CN106918656A - 一种检测益心复脉颗粒中153种农药残留的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测益心复脉颗粒中153种农药残留的方法，该方法为液相-质谱联用法，该方法包括以下步骤：供试品溶液的制备、基质混合对照品工作溶液的制备以及使用高效液相色谱-质谱进行检测，其中所述供试品溶液的制备包括以下步骤：益心复脉颗粒粉碎，称取1.8-2.2g益心复脉颗粒，加入80-120μL浓度为5μg/mL的内标溶液，然后加入8-12mL水浸润28-32min后，加入8-12mL含0.08-0.12％醋酸的乙腈溶液，于漩涡混合振荡仪上以4000-6000r/min速率振荡1.8-2.2min，加入3-5g无水硫酸镁和0.08-1.2g醋酸钠，涡旋振摇4-6min，然后以4000-6000r/min的速度离心4-6min，取上清液0.8-1.2mL，加入到预先装有140-460mg无水硫酸镁和23-27mg PSA、48-52mg C18、2.3-2.7mg GCB的离心管中，涡旋振摇2-4min后，以4000-6000r/min的速度离心4-6min，取上清液，经0.2-0.24μm滤膜过滤，即得。

Description

一种检测益心复脉颗粒中153种农药残留的方法

技术领域

本发明涉及一种中药制剂中农药残留物质的检测方法，特别涉及一种检测益心复脉颗粒中153种农残的方法。

背景技术

药物首要的质量特征是安全性。中药的安全性除了自身的物质基础影响外，就是生长、加工、储存、生产等环节中引入的外来有害物质，残留农药就是其中之一。所谓农药残留：指受生长环境的影响或者在中药种植、加工、贮藏过程中使用农药后，残留在药用部位中的农药母体以及有毒理学意义的特殊衍生物，如降解或转化产物、代谢物以及工业杂质等。以农药残留为代表的外源性有害残留物是影响中药质量及安全性的重要因素，已成为中药走向国际市场的瓶颈之一，严重滞后了我国中药材现代化、国际化的步伐。因此，为了保证药品的安全性，必须对农药残留的检测和控制予以足够的重视。

益心复脉颗粒是天津天士力(辽宁)制药有限责任公司出品的药品，其功能主治为益气养阴，活血复脉；用于气阴两虚，心血内阻，胸痹心痛，胸闷不舒，心悸脉结代。具有载药量高、起效快、无异味、携带方便等特性。益心复脉颗粒是由生晒参、黄芪、麦冬、五味子、丹参、川芎6味药材组成的复方制剂，其中

生晒参：具有大补元气，益血，养心安神的作用。生晒参能提高脑、体力活动能力和免疫功能，增强抗应激、抗疲劳、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、益心、复脉、安神生津、补肺健脾。

黄芪：有补气升阳、生血行滞之力，现在药理研究发现，黄芪还可清除氧自由基，减轻机体脂质过氧化损伤。

麦冬：具有甘寒清润，善清心肺之热而养阴除烦，兼可清润胃肠而止渴润燥。抗实验性心律失常、增加冠脉流量。

五味子：是一种具有辛、甘、酸、苦、咸五种药性。选用传统正品北五味入药，品质优良。收敛固涩，益气生津，补肾宁心。用于久嗽虚喘，梦遗滑精，遗尿尿频，久泻不止，自汗，盗汗，津伤口渴，短气脉虚，内热消渴，心悸失眠。

丹参：有活血祛瘀之功，不仅可以抑制血小板聚集，抑制血栓形成而且所含丹参素还可抑制胆固醇的合成、抗细胞氧化。

川芎：活血行气，祛风止痛。可提高血小板中cAMP含量，降低TXA2活性；降低血小板表面活性、抑制血小板聚集、使已聚集血小板解聚。

益心复脉颗粒的药物活性成分很多，主要包括：黄芪甲苷，川芎嗪，三七皂苷，丹参酮等。

本发明意在通过在原有质量控制的基础上，增加了农药残留的检测。

在国际市场上，我国许多出国产品被重金属、农药残留等所谓的绿色壁垒挡住，中药安全性问题成为制约我国中医药发展及国际化的瓶颈。

中药中农药残留一方面是药材生长过程中从环境中如土壤、水源、空气中摄入，另一个原因是农药的不合理使用引起的，如过量使用化学农药或使用已禁用的农药等，其次中药材储存时喷撒农药或中用农药熏蒸以防虫、霉也是污染的原因，另外炮制加工过程中辅料也是引入农药污染的途径之一。

《中国药典》2005年版中农药限量仅规定黄芪和刚才9种有机氯农药，刚才、黄芪、丹参、白芍、西洋参、金银花等六种药材五种重金属，2010年版药典有些增加，但也不多。涉及的农药残留包括有机氯类农药残留量的测定、有机磷农药的测定、拟除虫菊酯类农药残留量测定。

农药残留的检测方法主要分为前处理和检测两部分。其中的前处理又分为提取、净化，其中提取方法应用较多的是振荡法、组织捣碎法、超声法，其中振荡法和超声法最为常见，提取的溶剂则要考虑纯度和极性问题，纯度方面，针对农药残留分析中所应用的溶剂较为特殊，必须经过处理并在色谱条件下检验不含杂质峰，极性方面，采用相似相容原理来选择溶剂，通常情况下，极性小的农药应选择低极性溶剂提取，如六六六、滴滴涕等应选用石油醚、正己烷等溶剂，极性较强的农药，如有机磷、拟除虫菊酯类农药应选择二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮等极性较大的溶剂。

目前，中药中农药残留方法大多采用传统的提取和净化方法，溶剂消耗量大，操作过程繁琐，分析周期长，且易造成环境污染。中药相对于其他作物而言，其成分的特殊性和复杂性对前处理的要求更为严格，一些其他领域较为先进的前处理技术不能直接应用进来。美国农业化学协会(AOAC)制定的方法为指导分析中药茴香中有机氯、有机磷、拟除虫菊酯等农药，认为一般的多种类农药残留前处理方法不能无条件应用于特定中药，需要两种以上的方法方能实现准确定量，然而，这无疑增加了实验的工作量和成本，与农药残留分析的发展趋势背道而驰。

QuEChERS(发音为Catchers)是Quick(快速)、Easy(简单)、Cheap(便宜)、Effective(高效)、Rugged(耐用)和Safe(安全)的缩写，它是用于高含水量食物中农药多残留检测的一种样品处理和净化技术。自2003年Anastassiades和Lehotay等人开发并公布了这个方法以来，QuEChERS大受欢迎。由于它简化了以前繁杂的萃取步骤并且扩大了所萃取农残的范围，因此成为食品分析方法中的一种选择。

