剂中，甲酸的体积浓度为0.2％。其它与具体实施例1相同。

实施例7：

实施例7与实施例1的不同之处在于：提取剂中，甲酸的体积浓度为0.3％。其它与具体实施例1相同。

效果评价及性能检测

一、提取试剂及提取比例的优化

首先采用甲醇、乙腈等常用试剂进行提取，乙腈作为非离子化的溶剂对大部分的兽药都有一定的提取效果，但是纯乙腈 对于极性较大，水溶性较好的兽药提取效果不是很好，同时对于碱性化合物，其提取效果也很差。在乙腈中加入一定比例的 水和0.1％的甲酸后，提取的效果显著改善。为了进一步优化比例，分别配制90％、80％、70％、60％含0.1％甲酸的乙腈水溶液 作为提取试剂，考察不同比例的溶液，对各种兽药的提取效率，结果见下表3。

表3实施例1-4提取剂中乙腈和水的比例测试结果记录表

从表3的记录可得，实施例2使用90％乙腈水来提取的10类94种兽药中脂溶性兽药(皮质激素类和大环内酯类)的回 收率是比较高的，水溶性的相对较差回收率不稳定；实施例1使用80％乙腈水来提取，脂溶性兽药的回收率略低于90％乙腈 水，但水溶性的兽药的回收率有很大的提高(如β-受体激动剂)，并且回收率稳定；实施例3使用70％乙腈水提取时激动剂 兽药部分回收率较高，其余普遍低于80％；实施例4使用60％乙腈水提取，结果更差，由于水分含量提高，氮吹浓缩时间较 长，使部分化合物的回收率很不稳定。综合上述比较实验，最终采用确定乙腈和水的体积比为80：20，实施例1为最佳实施 例。

二、酸度的优化

分别配制不含甲酸和含0.1％、0.2％、0.3％甲酸的80％乙腈水溶液，考察酸度对提取效果的影响，测试结果见下表4。

表4实施例1、5-7提取剂中甲酸浓度测试结果记录表

从表4的记录可得，随着酸度的提高，大部分兽药的回收率均得到了增加；氯羟吡啶的回收率随着酸度的增加，反而出 现了降低的现象。同时部分磺胺药物的回收率有较大幅度的下降，原因可能是由于酸度加大后部分磺胺药物出现离子化影响 了提取效率。综合考虑，确定提取剂中甲酸的体积浓度为0.1％，即实施例1为最佳实施例。

三、方法回收率、检出限、定量限和精密度

选定实施例1的提取剂，依据实施例1的测试方法，对方法回收率、检出限、定量限和精密度进行验证。本实验采用了 4个加标浓度，每个浓度3次平行实验。分别向样品中加入相当于1μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg的标准混合溶液和 0.2μL的内标混合溶液。按照实施例1的方法进行检测。实验结果表明：10类药物的回收率在65.06％-111.15％之间，RSD 在0.5-16.7％之间均符合兽药残留检测的要求。10类兽药的回收率具体见表5。

表5肉鸡中10类药物残留的加标回收率及相关系数

四、线性方程、范围和相关系数

使用经确认不含兽药残留的鸡肉空白基质液配制10类兽药的系列标准溶液，以各分析物的峰面积(Y)为纵坐标，质量 浓度(X)为横坐标绘制标准曲线。10类兽药残留的线性回归方程、线性范围、相关系数见表6。

表6鸡肉中10类兽药的线性回归方程、线性范围、相关系数和仪器精密度

由表6的记录可得，各种兽药残留在相应线性范围内线性良好，各兽药的线性相关系数均大于0.99。

五、仪器稳定性

将兽药的混合标准溶液按照实施例1的测试方法，在仪器上连续进样6次，各种兽药残留的RSD范围为0.9％～7.3％。 实验结果表明，该试验方法和仪器稳定性较好。

六、Oasis PRiME HLB柱对磷脂和脂肪的净化和吸附作用

对于样品我选择了不同的固相萃取柱，希望通过固相萃取，能够把磷脂和脂肪保留在固相萃取柱上，以实现样品的净化。 经过选择，Oasis PRiME HLB柱能够实现磷脂和脂肪的净化和吸附作用。净化效果见图12。由图可见，对磷脂的特征离子184 进行目离子进行全扫描，未经Oasis PRiME HLB柱净化的样品，其磷脂的质谱响应为1.15e9，经过OasisPRiME HLB柱净化 的样品，磷脂的质谱响应为1.19e7，实验结果表明Oasis PRiME HLB柱能够去除95％以上的磷脂和脂肪，达到了实验的预期 的目的。

七、市场应用验证

依据实施例1快速灵敏的多兽药残留检验技术，开展对市场上销售的杀白鸡进行了多残留兽药检测。

7.1材料与方法

7.1.1监测样品

样品来源于市场上销售和养殖的杀白鸡，共计67批样品。

7.1.2监测参数兽药10类94种：详见表6。

7.1.3检测方法依据实施例1的方法进行检测。

7.2结果

采用所建立的多兽药残留检测方法，对67批肉鸡进行94个参数的检测，检出替米考星、磺胺氯吡嗪、磺胺喹恶啉、磺 胺氯哒嗪、林可霉素、氧氟沙星、氢化可的松等7种药物检出残留，94种药物阳性率为7.3％。

依据农业部公告235号和农业部公告2292号对农兽药残留限量的规定，67批样品中不合格样品2批，不合格项目为磺 胺喹恶啉，含量分别为366.6μg/kg和379.1μg/kg，为同一厂家同一批次的2批样品。具体见表7。由于检验参数较多， 表中仅列出67批样品中检验呈阳性的药物。

表7市售杀白鸡中药物残留的检验结果(单位：μg/kg)

