CN104698114A - 一种大米中205种农药残留量的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析化学、食品安全领域。一种大米中205种农药残留量的检测方法，该方法样品经样品乙腈提取，提取液经过QuEChERS方法净化后，采用色谱柱:Phenomenex Synergi2.5

Description

一种大米中205种农药残留量的检测方法

技术领域：

本发明涉及分析化学、食品安全领域，具体地说，是一种大米中农药残留量的检测方法。

背景技术：

随着农业生产中农药应用的增加，人们逐渐发现其在植物内的残留，可通过植物源食品传递给人类。因此，农药在农产品中的残留问题给人们身体健康带来了较大的隐患，

随着全球经济一体化和食品贸易国际化，食品安全已成为一个世界性的挑战和全球重要的公共卫生问题。植物性食品安全已成为全世界关注的焦点，其中农药残留问题是影响植物性食品安全的最主要农药。我国是大米出口国，每年出口大米200多万吨，主要出口日本、韩国和非洲一些国家。随着人们的食品安全意识的提高和技术贸易壁垒的需要，各国对农产品中农药残留限制越来越严，要求检验的项目越来越多，方法的检测低限要求越来越高。以出口大米为例，日本规定的输日大米农残检验项目逐年增加。

目前，有关农药残留检测我国国家标准检测方法共有76个，涉及502种化学物质，可以用于出口农产品检测的方法仅有16个，涉及检测项目50项，其余60个方法已不适用。行业标准检测方法有305个，涉及检测项目338种化学物质，多为单残留分析方法，远远不能满足出口大米农残检验的实际需要。因此，急需建立一套大米中多类农药残留集成化检测方法。

发明内容：

本发明的目的是克服现有不足问题，提供一种大米中205种农药残留量的检测方法，液相色谱/串联质谱法检测大米中205种农药残留量的方法，可方便、准确、高效地同时检测大米中205种农药残留量。

本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：一种大米中205种农药残留量的检测方法，按照下述步骤及物质比例进行检测：

1、样品提取： 

5g(精确到0.01g)大米样品置于50mL离心管中，加入10mL水，加盖，涡旋混合1分钟，再向离心管中乙腈(0.1％乙酸)15mL，涡旋1分钟，之后加入6g无水硫酸镁与1.5g醋酸钠，剧烈振摇20s，使块状结晶充分散开。4000转/分的标准转速离心5分钟；

2、样品净化： 

取离心后的上清液中取8mL上层溶液，并置于15mL的离心管中，该离心管中之前已经添加了PSA400mg，无水硫酸镁1200mg，C18400mg，涡旋混合15min，4000转/分的标准转速离心5分钟；

3、液相色谱-质谱/质谱仪测定： 

按照液相色谱－质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，质谱分离采用在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描；通过被测样品的质谱和相关信息，得到其定性和定量结果；定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。定量测定时采用标准曲线法。

作为优选，在步骤3中所述液相色谱分析条件为：

色谱柱：反相C18色谱柱

流动相A：5ml(1M甲酸胺溶液)+895ml二次水+100ml甲醇；

流动相B：5ml(1M甲酸胺溶液)+95ml二次水+900ml甲醇；梯度洗脱。

柱温：40℃

流速：0.4mL/min

进样量：10μL

作为优选，所述反相C18柱为Phenomenex Synergi 2.5μFusion-RP C18100A 50×2.0mm(i.d)。

作为优选，所述梯度洗脱程序为：

0～1分钟，流动相A100％，流动相B 0％；

1～15分钟，流动相A100～0％，流动相B 0～100％；

15～18分钟，流动相A 0％，流动相B 100％；

18.01，流动相A 100％，流动相B 0％.

18.01～20分钟，流动相A 100％，流动相B 0％.