QuEChERS被认为是高含水量(80-95％)基质中弄残分析的一种多种类、多残留检测方法由于样品所具有的多种化学性质会与农药残留的性质发生冲突，食品和环境样品中的农药多残留分析很容易出现一些分离上的问题，而且，复杂的样品基质中，可能存在大量的叶绿素、脂类、甾体和其他化合物，会严重干扰样品的分析。

针对益心复脉颗粒，发明人提供了应用液相色谱串联质谱的方法检测益心复脉颗粒中153种农残的方法，该方法灵敏度高、准确、可靠。通过本发明的检测方法可以更加严格的控制产品质量，更加严格的控制产品质量，确保益心复脉颗粒的品质和提高安全性。

发明内容

本发明提供的一种应用液相-质谱联用检测益心复脉颗粒中153种农药残留的方法，该方法包括以下步骤：供试品溶液的制备、基质混合对照品工作溶液的制备以及使用高效液相色谱-质谱进行检测。

本发明所述的方法中：

所述153种农药包括：fenthion-oxon-sulfone(氧倍硫磷砜)、maloxon(马拉氧磷)、bitertanol(联苯三唑醇)、thiamethoxam(噻虫嗪)、thiabendazole(噻菌灵)、admire(吡虫啉)、Fenamiphos(苯线磷)、orthene(乙酰甲胺磷)、fenthion(倍硫磷)、fenthion-oxon(氧倍硫磷)、iprodione(异菌脲)、etrimfos(乙嘧硫磷)、phosmet(亚胺硫磷)、ametryn(莠灭净)、disulfoton(乙拌磷)、diflubenzuron(除虫脲)、chlorophos(敌百虫)、pirimicarb(抗蚜威)、cyprodinil(嘧菌环胺)、pyriproxyfen(吡丙醚)、pretilachlor(丙草胺)、fenchlorphos-oxon(氧皮蝇磷)、ethion(乙硫磷)、monocrotophos(久效磷)、hexazinone(环嗪酮)、propanil(敌稗)、fensulfothion(丰索磷)、mercaptodimethur(灭虫威)、chinomethionate(灭螨猛)、dimethenamid(甲酚噻草胺)、chloantraniliprole(氯虫酰胺)、imazalil(烯菌灵)、ethiofencarb(乙硫苯威)、promecarb(猛杀威)、phoratesulfone(甲拌磷砜)、tolylfluanid(甲苯氟磺胺)、oxadiazon(恶草酮)、Trifloxystrobin(肟菌酯)、Mepronil(灭锈胺)、tau-fluvalinate(氟胺氰菊酯)、Malathion(马拉硫磷)、Phosphamidon(磷胺)、Diazinon(二嗪磷)、Methamidophos(甲胺磷)、Prochloraz(咪酰胺)、Fenthion-Oxon-Sulfoxide(氧倍硫磷亚砜)、Mecarbam(灭蚜磷)、Chlorfenvinfos(毒虫畏)、Paraoxon(乙基对氧磷)、disulfoton-sulfone(乙拌磷砜)、Prothiofos(丙硫磷)、Fenamiphos sulfoxide(苯线磷亚砜)、Phorate(甲拌磷)、pirimiphos-methyl(甲基虫螨磷)、Metalaxyl(甲霜灵)、Triazophos(三唑磷)、Indoxacarb(茚虫威)、isofenphos(异硫磷)、coumaphos(蝇毒磷)、Methidathion(杀扑磷)、Metolcarb(速灭威)、fenthion-sulfon(倍硫磷砜)、Dicrotophos(百治磷)、Thiodicarb(灭多威)、Ethofenprox(醚菊酯)、Benalaxyl(苯霜灵)、Halossifop(吡氟氯禾灵)、Tebuconazole(戊唑醇)、Mocap(丙线磷)、Napropamide(敌草胺)、Diclofenthion(除线磷)、Fonofos(地虫硫磷)、Tetramethrin(胺菊酯)、azinphos-ethyl(益棉磷)、Quinalphos(喹硫磷)、Isoprocarb(异丙威)、Clethodim(烯草酮)、Omethoate(氧化乐果)、Phoxim(辛硫磷)、1,2-dibenzoyl-1-(t-butyl)hydrazine(抑食肼)、Fenthion-sulfoxide(倍硫磷亚砜)、tolclofos-methyl(甲基立枯磷)、Alachlor(甲草胺)、azinphos-methyl(保棉磷)、Propetamphos(胺丙畏)、Profenofos(丙溴磷)、EPN(苯硫膦)、Methoxyfenozide(甲氧虫酰肼)、fluazifop-p-butyl(精吡氟禾草灵)、Propoxur(残杀威)、carbaryl(甲萘威)、Tebufenozide(抑虫肼)、Phosalone(伏杀硫磷)、Machete(丁草胺)、Methacrifos(虫螨畏)、Isoprothiolane(稻瘟灵)、Fenarimol(氯苯嘧啶醇)、boscalid(啶酰菌胺)、Flusilazole(氟硅唑)、Acetamiprid(啶虫脒)、Atrazine(莠去津)、Myclobutanil(腈菌唑)、Flutolanil(氟酰胺)、Pyridaben(哒螨灵)、Propiconazole(丙环唑)、Difenoconazole(苯醚甲环唑)、Edifenphos(克瘟散)、Pyraclostrobine(百克敏)、Phenthoate(稻丰散)、Buprofezin(噻嗪酮)、Paclobutrazol(多效唑)、Tricyclazole(三环唑)、Fosthiazate(噻唑膦)、Demeton(内吸磷)、Dimethoate(乐果)、Fenpyroximate(唑螨酯)、Oxadixyl(恶霜灵)、piperonyl butoxide(胡椒基丁醚)、Sulfotep(治螟磷)、Bioallethrin(丙烯菊酯)、Hexaconazole(己唑醇)、Bifenazate(联苯肼酯)、Azoxystrobin(腈嘧菌酯)、thiacloprid(噻虫啉)、pirimiphos ethyl(嘧啶磷)、n-desethyl-pirimiphos-methyl pestanal(n-去乙基甲基嘧啶磷)、Oxamyl(杀线威)、carbofuran(克百威)、cyhalofop-butyl(氰氟草酯)、Diniconazole(烯唑醇)、Fenbuconazole(腈苯唑)、isofenphos methyl(甲基异柳磷)、Carbofuran(克百威)、Aldicard-sulfoxide(涕灭威亚砜)、aldicard-sulfone(涕灭威砜)、Cadusafos(硫线磷)、fensulfothion-oxon(氧丰索磷)、horate-oxon-sulfone(氧甲拌磷砜)、Propargite(炔螨特)、Molinate(草达灭)、paraoxon-methyl(甲基对氧磷)、Furathiocarb(呋线威)、Disulfoton sulfoxide(乙拌磷亚砜)、Mevinphos(速灭磷)、Aldicarb(涕灭威)、fensulfothion-oxon-sulfone(氧丰索磷砜)、Carbendazim(多菌灵)、phorate-oxon(氧甲拌磷)、Metolachlor(异丙甲草胺)、fensulfothion sulfone(丰索磷砜)、fenamiphos sulfone(苯线磷砜)、Metribuzin(草克净)和Isazophos(氯唑磷).

