CN108152420A - 一种分析猪肉中农药残留的QuEChERS-HPLC-MS/MS方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分析猪肉中农药残留的QuEChERS‑HPLC‑MS/MS方法，包括：移取农药标准品溶液添加到无农药残留的猪肉中，对其进行样品前处理‑液相色谱‑串联质谱法QuEChERS‑HPLC‑MS/MS测定，得到标准曲线；将待分析猪肉进行样品前处理QuEChERS，获得过滤液；利用液相色谱‑串联质谱法HPLC‑MS/MS对过滤液进行测定，并将测定结果带入标准曲线求得待分析猪肉中农药残留含量情况。本发明将QuEChERS法和HPLC‑MS/MS有效结合，建立了猪肉中农药残留的QuEChERS‑HPLC‑MS/MS分析方法，该方法不仅有效缩短了前处理时间，而且有机试剂用量少；废弃物少，对环境污染小；通过对吸附剂的优化，降低了基质干扰，提高了净化效率。该方法不仅快速、准确，而且兼顾简便、耐用和低成本的优势，适合猪肉中25种农药残留的确证和定量测定。

Description

一种分析猪肉中农药残留的QuEChERS-HPLC-MS/MS方法

技术领域

本发明涉及分析化学及食品安全技术领域，主要涉及猪肉中多种农药残留的测定技术，具体涉及一种分析猪肉中农药残留的QuEChERS-HPLC-MS/MS方法。

背景技术

肉和肉制品是日常生活不可或缺的食品，在日常饮食中占的比重很大，其安全与否直接关系到人们的身体健康和社会的稳定。只有认清了肉和肉制品农药残留的现状和危害，才能从根本上防控农药残留，最大限度地保障肉和肉制品的安全。

农药经过食物链和生物富集作用主要积聚于动物的脂肪组织，因此，高脂肪含量的食品是人类农接触农药的的主要途径之一。肉和肉制品农药残留主要是在畜禽饲养、屠宰和加工过程中造成的，很多畜禽以农作物为饲料，而农作物对土壤中的农药有富集作用，这些脂溶性的农药进入家畜体内不易排出，对人体产生负面影响。

肉和肉制品中常见的农药残留主要有有机磷农药残留、有机氯农药残留和拟除虫菊酯类农药残留等。目前残留最多的种类是有机磷农药残留。有机磷农药是一类高效、广谱的杀虫剂，易分解、且杀虫效率较高，常被用来杀灭动物体外寄生虫等敌害生物，在提高畜禽产量等方面起着积极作用，是目前农业生产上控制病虫害的主要农药之一，但是多数有机磷农药属剧毒和高毒类，进入河流和湖泊等各种水体，使农作物和畜禽受到不同程度的污染，生物链富集到人体后产生残留毒性，对人体有极大的危害，引发食品安全问题。

有机氯农药作为防治作物害虫的杀虫剂，化学性质稳定，被广泛使用。但施用后被土壤和水体吸附，富集到动物体内，造成畜禽农残超标，人食用后会导致内分泌失调。拟除虫菊酯类农药是一类仿生广谱类杀虫剂，它对害虫有较强的杀伤力，对鱼类有很高的毒性，大量施用该类农药后，会通过水体进入鱼体，人食用累积一定量后会对神经系统和免疫系统造成伤害。

必须建立完善的法规，制定和修订相关标准，使肉和肉制品中的农药残留相应的法规和标准更贴近实际生产和生活。相应的检验检测机构也应当担负起职能责任，对目前的产业状况进行新标准研究，对肉和肉制品的安全指标及隐形成分进行检验研究，确保老百姓放心食用。

香港特区政府新推出的《食物内除害剂残余规例》(以下简称《规例》)于2014年8月1日起正式实施，该项条例的推行意味着香港进一步提高对进口食品、农产品的质量安全要求。根据《规例》要求，食物含有的除害剂残余不得超过最高残余限量，如果其中任何一项要求不达标，该商品将被要求退出市场。任何人在香港进口、制造或售卖含有不符合《规例》除害剂残余要求的食物，即属违法，最高可罚款五万港元及监禁六个月。

《规例》正式实施后，湖北省供港猪肉新增农残项目检测，目前湖北省供港畜肉普查项目已逐渐增加至近40项。随着《规例》的深入推行，农残检测项目还会继续增加。现有检测方法主要参照国标GB/T19650-2006、GB/T 5009.162-2013、GB/T 20772-2008、SN/T1969-2007、SN/T2234-2008等方法分别进行前处理，使用GC-MS、HPLC-MS/MS等仪器检测，样品前处理需要凝胶渗透色谱等设备净化，步骤繁琐，检测周期长，不能较好地满足供港食品快速检测需要，急需建立一种高效、快速的前处理及液质联用方法来有效应对猪肉日常检测工作的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、准确，而且兼顾简便、耐用和低成本优势的猪肉中农药残留的分析方法，用以解决现有检测方式步骤繁琐，检测周期长，不能较好地满足供港食品快速检测需要的问题。