作为优选，在步骤3中所述质谱条件为：

a)离子源：电喷雾离子源

b)扫描方式：正离子扫描

c)检测方式：多反应监测(MRM)

d)离子化电压IS:+5500V：5500.00V

e)雾化气(GS1)：55.00Psi

f)辅助气(GS2)：60.00L/min

g)气帘气(CUR)：35.00Psi

h)离子源温度(TEM)：550℃

i)分别设定母离子、子离子、去簇电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞室

出口电压(CXP)、碰撞气能量(CE)。

作为优选，在步骤3中标准工作溶液的配置方法为：农药混合标准溶液自A组至K组共分10组，见表1，每一组中每种农药标准品的浓度均为100μg/mL乙腈溶液：

表1      205种农药标准溶液

混合标准储备液：从10个密封的1mL安培小瓶(A组至K组)中内的100μg/mL的混标乙腈溶液中各取10μL，用900μL乙腈稀释，并保存在棕色玻璃瓶中，置于-18℃冰箱中保存；205种农药的浓度相当于1μg/mL；

标准工作曲线工作液：取混合标准工作溶液0.2mL用甲醇定容至10mL容量瓶中，再根据需要用空白样品溶液将标准储备液逐级稀释；逐级稀释浓度为：0.1ng/mL，0.25ng/mL，0.5ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，15ng/mL，20ng/mL。

进一步地，所述205种农药包括下表2中至少一种。

表2    205种农药

由于采用上述技术方案，本发明的有益效果在于：

1、建立了大米中205种农药残留量的液相色谱-串联质谱法检测方法。实现了205种 农药的同时检测。

2、对大米样品采用采用乙腈提取，然后脱去样品中的水分，并用pH值为5.0～5.5的乙酸和乙酸钠的缓冲盐体系促进分配。由于大米粉是干性样品，加入乙腈提取前用水浸泡30min，可以增加溶剂的提取效率。

3、提取液采用QuEChERS方法净化，采用的PSA属于正相吸附剂，含水量越少净化效果越好，用无水硫酸镁除去提取物中的水分。具有较好的净化效果，并保证205种农药都有较高的回收率。

4、利用液相色谱-质谱/质谱多反应模式(MRM)检测，具有抗干扰能力强的特点。

5、与以往的方法比较，具有简单、快速、准确、高效等优点，205种农药检出限均低于10μg/kg，205种农药的回收率范围均在50％～130％以内。方法的检测限、回收率和精密度等技术指标满足国内外对大米中农药残留量检测的有关要求。

6、本发明可应用于大米中多种农药残留的检验中，对促进我国农产品的进出口贸易，确保食品安全，保障人类身体健康都具有十分重要的意义。

附图说明：

图1为正离子模式下205种农药混合标准溶液在MRM模式下的总离子流图；

图2为大米样品添加205种农药标准溶液(10μg/kg)MRM模式下的总离子流图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。

实施例1大米中205种农药残留量的检测方法

1、样品提取：5g(精确到0.01g)大米样品置于50mL离心管中，加入10mL水，加盖，涡旋混合1分钟，再向离心管中乙腈(0.1％乙酸)15mL，涡旋1分钟，之后加入6g无水硫酸镁与1.5g醋酸钠，剧烈振摇20s，使块状结晶充分散开。4000转/分的标准转速离心5分钟。

2、提取液净化 

离心后的上清液中取8mL上层溶液，并置于15mL的离心管中，该离心管中之前已经添加了PSA400mg，无水硫酸镁1200mg，C18400mg，涡旋混合15min，4000转/分的标准转速离心5分钟。

3、液相色谱-质谱/质谱仪测定 

按照液相色谱－质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，质谱分离采用在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描。通过被测样品的质谱和相关信息，得到其定性和定量结果。定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物。定量测定时采用标准曲线法。

液相色谱分析条件：

a)色谱柱:Phenomenex Synergi 2.5μFusion-RP C18100A 50×2.0mm(i.d)

b)色谱柱柱温度：40℃；

c)流动相；

流动相A：5ml(1M甲酸胺溶液)+895ml二次水+100ml甲醇；

流动相B：5ml(1M甲酸胺溶液)+95ml二次水+900ml甲醇；

d)流速:0.4mL/min；

e)进样量:10μL

f)流动相梯度条件见表3

表3 流动相梯度洗脱程序(正离子模式)