所述供试品溶液的制备包括以下步骤：

取益心复脉颗粒，加入内标溶液，加水浸润，再加醋酸乙腈溶液混合，加入无水硫酸镁和醋酸钠混合，离心得到上清液1mL，过滤即得；

优选地，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：益心复脉颗粒粉碎，称取1.8-2.2g益心复脉颗粒，加入80-120μL浓度为5μg/mL内标溶液，然后加入8-12mL水浸润28-32min后，加入8-12mL含0.08-0.12％醋酸的乙腈溶液，于漩涡混合振荡仪上以4000-6000r/min速率振荡1.8-2.2min，向离心管中加入3-5g无水硫酸镁和0.08-1.2g醋酸钠，涡旋振摇4-6min，然后以4000-6000r/min的速度离心4-6min，取上清液0.8-1.2mL，加入到预先装有140-460mg无水硫酸镁和23-27mg PSA、48-52mg C18、2.3-2.7mg GCB的离心管中，涡旋振摇2-4min后，以4000-6000r/min的速度离心4-6min，取上清液，经0.2-0.24μm滤膜过滤，即得。

进一步优选，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：益心复脉颗粒经粉碎机粉碎，过2号筛，称取2g益心复脉颗粒，加入100μL浓度为5μg/mL内标溶液，然后加入10mL水浸润30min后，准确加入10mL含0.1％醋酸的乙腈溶液，于漩涡混合振荡仪上以5000r/min速率振荡2min，向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g醋酸钠，涡旋振摇5min，然后以5000r/min的速度离心5min，取上清液1mL，加入到预先装有150mg无水硫酸镁和25mg PSA、50mg C18、2.5mgGCB的离心管中，涡旋振摇3min后，以5000r/min的速度离心5min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，得到滤液。

上述供试品溶液中所用内标物质为氘代莠去津-d5，内标溶液的配制方法如下：将氘代莠去津-d5用乙腈稀释至5mg/L。

更具体的，内标溶液的制备包括以下步骤：

1)取氘代莠去津-d5标准品10mg(精确至0.01mg)，置10mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，制成质量浓度为1.0g/L的内标储备液；

2)内标溶液准确吸取内标储备液适量，用乙腈定量稀释，制成质量浓度为5mg/L的内标溶液，储存于4℃冰箱中。

所述基质混合对照品工作溶液的制备包括：

各农药单标准储备液的配制：取153种农药标准品分别用乙腈溶解，配成质量浓度为0.08-0.12g/L的各农药单标准储备液；

混合储备溶液：分别吸取各农药单标准储备液用0.04-0.06％乙酸乙腈溶液稀释成各农药组分质量浓度均为0.8-1.2mg/L的混合储备溶液；

混合标准工作溶液：取适量的内标溶液和混合储备溶液，得到混合农药的质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100μg/L的标准工作溶液；

基质混合对照品工作溶液：按照供试品溶液的制备步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，将提取液作为溶剂，按照各农药单标准储备液、混合储备溶液、混合标准工作溶液的步骤配制，其中各农药单标准储备液的乙腈用溶剂替换，其余步骤同上，最终得到基质混合对照品工作溶液。

优选地，所述基质混合对照品工作溶液的制备包括：

各农药单标准储备液的配制：取农药标准品10mg，用乙腈溶解，配成质量浓度为1.0g/L的标准储备液，储存于4℃冰箱中备用；

混合标准溶液：分别准确吸取一定体积的各农药单标准储备液，用0.05％乙酸乙腈稀释，配制成各农药组分质量浓度均为1.0mg/L的混合储备溶液，于-20℃冰箱中保存；

混合标准工作溶液：取适量的内标溶液和混合标准溶液，得到混合农药的质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100μg/L的混合标准工作溶液；

基质混合对照品工作溶液：按照供试品溶液的制备步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，将提取液作为溶剂，按照各农药单标准储备液、混合储备溶液、混合标准工作溶液的步骤配制，其中各农药单标准储备液的乙腈用溶剂替换，其余步骤同上，最终得到基质混合对照品工作溶液。

所述UFLC-MS/MS(高效液相色谱-质谱)条件包括色谱条件和质谱条件，其中色谱条件为：色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱，80-120mm×2-2.2mm，1.7-1.9μm及2-2.2mm，0.1-0.3μm的Waters In-Line Filter；流速：0.25～0.4mL/min；进样体积：1.0～3.0μL；流动相A：0.08-0.12％(v/v)甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0min，95％A；1.0～4.0min，95％A～40％A；4.0～14min，40％A～0％A；14.0～15.0min，0％A；15.0～18min，95％A；

质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：按保留时间的多反应监测(Scheduled MRM)模式；离子化电压(IS)：5000～6000V；雾化温度(TEM)：500～600℃；气帘气(CUR)：30～40psi；喷雾气(Gas1)：50～60psi；辅助加热气(Gas2)：50～60psi；碰撞气压力(CAD)：medium。

优选地，色谱条件和质谱条件为：

色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱，100mm×2.1mm，1.8μm及2.1mm，0.2μm的WatersIn-Line Filter；流速：0.25～0.4mL/min；进样体积：1.0～3.0μL；流动相A：0.1％(v/v)甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0min，95％A；1.0～4.0min，95％A～40％A；4.0～14min，40％A～0％A；14.0～15.0min，0％A；15.0～18min，95％A；

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：按保留时间的多反应监测(Scheduled MRM)模式；离子化电压(IS)：5000～6000V；雾化温度(TEM)：500～600℃；气帘气(CUR)：30～40psi；喷雾气(Gas1)：50～60psi；辅助加热气(Gas2)：50～60psi；碰撞气压力(CAD)：medium。

具体的，所述检测方法包括以下步骤：

1)基质混合对照品工作溶液的制备包括：

各农药单标准储备液的配制：取153种农药标准品分别用乙腈溶解，配成质量浓度为0.08-0.12g/L的各农药单标准储备液；

混合储备溶液：分别吸取各农药单标准储备液用0.04-0.06％乙酸乙腈溶液稀释成各农药组分质量浓度均为0.8-1.2mg/L的混合储备溶液；

混合标准工作溶液：取适量的内标溶液和混合储备溶液，得到混合农药的质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100μg/L的标准工作溶液；