为实现上述目的，本发明的技术方案为提供一种分析猪肉中农药残留的QuEChERS-HPLC-MS/MS方法，具体为：所述方法包括：

移取农药标准品溶液添加到无农药残留的猪肉中，对其进行样品前处理-液相色谱-串联质谱法QuEChERS-HPLC-MS/MS测定，得到标准曲线；

将待分析猪肉进行样品前处理QuEChERS，获得过滤液；

利用液相色谱-串联质谱法HPLC-MS/MS对所述过滤液进行测定，并将测定结果带入标准曲线求得待分析猪肉中农药残留含量情况。

优选地，所述QuEChERS具体为：

称取猪肉于离心管中，加入使蛋白质变性形成沉淀的溶液，并加入去除猪肉中水分的试剂，然后离心，获得第一上清液；

移取第一上清液至离心管中，加入吸附剂，然后离心，获得第二上清液；

移取第二上清液至氮吹管中，在全自动平行氮吹浓缩仪中吹干，加入使猪肉残渣溶解的试剂，过滤，获得过滤液，待进行HPLC-MS/MS测定。

进一步优选地，所述蛋白质变性形成沉淀的溶液为乙酸乙腈溶液。

进一步优选地，所述去除猪肉中水分的试剂为无水硫酸钠。

进一步优选地，所述吸附剂为乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅烷键合硅胶。

进一步优选地，所述使猪肉残渣完全溶解的试剂为乙腈溶液。

进一步优选地，离心过程中，离心过程中，离心转速为6000r/min，离心时间为10min。

优选地，采用的色谱条件为：

色谱柱：waters atlantis T3色谱柱：150mm×2.1mm×3μm；

柱温箱温度：35℃；样品室温度：室温；进样量：10μL；流速为0.20mL/min；流动相A：5mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B：5mmol/L甲酸铵甲醇溶液。

优选地，采用的质谱条件为：干燥气温度：325℃；干燥气流量：6L/min；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；毛细管电压：3500V；扫描方式：多反应监测模式检测。

优选地，所述的农药标准品溶液包括：灭多威、灭蝇胺、乙酰甲胺磷、嘧霉胺、甲萘威、克百威、啶虫脒、乐果、抗蚜威、灭线磷、吡虫啉、禾草丹、甲拌磷、特丁硫磷、三唑酮、三唑醇、杀扑磷、噻嗪酮、戊唑醇、氟硅唑、马拉硫磷、咪鲜胺、呋线威、嘧菌酯及茚虫威。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明将Quechers法和HPLC-MS/MS有效结合，建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS法同时测定猪肉中25种农药残留的检测方法。用1％乙酸-乙腈提取猪肉中25种农药残留，利用PSA及C18吸附剂净化，然后进行HPLC-MS/MS测定。该方法不仅有效缩短了前处理时间，而且有机试剂用量少；废弃物少，对环境污染小；通过对吸附剂的优化，降低了基质干扰，提高了净化效率。研究结果表明，该方法不仅快速、准确，而且兼顾简便、耐用和低成本的优势，适合猪肉中25种农药残留的确证和定量测定。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的一种分析猪肉中农药残留的方法流程示意图；