质谱条件：

a)气帘气CUR：35psi；

b)离子化电压IS:+5500V；

c)离子源温度TEM:550℃；

d)喷雾气GS1:55psi；

e)辅助加热气GS2:60psi；

f)接口温度ihe:On

g)碰撞气CAD:High；

h)智能MRM^TM时间监测窗口MRM detection window:120s；

i)目标扫描时间Target scan time:0.7s；

j)EP电压：10；

k)CXP电压：13；

其它参数见表4。

表4 各农药的质谱分析参数

4、线性关系：将标准储备液逐级稀释，制备六个不同浓度的系列混合标准工作液，见表5。按浓度从低到高顺序，依照上述色谱条件和质谱条件测定。每一浓度测定3次，按其标准溶液浓度Y(μg/mL)与对应的峰面积平均值X(cps)作标准曲线图，计算回归方程和相关系数，结果见表5。结果表明，205种农药浓度与对应的峰面积呈现良好的线性关系。

表5      205种农药保留时间、线性范围、线性方程、相关系数

5、回收率和精密度：以不含农药的大米空白样品基质，，添加205种农药混合标准溶液添加水平为10μg/kg及50μg/kg，每个浓度水平分别按照QuEChERS方法提取净化，经液相色谱-串联质谱方法(LC-MS/MS)检测，进行6次重复实验，测得205种农药的回收率和精密度，并得到它的平均回收率与精密度。回收率和变异系数计算结果见表6。

表6   大米样品的平均回收率和相对标准偏差(n＝6)

采用QuEChERS方法大米样品进行提取净化:

205种农药在添加水平为10μg/kg时的平均回收率范围为62.4％～127.1％，变异系数范围为1.9％～20.0％；

205种农药在添加水平为50μg/kg时的平均回收率范围为65.9％～120.3％，变异系数范围为1.6％～18.4％，

本发明方法可以达到检测低水平多农药残留的要求。

6、检测低限：以大米的空白样品进行添加试验，以3倍信噪比求得方法对待测的205农药的检出限(LOD)。205种农药的检测低限均低于10μg/kg，满足农药残留限量要求。

7、方法优化过程：

①流动相的选择：由于电喷雾质谱的电离是在溶液状态，因此流动相的组成和添加剂除了影响分析物的保留时间和峰形外，还会影响到分析物的离子化效率，从而影响到目标化合物的检测灵敏度。本实验研究了甲醇－甲酸铵水溶液，乙腈－甲酸铵水溶液，甲醇－甲酸水，甲醇水溶液作为流动相的色谱分离效果。由于甲醇是质子性溶剂，更容易离子化，[M+Na]+峰的响应值要高于乙腈体系的流动相，并且在流动相中添加一定的甲酸铵，可以调节流动相的PH值，增强仪器的响应值，优化峰型，提高灵敏度，有效解决峰拖尾现象，选用甲醇－甲酸铵水溶液作为流动相各农药峰型较好。

②离子扫描模式的选择：本发明涉及的205种农药在负离子扫描模式下质谱响应很弱，而在正离子扫描模式下则得到了明显的分子离子峰。

③质谱条件优化：用多肽类抗生素标准溶液在正离子模式下进行母离子全扫描，选取离子丰度最高的离子为母离子。然后以母离子为目标离子，再通过CE、CXP的调节优化， 选取丰度较高，较为稳定的子离子。最后通过质谱仪的自动优化功能对初步获得的条件进一步优化，并兼顾农药各成分灵敏度的不同而对离子源条件有所偏重，最终建立了质谱条件。

④提取溶剂的选择：对丙酮、乙腈、丙酮-二氯甲烷和乙酸乙酯的提取效果进行了比较。结果表明，采用丙酮、丙酮-二氯甲烷提取时非极性杂质较多，不利于后续的净化，而用乙腈和乙酸乙酯提取时杂质相对较少，其中乙腈的提取效率更高。

⑤样品净化条件的选择：本实验对于大米样品在净化过程中添加PSA做为吸附剂、C18吸附大米样品中的脂肪和脂类等非极性有机物。实验考察了添加400mg的C18、添加800mg的C18与不添加C18，结果显示，当添加了C18以后，净化效果较好，但是有些农药在C18吸附剂中损失较多，因此在本试验中最终选择了C18的加入量为400mg。