基质混合对照品工作溶液：按照供试品溶液的制备步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，将提取液作为溶剂，按照各农药单标准储备液、混合储备溶液、混合标准工作溶液的步骤配制，其中各农药单标准储备液的乙腈用溶剂替换，其余步骤同上，最终得到基质混合对照品工作溶液；

2)供试品溶液的制备：益心复脉颗粒粉碎，称取1.8-2.2g益心复脉颗粒于48-52mL离心管中，加入内标溶液，然后加入8-12mL水浸润28-32min后，加入8-12mL含0.08-0.12％醋酸的乙腈溶液，于漩涡混合振荡仪上以4000-6000r/min速率振荡1.8-2.2min，向离心管中加入3-5g无水硫酸镁和0.08-1.2g醋酸钠，涡旋振摇4-6min，然后以4000-6000r/min的速度离心4-6min，取上清液0.8-1.2mL，置于1.8-2.2mL离心管中，管内预先装有140-460mg无水硫酸镁和23-27mg PSA、48-52mg C18、2.3-2.7mg GCB，涡旋振摇2-4min后，以4000-6000r/min的速度离心4-6min，取上清液，经0.2-0.24μm滤膜过滤，即得；

3)UFLC-MS/MS(高效液相色谱-质谱)条件包括色谱条件和质谱条件，其中色谱条件为：色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱，80-120mm×2-2.2mm，1.7-1.9μm及2-2.2mm，0.1-0.3μm的Waters In-Line Filter；流速：0.25～0.4mL/min；进样体积：1.0～3.0μL；流动相A：0.08-0.12％(v/v)甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0min，95％A；1.0～4.0min，95％A～40％A；4.0～14min，40％A～0％A；14.0～15.0min，0％A；15.0～18min，95％A；

质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：按保留时间的多反应监测(Scheduled MRM)模式；离子化电压(IS)：5000～6000V；雾化温度(TEM)：500～600℃；气帘气(CUR)：30～40psi；喷雾气(Gas1)：50～60psi；辅助加热气(Gas2)：50～60psi；碰撞气压力(CAD)：medium；

4)分别精密吸取供试品溶液和基质混合对照品工作溶液各2μL，注入液相色谱－串联质谱仪，得到色谱图，按内标校正曲线法计算供试品中农药的残留量。

优选地，所述检测方法包括以下步骤：

1)基质混合对照品工作溶液的制备包括：

各农药单标准储备液的配制：取农药标准品10mg，用乙腈溶解，配成质量浓度为1.0g/L的标准储备液，储存于4℃冰箱中备用；

混合标准溶液：分别准确吸取一定体积的各农药单标准储备液，用0.05％乙酸乙腈稀释，配制成各农药组分质量浓度均为1.0mg/L的混合储备溶液，于-20℃冰箱中保存；

混合标准工作溶液：取适量的内标溶液和混合标准溶液，得到混合农药的质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100μg/L的混合标准工作溶液；

基质混合对照品工作溶液：按照供试品溶液的制备步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，将提取液作为溶剂，按照各农药单标准储备液、混合储备溶液、混合标准工作溶液的步骤配制，其中各农药单标准储备液的乙腈用溶剂替换，其余步骤同上，最终得到基质混合对照品工作溶液；

2)供试品溶液的制备：益心复脉颗粒经粉碎机粉碎，过2号筛，称取2g益心复脉颗粒于50mL离心管中，加入适量内标溶液，然后加入10mL水浸润30min后，准确加入10mL含0.1％醋酸的乙腈溶液，于漩涡混合振荡仪上以5000r/min速率振荡2min，向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g醋酸钠，涡旋振摇5min，然后以5000r/min的速度离心5min，取上清液1mL，置于2mL离心管中，管内预先装有150mg无水硫酸镁和25mg PSA、50mg C18、2.5mg GCB，涡旋振摇3min后，以5000r/min的速度离心5min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，得到滤液；

3)色谱条件和质谱条件为色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱，100mm×2.1mm，1.8μm及2.1mm，0.2μm的Waters In-Line Filter；流速：0.25～0.4mL/min；进样体积：1.0～3.0μL；流动相A：0.1％(v/v)甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0min，95％A；1.0～4.0min，95％A～40％A；4.0～14min，40％A～0％A；14.0～15.0min，0％A；15.0～18min，95％A；

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：按保留时间的多反应监测(Scheduled MRM)模式；离子化电压(IS)：5000～6000V；雾化温度(TEM)：500～600℃；气帘气(CUR)：30～40psi；喷雾气(Gas1)：50～60psi；辅助加热气(Gas2)：50～60psi；碰撞气压力(CAD)：medium；

4)分别精密吸取供试品溶液和基质混合对照品工作溶液各2μL，注入液相色谱－串联质谱仪，得到色谱图，按内标校正曲线法计算供试品中农药的残留量。

需要说明的是：在基质混合对照品工作溶液的制备过程中提到的不含目标化合物的空白样品，是不含农药残留的益心复脉颗粒经过供试品溶液的制备方法制备得到的样品。

本发明提供的检测方法具有以下优点：

1、相对于单味中药来说，中药复方制剂尤其是本发明所述的益心复脉颗粒是由生晒参、黄芪、麦冬、五味子、丹参、川芎等多味中药材混合制成的，基质(药物分析领域的专用词，代指样品中被分析物以外的组分)非常复杂，然而，由于简单、快速的QuEChERS方法还不能做到对复杂基质的完全净化，当应用LC-MS/MS联用技术分析痕量农药残留时，仍然存在基质效应而影响检测结果的准确度与可靠性。

本发明通过采用基质匹配校准曲线与内标法相结合的方式补偿基质效应，确保结果的真实、可靠。

用以补偿ME的方法有：基质净化法、同位素内标法、空白基质配制标准溶液和加入分析保护剂等。内标法不仅可以对ME进行校正、保证回收率，而且可对样品处理过程中的变化进行校正，有利于方法的稳定性。但对多种类农药同时检测时，由于存在极性差异，即使是同类物质的同位素内标也很难抵消ME，造成定量结果偏差。而基质匹配标准溶液法(matrix matched standard solution)是按照样品前处理步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，将提取液作为溶剂，配制成标准工作溶液。因此，在本发明中采用基质匹配标准曲线-内标结合法进行校准定量能较好地补偿ME。