注：仅列出检验成阳性的7类药物

由表可见市售杀白鸡检出药物7种，由于来自不同的养殖场，各个养殖场使用的药物种类有所区别，因此检出的药物类 别相对较多。其中包括外用的药物氢化可的松药物。此外，市售杀白鸡中测得2批氧氟沙星阳性样品。中华人民共和国农业 部公告第2292号规定，自2016年12月31日起，停止经营、使用用于食品动物的洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙 星4种原料药的各种盐、酯及其各种制剂。而此2批样品出栏时间刚好在公告实施之前，因此在后期检测过程中可做相应的 监测，关注中华人民共和国农业部公告第2292号的执行情况。

综上所述，本发明实施例可以应用于实际市场检测，具有很好的应用前景。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所 做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

综上所述，本发明实施例可以应用于实际市场检测，具有很好的应用前景。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所 做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，其特征在于，包括：

样品制备步骤：取畜禽肉样品，去皮去骨后，取肉组织部分制成肉泥，获取待测样品，混匀封装后冷冻保存；

提取剂制备步骤：取乙腈、水和甲酸，混合均匀，获取提取剂；其中乙腈、水的体积比在75:25到90:10之间，甲酸的体积为乙腈和水的体积之和的0.1-0.3％；

样品提取步骤：称取所述待测样品，置于离心管中，加入内标工作混合液；然后加入所述提取剂，摇匀，获取第一分析液；将所述第一分析液进行离心分离，取上层清液，记为第一上层清液；

样品净化步骤：取所述第一上层清液，用Oasis PriMe HLB固相萃取柱进行杂质吸附，收集流出液，再用所述提取剂洗涤所述固相萃取柱，合并流出液，获取第二分析液；接着，对所述第二分析液进行氮吹，定容后，离心分离，取上层清液，记为第二上层清液，过滤，获取测试液；

测试步骤：所述测试液进行UPLC-MS/MS测定。

2.如权利要求1所述的同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，其特征在于，在所述样品制备步骤中，所述肉组织部分采用绞肉机制成肉泥，获取待测样品，混匀后装入封口包装袋中，在-18℃以下冷冻保存，备用。

3.如权利要求1所述的同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，其特征在于，在所述提取剂制备步骤中，乙腈、水和甲酸的体积比为80:20:0.1。

4.如权利要求1所述的同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，其特征在于，在所述样品提取步骤中，准确称取待测样品2.0g，置于50mL离心管中，精确加入同位素内标工作混合液0.2mL，然后加入9.8mL所述提取剂，以12000r/min的速度匀浆2min，获取第一分析液；将所述第一分析液以10000r/min的转速在5℃的条件下，离心10min，取上层清液，记为第一上层清液。

5.如权利要求1所述的同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，其特征在于，在所述样品提取步骤中，所述内标工作混合液的制备方法如下：精密移取0.050mL0.1mg/mL的内标储备液至20mL容量瓶中，用甲醇定容，获取浓度为250ng/mL内标工作混合液。

6.如权利要求1所述的同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，其特征在于，在所述样品净化步骤中，取2mL所述第一上层清液，置于PriMe HLB固相萃取柱上，调节流速为1-2滴/秒，收集流出液，再用2mL所述提取剂洗涤所述固相萃取柱，合并流出液于刻度试管中，获取第二分析液；接着，用氮气将所述第二分析液吹至1.0mL以下，加入水定容至1.0mL，涡旋充分溶解残渣，以10000r/min的速度在5℃的条件下离心10min，取上层清液，记为第二上层清液，所述第二上层清液过0.22μm有机微孔滤膜，获取测试液。

7.如权利要求1所述的同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，其特征在于，在所述测试步骤中，色谱的测试条件如下：正离子模式下，采用Waters ACQUITYUPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)；柱温30℃，样品温度为15℃，进样体积为2μL，流速为0.35mL/min；流动相A为：5mmol/L乙酸铵水溶液和甲酸的混合液，流动相B为：5mmol/L乙酸铵甲醇溶液和甲酸的混合液，梯度洗脱；

负离子模式下，采用Waters ACQUITY UPLC BEH C₁₈色谱柱(2.1mm×100mm，1.7μm)，柱温30℃，样品温度为15℃，进样体积为2μL，流速为0.30mL/min；流动相为甲醇水溶液，其中甲醇和水的体积比为40：60，等度洗脱。

8.如权利要求7所述的同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，其特征在于，在正离子模式下，梯度洗涤的条件如下：

流动相A中，乙酸铵水溶液与甲酸的体积比为99.9:0.1；流动相B中，乙酸铵甲醇溶液和甲酸的体积比为99.9:0.1。

9.如权利要求1所述的同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，其特征在于，在所述测试步骤中，质谱的测试条件如下：

质谱仪：三重四级杆串联质谱仪；离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描和负离子扫描；检测方式：多反应监测；

电离电压：4500v/-3500v；离子源温度：500℃；

碰撞气流量：0.15mL/min。

10.如权利要求1所述的同时测定畜禽中10类94种残留药物的液相色谱-串联质谱法，其特征在于，还包括校正步骤：制备空白样品，空白样品的制备与所述样品提取步骤、样品净化步骤和测试步骤一致，但在样品提取步骤中，不需要加入所述待测样品；所述空白样品进行UPLC-MS/MS测定；

还包括定量步骤：首先制备空白基质液：取不含目标检测物的空白样品，除不加内标工作混合液外，处理过程与所述样品提取步骤、样品净化步骤和测试步骤一致，制得空白样品基质液；

然后配置标准曲线：精密移取标准中间溶液和内标工作混合液，用空白样品基质液配置成0.2-20ng/mL的系列标准工作混合液，接着分别进行UPLC-MS/MS测定，获取标准曲线。