图2为本发明实施例1提供的一种QuEChERS处理方法示意图；

图3为添加5μg/kg灭多威猪肉样品MRM图；

图4为添加5μg/kg灭蝇胺猪肉样品MRM图；

图5为添加5μg/kg乙酰甲胺磷猪肉样品MRM图；

图6为添加5μg/kg嘧霉胺猪肉样品MRM图；

图7为添加5μg/kg甲萘威猪肉样品MRM图；

图8为添加5μg/kg克百威猪肉样品MRM图；

图9为添加5μg/kg啶虫脒猪肉样品MRM图；

图10为添加5μg/kg乐果猪肉样品MRM图；

图11为添加5μg/kg抗蚜威猪肉样品MRM图；

图12为添加5μg/kg灭线磷猪肉样品MRM图；

图13为添加5μg/kg吡虫啉猪肉样品MRM图；

图14为添加5μg/kg禾草丹猪肉样品MRM图；

图15为添加5μg/kg甲拌磷猪肉样品MRM图；

图16为添加5μg/kg特丁硫磷猪肉样品MRM图；

图17为添加5μg/kg三唑酮猪肉样品MRM图；

图18为添加5μg/kg三唑醇猪肉样品MRM图；

图19为添加5μg/kg杀扑磷猪肉样品MRM图；

图20为添加5μg/kg噻嗪酮猪肉样品MRM图；

图21为添加5μg/kg戊唑醇猪肉样品MRM图；

图22为添加5μg/kg氟硅唑猪肉样品MRM图；

图23为添加5μg/kg马拉硫磷猪肉样品MRM图；

图24为添加5μg/kg咪鲜胺猪肉样品MRM图；

图25为添加5μg/kg呋线威猪肉样品MRM图；

图26为添加5μg/kg嘧菌酯猪肉样品MRM图；

图27为添加5μg/kg茚虫威猪肉样品MRM图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

图1为本发明实施例提供的一种分析猪肉中农药残留的方法示意图，具体为QuEChERS-HPLC-MS/MS方法流程示意图，如图1所示，所述分析方法包括以下步骤S110-步骤S130：

移取农药标准品溶液添加到无农药残留的猪肉中，对其进行样品前处理-液相色谱-串联质谱法QuEChERS-HPLC-MS/MS测定，得到标准曲线；

将待分析猪肉进行样品前处理QuEChERS，获得过滤液；

利用液相色谱-串联质谱法HPLC-MS/MS对所述过滤液进行测定，并将测定结果带入标准曲线求得待分析猪肉中农药残留含量情况。

在一个具体实施方式中，采用的色谱条件为：

色谱柱：waters atlantis T3色谱柱：150mm×2.1mm×3μm；

柱温箱温度：35℃；样品室温度：室温；进样量：10μL；流速为0.20mL/min；流动相A：5mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B：5mmol/L甲酸铵甲醇溶液。

在一个具体实施方式中，采用的质谱条件为：干燥气温度：325℃；干燥气流量：6L/min；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；毛细管电压：3500V；扫描方式：多反应监测模式检测。

在一个具体实施方式中，所述的农药标准品溶液包括：灭多威、灭蝇胺、乙酰甲胺磷、嘧霉胺、甲萘威、克百威、啶虫脒、乐果、抗蚜威、灭线磷、吡虫啉、禾草丹、甲拌磷、特丁硫磷、三唑酮、三唑醇、杀扑磷、噻嗪酮、戊唑醇、氟硅唑、马拉硫磷、咪鲜胺、呋线威、嘧菌酯及茚虫威。

图2为一种QuEChERS处理方法示意图，如图2所示，所述QuEChERS具体包括以下步骤S210-步骤S230：

称取猪肉于离心管中，加入使蛋白质变性形成沉淀的溶液，并加入去除猪肉中水分的试剂，然后离心，获得第一上清液；

移取第一上清液至离心管中，加入吸附剂，然后离心，获得第二上清液；

移取第二上清液至氮吹管中，在全自动平行氮吹浓缩仪中吹干，加入使猪肉残渣溶解的试剂，过滤，获得过滤液，待进行HPLC-MS/MS测定。

在一个具体实施方式中，所述蛋白质变性形成沉淀的溶液为乙酸乙腈溶液。

在一个具体实施方式中，所述去除猪肉中水分的试剂为无水硫酸钠。

在一个具体实施方式中，所述吸附剂为乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅烷键合硅胶。

在一个具体实施方式中，所述使猪肉残渣完全溶解的试剂为乙腈溶液。

在一个具体实施方式中，离心过程中，离心过程中，离心转速为6000r/min，离心时间为10min。

下面以具体实施方式介绍整个分析过程：

实施例2

1、实验部分

1.1仪器和试剂

Agilent 6460质谱仪(美国安捷伦公司)；高速冷冻离心机(美国Beckman公司)

全自动平行氮吹浓缩仪MV5(Labtech公司)；高速均质机(德国IKA公司)；电子天平(瑞士Mettler Toledo公司)；涡旋混合器(德国IKA公司)；振荡器(日本Yamato公司)。

乙二胺-N-丙基硅烷PSA(40-63um)及十八烷基硅烷键合硅胶C18吸附剂，上海安谱公司；甲醇、乙腈、甲酸铵(色谱纯)；乙酸、无水硫酸钠(分析纯)；水为超纯水。