2、就农药的稳定性方面来说：一些不稳定农药，尤其是灭螨蜢和甲苯氟磺胺是非常不稳定的，一周内基本降解完全，发明人通过采用配制混合标准溶液时，尝试使用不同酸度的乙腈(0.01％、0.05％、0.1％乙酸)，最终选择0.05％乙酸乙腈。另外，也考察了不同缓冲体系(无缓冲体系、醋酸钠缓冲体系、柠檬酸钠缓冲体系)，确定醋酸钠缓冲体系，并同时考察不同酸度乙腈(0.05％、0.1％、1％醋酸乙腈)，最终确定0.1％醋酸乙腈-醋酸钠体系。采用0.05％乙酸乙腈配制标准溶液及提取步骤使用0.1％醋酸乙腈-醋酸钠缓冲体系，，保证了PH敏感不稳定农药的稳定性，确保结果的准确可靠，并扩大的方法的适用范围。以灭螨蜢为例，如图1(图1为灭螨蜢优化前后回收率的变化)。尽管现有技术如2011年专利已经公开了上述方法，但是因为基质的差异及适用农药种类的不同，本领域技术人员很难通过现有技术得到本发明的方案。

3、与现有技术尤其是CN201110089408.7(公开号为CN02735784A，采育馆的也是类QuEChERS的检测方法检测的，在下面的论述中将该专利申请简称“2011年专利”)中的前处理方法相比，本发明具有以下不同：

①用水浸泡药物时间不同：2011年专利采用的是混匀后放置1小时，本发明中仅需30min，大大节省样品前处理时间。此外，本发明发现随着浸泡时间的延长，农药的回收率并没有增加，反而对于个别农药，由于与药材基质中的物质发生相互作用，回收率降低。例如碱性农药可与基质中的有机酸发生反应等。

③无水硫酸镁和醋酸钠，振摇5min，与无水硫酸镁和氯化钠，涡旋提取1min，二者的区别(1、醋酸钠与氯化钠的区别：之所以选择醋酸钠，是因为醋酸钠和醋酸可组成缓冲体系，使基质处于一个缓和的PH环境中，更有利于PH敏感型农药的稳定；2、振摇5min和涡旋1分钟，应该没太大区别，振摇的目的是充分混匀，利于提取，同时又可避免无水硫酸镁形成结块)

④离心：离心转速5000r/min，共5min，与振荡离心转速3500rpm，离心10mim；(应该没什么区别，只要保证离心充分即可)

⑥混合吸附剂的不同：本发明中吸附剂为150mg无水硫酸镁和25mg PSA、50mgC18、2.5mg GCB，2011年专利所用混合吸附剂的加入量及组成为：1.05g无水硫酸镁，210mgN-丙级乙二胺(PSA)，70mg石墨化碳(GCB)。现有方法如2011年专利使用的是三种混合吸附剂，本发明使用的是四种混合吸附剂，针对益心复脉颗粒(中药制剂)中的153种农药开发的方法，基质比人参中药材更复杂，适用的农药种类及数量更多，因此，本发明的吸附剂应用的范围更广。

同时，因为2011年专利需要净化5mL的提取液，所以需加入较多的净化剂，本发明仅需要净化1mL的提取液，节省了净化剂的使用。

⑥2011年和专利为移取5mL上清液，用氮气吹干，用含甲酸体积分数为0.1％的甲醇和水混合溶液定容至1mL，甲醇和水质量比为3：2，过0.2μm滤膜，得到人参前处理液，待检测；本发明使用的是离心、过微孔滤膜过滤，无需浓缩步骤，操作简单。

⑦本发明中采用0.1％乙酸乙腈作为溶剂，并不是简单的照搬照抄，尽管2011年专利也采用了0.1％乙酸乙腈，但是针对进行震荡提取，发明人曾经采用无缓冲体系、醋酸缓冲体系-1％乙酸乙腈-醋酸钠、柠檬酸钠缓冲体系进行提取，其中醋酸缓冲体系的提取效果最好，为给农药提供一个缓和的基质环境，关于酸度的含量，发明人也本发明进行了不同酸度的考察比如不含酸的乙腈、0.05％乙酸乙腈、0.1％乙酸乙腈、1％乙酸乙腈，通过考察这些不同酸度对农药回收率的影响发现：0.1％乙酸乙腈-醋酸钠体系下，各农药均能获得良好的回收率，尤其是特别有利于PH敏感型农药的稳定性(灭螨蜢、甲苯氟磺胺、氰氟草酯、异菌脲等)。

⑧2011年专利中净化步骤中进行了浓缩(5倍)，检测限做到0.1ng/mL，而本发明中并没有浓缩步骤，并且利用高灵敏度的LC-MS/MS，检测限能做到0.07ng/mL。既省时，灵敏度又高。

⑨关于吸附剂，2011年专利的吸附剂对pH敏感农药不适用，尤其对复杂的中药制剂而言，可能会带来较为严重的基质效应，且该专利中仅用了基质匹配法弥补基质效应，并不能保证定量结果的准确性；此外，该专利中有氮吹步骤，可能会造成很多农药的回收率不合格。

附图说明

图1：灭螨蜢优化前后回收率的变化

图2 153种农药的提取离子流色谱图

图3 153种农药的基质效应分布

图4.不同提取溶剂的考察

图5：三种QuEChERS方法的比较

图6：不同酸度乙腈对个别农药回收率的影响

图7初级萃取液及采用3种前处理方法净化后的萃取液中的共萃取基质的含量

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1

一、实验部分

1、仪器、试剂与材料

QTRAP 5500质谱仪，配有电喷雾离子源、三重四极杆-线性离子阱质量分析器及Analyst 1.6.2工作站(美国AB SCIEX公司)、MultiQuant3.0.2数据处理软件；LC-30ADUFLC液相色谱系统(日本岛津公司)。

乙腈为色谱纯(Honeywell公司)；甲酸铵为色谱级(阿拉丁)，冰醋酸为色谱纯(天津威晨化学试剂科贸有限公司)；无水硫酸镁为优级纯(Sigma-Aldrich)；醋酸钠为分析纯(天津市化学试剂一厂)；乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18、石墨化炭黑(GCB)均为DIKMA科技公司生产。实验用水为Milli-Q纯水系统所制超纯水。

153种农药及氘代莠去津内标标准品(纯度＞95％，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司及农业部环境保护科研监测所)。

益心复脉颗粒(天津天士力(辽宁)制药有限责任公司)。

2、混合标准溶液的配制

2.1各农药单标准储备液的配制：取农药标准品10mg(精确至0.01mg)于10mL量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配成质量浓度为1.0g/L的各农药单标准储备液，储存于4℃冰箱中备用。