Claims (7)

1.一种大米中205种农药残留量的检测方法，其特征在于：按照下述步骤及物质比例进行检测：

(1)样品提取：

将5g大米样品置于50mL离心管中，加入10mL水，加盖，涡旋混合1分钟，再向离心管中加含0.1％乙酸的乙腈5mL，涡旋1分钟，之后加入6g无水硫酸镁与1.5g醋酸钠，剧烈振摇20s，使块状结晶充分散开，4000转/分的标准转速离心5分钟；

(2)样品净化：

取离心后的上清液中取8mL上层溶液，并置于15mL的离心管中，该离心管中之前已经添加了PSA400mg，无水硫酸镁1200mg，C18 400mg，涡旋混合15min，4000转/分的标准转速离心5分钟；

(3)液相色谱-质谱/质谱仪测定：

按照液相色谱－质谱/质谱条件测定样品和标准工作溶液，质谱分离采用在正离子模式下进行母离子全扫描，再对其子离子进行全扫描；通过被测样品的质谱和相关信息，得到其定性和定量结果；定性时应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过规定的范围，则可判断样品中存在对应的被测物；定量测定时采用标准曲线法。

2.根据权利要求1所述的一种大米中205种农药残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中液相色谱分析条件为：

色谱柱：反相C18色谱柱

流动相A：5ml(1M甲酸胺溶液)+895ml二次水+100ml甲醇；

流动相B：5ml(1M甲酸胺溶液)+95ml二次水+900ml甲醇；梯度洗脱；

柱温：40℃

流速：0.4mL/min

进样量：10μL。

3.根据权利要求2所述的一种大米中205种农药残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中液相色谱分析条件为：反相C18色谱柱为作为优选，所述反相C18色谱柱为Phenomenex Synergi 2.5μFusion-RP C18 100A 50×2.0mm (i.d)。

4.根据权利要求2所述的一种大米中205种农药残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中液相色谱分析条件为：梯度洗脱的梯度变化为：

0～1分钟，流动相A100％，流动相B 0％；

1～15分钟，流动相A100～0％，流动相B 0～100％；

15～18分钟，流动相A 0％，流动相B 100％；

18.01分钟，流动相A 100％，流动相B 0％；

18.01～20分钟，流动相A 100％，流动相B 0％。

5.根据权利要求1所述的一种大米中205种农药残留量的检测方法，其特征在于：步骤(3)中所述质谱条件为：

离子源：电喷雾离子源

扫描方式：正离子扫描

检测方式：多反应监测(MRM)

离子化电压IS:+5500V：5500.00V

雾化气(GS1)：55.00Psi

辅助气(GS2)：60.00L/min

气帘气(CUR)：35.00Psi

离子源温度(TEM)：550℃

分别设定母离子、子离子、去簇电压(DP)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞室出口电压(CXP)、碰撞气能量(CE)。

6.根据权利要求1所述的一种大米中205种农药残留量的检测方法，其特征在于：所述步骤(3)中标准工作溶液的配置方法为：

农药混合标准溶液自A组至K组共分10组，见表1，每一组中每种农药标准品的浓度均为100μL/mL乙腈溶液：

表1 205种农药标准溶液

表1 205种农药标准溶液

混合标准储备液：从每组农药混合标准溶液中各取10μL于一个1ml棕色安 瓶中，加900μL乙腈，置于-18℃冰箱中保存；205种农药的浓度相当于1μg/mL；

标准工作溶液：取混合标准储备液0.2mL用甲醇定容至10mL容量瓶中，再根据需要用乙腈将混合标准储备液逐级稀释；逐级稀释浓度为：0.1ng/mL，0.25ng/mL，0.5ng/mL，2ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，15ng/mL，20ng/mL。

7.根据权利要求1-5任一所述的一种大米中205种农药残留量的检测方法，其特征在于：

所述205种农药包括下表2至少一种农药：

表2 205种农药