标准品：1、灭多威(methomyl)，2、灭蝇胺(cyromazine)，3、乙酰甲胺磷(acephate)，4、嘧霉胺(pyrimethanil)，5、甲萘威(carbaryl)，6、克百威(carbofuran)，7、啶虫脒(acetamiprid)，8、乐果(dimethoate)，9、抗蚜威(pirimicarb)，9、灭线磷(ethoprophos)，10、吡虫啉(imidacloprid)，10、禾草丹(thibencarb)，11、甲拌磷(phorate)，12、特丁硫磷(terbufos)，13、三唑酮(triadimefon)，14、三唑醇(triadimenol)，15、杀扑磷(methidathion)，16、噻嗪酮(buprofezin)，17、戊唑醇(tebuconazole)，18、氟硅唑(flusi lazole)，19、马拉硫磷(malathion)，20、咪鲜胺(prochloraz)，21、呋线威(furathiocarb)，22、嘧菌酯(azoxystrobin)，23、茚虫威(indoxacarb)，浓度100μg/mL，均购自农业部环境保护科研监测所。

1.2色谱条件

色谱柱为waters atlantis T3色谱柱(150mm×2.1mm，3μm)；柱温箱温度：35℃；样品室温度：室温；进样量：10μL；流速为0.20mL/min；流动相A：5mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B：5mmol/L甲酸铵甲醇溶液。梯度洗脱程序见表1。

表1梯度洗脱程序

1.3质谱条件

干燥气温度(Gas temp)：325℃；干燥气流量(Gas Flow)：6L/min；鞘气温度(Sheath Gas Temp)：350℃；鞘气流量(Sheath Gas Flow):11L/min；毛细管电压(Capillary Gas Flow)：3500V；扫描方式：多反应监测模式检测。

1.4样品前处理

将猪肉切成小块，用刀式研磨均质仪3500r/min粉碎至浆状。准确称取5.00g猪肉于50mL离心管中，加入15mL1％乙酸乙腈溶液，振荡器振荡15min，加入6g无水硫酸钠，涡旋2min，振荡器振荡10min，然后于6000r/min条件下，离心10min。

移取5mL上清液至15mL离心管中，加入200mg PSA，100mg C18，涡旋2min，然后于5000r/min条件下，离心10min，准确移取3mL上清液至10mL氮吹管中，于40℃条件下，在全自动平行氮吹浓缩仪中缓缓吹干，加入10％乙腈水溶液1mL，用0.22μm滤膜过滤至样品瓶中，供LC-MS/MS测定。

2结果与讨论

2.1样品前处理条件的选择和优化

猪肉含有大量的蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素等营养成分。按照本发明的提取方法，乙腈能够使蛋白质变性形成沉淀，通过离心后除去，无水硫酸钠除去猪肉基质中的水分，PSA和C18吸附剂除去提取液(离心后获得上清液)中碳水化合物和部分脂肪，再次离心，将此提取液(再次离心后的上清液)在氮气下缓缓吹干，经多次试验，加入1.0mL10％乙腈水溶液，溶液能使残渣完全溶解，溶液澄清，过滤，获得过滤液，进样后色谱峰形尖锐，对称性好，保留时间稳定，灵敏度未改变，回收率能满足要求。

2.2色谱条件的选择和优化

试验对waters atlantis T3色谱柱及Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱进行比较，结果发现：分离效果大致相当，但是waters atlantis T3色谱柱灵敏度更高，保留时间的稳定性更好，实际样品测试的适用性更好、耐用。最终选择waters atlantis T3色谱柱。

2.3样品基质效应的消除

应用液相色谱-串联质谱测定复杂样品，基质对分析物的离子化具有增强或是抑制效应，严重影响定量的准确性。本发明采用系列空白添加试样作为基质标准溶液，用该校正曲线校正加标样品，25种药物的回收率达到71％～119％之间，符合有关规定。因此，本发明采用系列基质标准溶液计算回收率，消除基质效应影响。

2.4质谱条件的优化

在ESI(+)模式下分别对单个标准溶液进行一级质谱全扫描分析，得到每种药物的分离离子，然后以分子离子为母离子，对其离子进行全扫描，以MRM模式检测，在此基础上对fragmentor电压和碰撞能进行优化，使选定的母离子和子离子组成的特征离子的丰度和比例达到最佳。图3至图27为添加5μg/kg的25种药物猪肉样品MRM图。

2.5定性依据及定量方法

定性依据：进行样品测定时，如果试样中的色谱峰保留时间与标准工作溶液一致(变化范围在±2.5％之内)；并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，并且所选择的离子相对丰度与浓度接近的同样条件得到的标准溶液谱图相比，最大允许相对偏差不超过表2规定的范围，则可判断样品中存在目标化合物，采用基质添加标准溶液定量。