2.2混合储备溶液：分别准确吸取一定体积的各农药单标准储备液于10mL量瓶中，用0.05％乙酸乙腈稀释定容，配制成各农药组分质量浓度均为1.0mg/L的混合储备溶液，于-20℃冰箱中保存。

2.3混合标准工作溶液：向5mL量瓶中加入适量氘代莠去津-D₅(内标)溶液及混合储备溶液，得到混合农药的质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100μg/L标准工作溶液。

2.4基质混合对照品工作溶液：按照步骤3提供的样品前处理步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，将提取液作为溶剂，按照2.1、2.2、2.3的步骤配制，其中步骤2.1的乙腈用溶剂替换，其余步骤同上，最终得到基质混合对照品工作溶液。

3、样品前处理

样品经粉碎机粉碎，过2号筛。称取2g益心复脉颗粒于50mL离心管中，加入100μL浓度为5μg/mL的内标溶液，然后加入10mL水浸润30min后，准确加入10mL含0.1％醋酸的乙腈溶液，于漩涡混合振荡仪上以5000r/min速率振荡2min，向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g醋酸钠，涡旋振摇5min，然后离心(5000r/min)5min。取上清液1mL，置于2mL离心管中，管内预先装有150mg无水硫酸镁和25mg PSA、50mg C18、2.5mg GCB，涡旋振摇3min后，离心(5000r/min)5min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，滤液用于分析。

内标溶液的配制方法如下：

1)取氘代莠去津-d5标准品10mg(精确至0.01mg)，置10mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，制成质量浓度为1.0g/L的内标储备液；

2)内标溶液准确吸取内标储备液适量，用乙腈定量稀释，制成质量浓度为5mg/L的内标溶液，储存于4℃冰箱中。

4、UFLC-MS/MS条件

色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱(100mm×2.1mm，1.8μm)及Waters In-LineFilter(2.1mm，0.2μm)；流速：0.25～0.4mL/min；进样体积：1.0～3.0μL；流动相A：0.1％(v/v)甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0min，95％A；1.0～4.0min，95％A～40％A；4.0～14min，40％A～0％A；14.0～15.0min，0％A；15.0～18min，95％A。

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：按保留时间的多反应监测(Scheduled MRM)模式；离子化电压(IS)：5000～6000V；雾化温度(TEM)：500～600℃；气帘气(CUR)：30～40psi；喷雾气(Gas1)：50～60psi；辅助加热气(Gas2)：50～60psi；碰撞气压力(CAD)：medium。

5、分别精密吸取供试品溶液和基质混合对照品工作溶液各2μl，注入液相色谱－串联质谱仪，得到色谱图，按内标校正曲线法计算供试品中农药残留量。

6、采用MS-only模式，针泵进样方式，逐个对单一化合物进行优化。首先进行Q1全扫，找到目标物的母离子，对该母离子做Q2扫描。每个化合物选择2对响应值高的特征离子对作为定量及定性离子对。各农药的质谱参数如表1所示。

应用Scheduled MRM扫描方式，可确保每个色谱峰有足够的采集数据点(每个色谱峰点数在12-20之间)，保证色谱峰的良好峰形及重现性，并提高灵敏度。

153种农药的参数信息及色谱图如表1，图2(图2153种农药的提取离子流色谱图)所示，图2结果说明：在优化的色谱质谱条件下，各化合物的峰形良好，灵敏度高。

表1 153种农药的保留时间、定量及定性离子、质谱参数

*定量离子

**定性离子的响应值/定量离子的响应值

二、结果部分

1、线性

按照1.2下的方法配制，以各组分峰面积与内标峰面积的比值(Y)对各组分质量浓度(X,μg/L)绘制基质加标标准曲线，得回归方程y＝a+bx。结果见表2。

2、基质效应(Matrix effect)

本发明采用以下公式评价基质效应：

当ME％的值大于或小于100％时，代表基质增强或者抑制作用，当ME％的值为100％时，表示不存在基质效应。153种农药的基质效应分布如图3(图3153种农药的基质效应分布)所示。

图3结果说明：由于益心复脉颗粒基质非常复杂，对绝大多数农药产生了明显的强基质效应，并表现为基质增强。说明，采用基质匹配溶液定量是非常有必要的。

3、回收率、定量限实验

本发明采用基质匹配标准曲线-内标法定量。准确称取2g益心复脉颗粒于50mL离心管中，添加水平分别为10、50和100μg/kg，按照1.3节所述的进行样品前处理，每个添加水平重复6次。3个添加水平下农药的平均回收率为70.5％～118.3％，RSD为2.5％～17.56％。向空白基质中添加多个较低水平的农药混合标准溶液，分别进行基质加标试验，每个添加水平重复3次，将能够满足准确度、精密度要求的最低添加水平作为各农药的定量限，定量限均在1～5μg/kg之间结果见表2。

表2.益心复脉颗粒中153种农药的校准曲线、相关系数、方法检定量限及添加回收率

三、条件筛选

1、液质方法的优化

1.1流动相的选择

电喷雾质谱中样品的电离是在溶液状态下进行的，因此流动相的组成和添加剂不仅影响分析物的色谱保留时间和峰形，还会影响分析物的离子化效率，从而影响目标化合物的检测灵敏度。本发明考察了乙腈-水、乙腈-0.1％(v/v)甲酸水、乙腈-0.1％(v/v)甲酸水(含5mM甲酸铵)以及乙腈-0.1％(v/v)甲酸水(含10mM甲酸铵)4种流动相。甲酸的加入，可促进化合物的离子化，因此当流动相中加入0.1％甲酸时，各化合物的响应明显增强。盐的加入，不仅可影响化合物的保留能力、峰形，也可增强或抑制化合物的离子化作用。分别尝试加入5mM、10mM甲酸铵，发现随着盐浓度的增加，化合物的响应逐渐减弱，说明盐对化合物的电离产生抑制作用。依据电喷雾电离的机理，以利于化合物去质子化的乙腈为有机相。因此选择0.1％甲酸溶液-乙腈作为流动相。

1.2色谱柱的选择

根据待测农药性质，一般选择C18色谱柱。本发明共考察了2种色谱柱：1号色谱柱Agilent ZORBAX SB-Aq C18(150mm×2.1mm，3.5μm)；2号色谱柱Acquity HSS T3柱(100mm×2.1mm，1.8μm)；实验发现采用2号高效色谱柱可以实现153种农药较好的分离，峰形好，分析时间短，便于与保护柱连接，且各农药响应好；1号色谱柱分析时间长，且峰形较差；考虑到快速痕量分析的要求，本发明最终选择2号色谱柱。

1.3柱温的确定

对于高效液相色谱分离条件的选择，除了要考虑到流动相的组成、洗脱梯度、色谱柱等，温度也是影响化合物色谱行为的重要因素。本发明考察了30℃、35℃、40℃条件下的影响，30℃时，待测物出峰后移，分析时间延长；40℃，虽然分析速度加快，但温度较高，对分析物的热稳定性(如热稳定差的有机磷农药)产生影响，同时带来色谱柱的稳定性及寿命问题；综合考虑，最终选择35℃作为柱温，既能保证较短的分析时间，又不影响农药的稳定性。

1.4进样体积的选择

本发明根据化合物的灵敏度及峰形，考察了2、3、5μL的进样体积。凭借高灵敏度检测器，化合物的响应非常好，实验中发现使用2μL以上的进样量时，绝大多数的农药的响应值在100ng/mL浓度时已经达到饱和，同时随着进样量的增加，化合物的峰形展宽，因此，本发明选择2μL作为最终的进样体积。

1.5化合物质谱参数的优化

质谱检测的各种条件也是影响分析结果的重要因素之一。本发明对离子源温度、喷雾器、辅助加热气等操作参数进行了系统的优化，结果表明，当离子源温度为550℃、喷雾器压力为55psi、辅助加热气压力为55psi、气帘气压力为35psi、离子化电压为5500psi时，样液中所有农药组分的离子化效率和质谱响应信号均达到最佳。最终，在上述最佳的流动相、色谱柱以及质谱条件下，采用MS-only模式，针泵进样方式，逐个对单一化合物进行优化：(1)母离子扫描：在正离子监测方式下对每种农药进行一级质谱分析，得到每种农药的分子离子峰；(2)子离子扫描：将每种农药的分子离子峰进行二级质谱分析，从中得到碎片离子信息，同时优化每种农药的二级质谱的碰撞气能量(CE)、去簇电压(DP)等参数，选择使每种农药的分子离子与特征碎片离子产生的离子对强度最大时的最佳参数，得到每种农药的二级质谱图。根据二级质谱图提供的碎片离子的质谱强度大小，选择每种农药的定性和定量离子。

1.6质谱扫描方式的选择

在之前的研究中，液相色谱-串联质谱法分析多农残时，通常采用普通的MRM扫描方式，针对上百种农药通常需要分组分析，以保证各化合物均能获得足够的扫描时间及扫描点数。本发明使用Analyst 1.6.2软件，应用按保留时间的多反应监测(Scheduled MRM)扫描方式，根据待测物的数目可自动地为每个化合物分配驻留时间，以确保每个色谱峰有足够的采集数据点(每个色谱峰点数在12-20之间)和良好的峰值。

2前处理方法的优化

2.1浸润剂用量的确定

QuEChERS方法最初设计时是针对含水量大于80％的蔬菜和水果的，而中药制剂含水量较少，直接采用乙腈难以有效提取待分析物，因此需加入一定量的水作为浸润剂，以确保样品中的待分析物容易被提取出来。称取益心复脉颗粒2.0g，分别以1:2.5、1:5和1:7.5(w/v)的比例，加水5mL、10mL和15mL，静置30min。结果显示，5mL水不能使颗粒完全浸润，而15ml水量过多，不仅影响液-液分配效率，降低回收率，而且为后续除水工作增加难度。因此，最终确定以水作为浸润剂，其用量为样品量的5倍，即：益心复脉颗粒取样量为2.0g，添加水量为10mL。

2.2提取溶剂的选择

农药残留检测前处理中常用的提取剂有乙腈、丙酮、乙酸乙酯等，本发明分别考察了这3种溶剂对153种农药的提取效率。与丙酮、乙酸乙酯相比，乙腈为提取溶剂时，所有农药的回收率均能在70％-120％之间，结果满足要求，结果如图4(图4.不同提取溶剂的考察)所示。丙酮虽然可以从样品中很好地提取出残留农药，但是其极性较大、且与水互溶，易将水溶性的极性干扰物(如色素)一并提取出来，使后续的净化步骤难度加大；乙酸乙酯对水的溶解度较低，极性干扰物不易被同时提取，但也无法从含水基质中完全萃取出极性较大的农药，此外，乙酸乙酯不宜直接用作反相色谱的溶剂，在进样前需要转换溶剂，过程繁琐、且易造成提取农药的损失，使部分农药的回收率不能满足定量要求。因此，与丙酮和乙酸乙酯比较，乙腈对农药残留具有相当广泛的极性范围，是一种较为适宜的提取溶剂。

2.3三个版本的比较

本发明对QuECHERS的三个版本进行了比较评估。具体操作为(1)10mL水+10mL1％醋酸乙腈+1.5g氯化钠+6g无水硫酸镁(醋酸缓冲体系)；(2)10mL水+10mL乙腈+1g氯化钠+0.5g柠檬酸氢二钠+1g二水合柠檬酸三钠(柠檬酸三钠)+6g无水硫酸镁(柠檬酸缓冲体系)；(3)10mL水+10mL乙腈+1.5g氯化钠+6g无水硫酸镁(无缓冲体系)。结果见图5(图5：三种QuEChERS方法的比较)，图5结果显示，在在QuECHERS三个版本中，在醋酸钠缓冲体系下，农药的平均回收率最高。

三个版本之间的重要区别是不同无机盐的使用，它可以影响基质的pH值和缓冲系统的存在或不存在。本发明更倾向于以醋酸缓冲为最终版本，因为它有利各种理化性质的农药，尤其是pH敏感型农药获得满意的回收率。

2.4提取溶剂酸度的优化

在研究中，为给农药提供较为缓和的基质环境，本发明对不同酸度的乙腈(0.05％(v/v)、0.1％(v/v)、1％(v/v)和2％(v/v)冰醋酸)进行测试。

结果表明，在这些缓冲系统中，使用0.1％(v/v)冰醋酸乙腈作为提取溶剂时，获得最高的回收率，更有利于pH敏感型农药的稳定。这可能是因为这种缓冲体系下，基质的pH值保持在4.8～5.0的范围，有利于不稳定及pH依赖型农药(灭螨蜢、甲苯氟磺胺)的稳定。如图6(图6：不同酸度乙腈对个别农药回收率的影响)所示。

2.5净化剂的优化

QuEChERS方法中常用的净化剂有PSA、C18、GCB等吸附剂。其中，PSA能除去极性基质成分，如脂肪酸、糖类和某些极性亲脂性色素；GCB(石墨化碳黑)多用于除去叶绿素、类胡萝卜素等色素类成分；C18可除去脂肪和脂类等非极性物质。