表2为定性离子相对丰度的最大允许偏差

相对离子丰度	＞50％	＞20％～＜50％	＞10％～＜20％	≤10％
					最大允许的相对偏差	±20％	±25％	±30％	±50％

2.6线性关系、检出限

准确移取适量的灭蝇胺、乐果、吡虫啉等25种药物标准品溶液，分别添加到5g空白猪肉(无农药残留的猪肉)中，按照1.4方法处理，制得含量为5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg的系列空白添加试样，待上机检测。以目标组分峰面积为纵坐标、以组分相应的添加质量浓度X(μg/kg)为横坐标，绘制标准曲线。各组分均在5～100μg/kg的范围内与其峰面积呈线性关系，相关系数均大于0.98，线性方程及相关系数见表3。

表3 25种农药线性方程及相关系数

采用在空白组织中添加目标组分的方法，依据特征离子色谱峰的信噪比(S/N)大于3为检出限(LOD)，信噪比(S/N)大于10为测定低限(LOQ)，得到的25种药物的LOD为2μg/kg，LOQ为5μg/kg。

2.7回收率与精密度

以猪肉为样品，做三个水平的添加试验，分别为5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg，每个添加水平重复6次，按1.4进行回收试验，方法回收率和相对标准偏差符合国内外有关标准和法规的要求，见表4。

表4 25种药物在空白猪肉中添加回收率和相对标准偏差(n＝6)

2.8实际样品测定

运用本发明建立方法对30份猪肉样品进行了检测，该方法简便、快捷，具有很好的适用性和操作性，谱图中干扰峰较少，在所检的猪肉样品中未检出25种药物。

3结论

实验结果表明，本发明建立的QuEChERS-HPLC-MS/MS同时测定猪肉中25种农药残留的分析方法，具有前处理简单可靠、用时短、环境污染小、成本低廉等特点。用1％乙酸-乙腈提取猪肉中甲拌磷等25种农药残留，采用PSA及C18吸附剂净化，利用HPLC-MS/MS测定。本发明建立的方法不仅有效缩短了前处理时间，而且有机试剂用量少；废弃物少，对环境污染小；通过对吸附剂的优化，降低了基质干扰，提高了净化效率。研究结果表明，本发明建立的该方法不仅快速、准确，而且兼顾简便、耐用和低成本的优势，适合猪肉中马拉硫磷、呋线威、嘧菌酯等25种农药残留的确证和定量测定。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种分析猪肉中农药残留的QuEChERS-HPLC-MS/MS方法，其特征在于，所述方法包括：

移取农药标准品溶液添加到无农药残留的猪肉中，对其进行样品前处理-液相色谱-串联质谱法QuEChERS-HPLC-MS/MS测定，得到标准曲线；

将待分析猪肉进行样品前处理QuEChERS，获得过滤液；

利用液相色谱-串联质谱法HPLC-MS/MS对所述过滤液进行测定，并将测定结果带入标准曲线求得待分析猪肉中农药残留含量情况。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述QuEChERS具体为：

称取猪肉于离心管中，加入使蛋白质变性形成沉淀的溶液，并加入去除猪肉中水分的试剂，然后离心，获得第一上清液；

移取第一上清液至离心管中，加入吸附剂，然后离心，获得第二上清液；

移取第二上清液至氮吹管中，在全自动平行氮吹浓缩仪中吹干，加入使猪肉残渣溶解的试剂，过滤，获得过滤液，待进行HPLC-MS/MS测定。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白质变性形成沉淀的溶液为乙酸乙腈溶液。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述去除猪肉中水分的试剂为无水硫酸钠。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述吸附剂为乙二胺-N-丙基硅烷和十八烷基硅烷键合硅胶。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述使猪肉残渣完全溶解的试剂为乙腈溶液。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，离心过程中，离心转速为6000r/min，离心时间为10min。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用的色谱条件为：

色谱柱：waters atlantis T3色谱柱：150mm×2.1mm×3μm；

柱温箱温度：35℃；样品室温度：室温；进样量：10μL；流速为0.20mL/min；流动相A：5mmol/L甲酸铵水溶液；流动相B：5mmol/L甲酸铵甲醇溶液。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用的质谱条件为：干燥气温度：325℃；干燥气流量：6L/min；鞘气温度：350℃；鞘气流量：11L/min；毛细管电压：3500V；扫描方式：多反应监测模式检测。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的农药标准品溶液包括：灭多威、灭蝇胺、乙酰甲胺磷、嘧霉胺、甲萘威、克百威、啶虫脒、乐果、抗蚜威、灭线磷、吡虫啉、禾草丹、甲拌磷、特丁硫磷、三唑酮、三唑醇、杀扑磷、噻嗪酮、戊唑醇、氟硅唑、马拉硫磷、咪鲜胺、呋线威、嘧菌酯及茚虫威。