本发明考察了不同吸附剂及其用量对153种农药的影响。当PSA用量(0、15、25、35、50、75mg)为25mg时，153种农药的平均回收率最高；加入C18(0、15、25、35、50、75mg)，多种农药的平均回收率未见显著变化，当C18用量超过50mg时，灭螨蜢和甲胺磷的回收率却随C18用量的增加显著降低；GCB虽然可以吸附色素，但对平面型结构的农药也具有吸附作用，如联苯肼酯、甲苯氟磺胺等农药的回收率随着GCB用量(0、1.5、2.5、3.5、5mg)的增加逐渐降低，可能由于GCB对两者产生了吸附作用。

分别对净化剂乙二胺-N-丙基硅烷PSA(0、15、25、35、50、75mg)，C18(0、15、25、35、50、75mg)，石墨化炭黑GCB(0、1.5、2.5、3.5、5mg)的不同用量进行优化，同时通过测定净化前与净化后剩余残渣量比较不同组合方式的净化效果，如图7(图7初级萃取液及采用3种前处理方法净化后的萃取液中的共萃取基质的含量)所示。

综述所述，本发明最终确定吸附剂的用量为25mg PSA、50mg C18、2.5mg GCB，既保证各化合物获得良好的回收率，又能确保较好的净化效果，剩余残渣量最少，说明这种组合方式的净化效果最佳。

Claims (10)

1.一种检测益心复脉颗粒中153种农药残留的方法，该方法为液相-质谱联用法，所述153种农药为氧倍硫磷砜、马拉氧磷、联苯三唑醇、噻虫嗪、噻菌灵、吡虫啉、苯线磷、乙酰甲胺磷、倍硫磷、氧倍硫磷、异菌脲、乙嘧硫磷、亚胺硫磷、莠灭净、乙拌磷、除虫脲、敌百虫、抗蚜威、嘧菌环胺、吡丙醚、丙草胺、氧皮蝇磷、乙硫磷、久效磷、环嗪酮、敌稗、丰索磷、灭虫威、灭螨猛、甲酚噻草胺-p、氯虫酰胺、烯菌灵、乙硫苯威、猛杀威、甲拌磷砜、甲苯氟磺胺、恶草酮、肟菌酯、灭锈胺、氟胺氰菊酯、马拉硫磷、磷胺、二嗪磷、甲胺磷、咪酰胺、氧倍硫磷亚砜、灭蚜磷、毒虫畏、对氧磷(乙基)、乙拌磷砜、丙硫磷、苯线磷亚砜、甲拌磷、甲基嘧啶磷、甲霜灵、三唑磷、茚虫威、异柳磷、蝇毒磷、杀扑磷、速灭威、倍硫磷砜、百治磷、灭多威、醚菊酯、苯霜灵、吡氟氯禾灵、戊唑醇、灭线磷、敌草胺、除线磷、地虫磷、胺菊酯、益棉磷、喹硫磷、异丙威、烯草酮、氧乐果、辛硫磷、抑食肼、倍硫磷亚砜、甲基立枯磷、甲草胺、保棉磷、胺丙畏、丙溴磷、苯硫磷、甲氧虫酰肼、精吡氟禾草灵、残杀威、甲萘威、虫酰肼、伏杀硫磷、丁草胺、虫螨畏、稻瘟灵、氯苯嘧啶醇、啶酰菌胺、氟硅唑、啶虫脒、莠去津、腈菌唑、氟酰胺、哒螨灵、丙环唑、苯醚甲环唑、克瘟散、百克敏、稻丰散、噻嗪酮、多效唑、三环唑、噻唑膦、内吸磷-O-S、乐果、唑螨酯、恶霜灵、胡椒基丁醚、治螟磷、丙烯菊酯、己唑醇、联苯肼酯、腈嘧菌酯、噻虫啉、嘧啶磷、N-去乙基甲基嘧啶磷、杀线威、3-羟基-克百威、氰氟草酯、烯唑醇、腈苯唑、甲基异柳磷、克百威、涕灭威亚砜、涕灭威砜、硫线磷、氧丰索磷、氧甲拌磷砜、炔螨特、草达灭、甲基对氧磷、呋线威、乙拌磷亚砜、速灭磷、涕灭威、氧丰索磷砜、多菌灵、氧甲拌磷、异丙甲草胺、丰索磷砜、苯线磷砜、草克净、氯唑磷和氘代莠去津。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：供试品溶液的制备、基质混合对照品工作溶液的制备以及使用高效液相色谱-质谱进行检测。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述供试品溶液的制备包括以下步骤：益心复脉颗粒粉碎，称取1.8-2.2g益心复脉颗粒，加入80-120μL浓度为5μg/mL的内标溶液，然后加入8-12mL水浸润28-32min后，加入8-12mL含0.08-0.12％醋酸的乙腈溶液，于漩涡混合振荡仪上以4000-6000r/min速率振荡1.8-2.2min，加入3-5g无水硫酸镁和0.08-1.2g醋酸钠，涡旋振摇4-6min，然后以4000-6000r/min的速度离心4-6min，取上清液0.8-1.2mL，加入到预先装有140-460mg无水硫酸镁和23-27mg PSA、48-52mg C18、2.3-2.7mgGCB的离心管中，涡旋振摇2-4min后，以4000-6000r/min的速度离心4-6min，取上清液，经0.2-0.24μm滤膜过滤，即得。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的制备包括以下步骤：益心复脉颗粒经粉碎机粉碎，过2号筛，称取2g益心复脉颗粒，加入100μL浓度为5μg/mL的内标溶液，然后加入10mL水浸润30min后，准确加入10mL含0.1％醋酸的乙腈溶液，于漩涡混合振荡仪上以5000r/min速率振荡2min，加入4g无水硫酸镁和1g醋酸钠，涡旋振摇5min，然后以5000r/min的速度离心5min，取上清液1mL，加入到预先装有150mg无水硫酸镁和25mg PSA、50mg C18、2.5mg GCB的离心管中，涡旋振摇3min后，以5000r/min的速度离心5min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，得到滤液。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基质混合对照品工作溶液的制备包括：

各农药单标准储备液的配制：取153种农药标准品分别用乙腈溶解，配成质量浓度为0.08-0.12g/L的各农药单标准储备液；

混合储备溶液：分别吸取各农药单标准储备液用0.04-0.06％乙酸乙腈溶液稀释成各农药组分质量浓度均为0.8-1.2mg/L的混合储备溶液；

混合标准工作溶液：取适量的内标溶液和混合储备溶液，得到混合农药的质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100μg/L的标准工作溶液；

基质混合对照品工作溶液：按照如权利要求3所述的供试品溶液的制备步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，将提取液作为溶剂，按照各农药单标准储备液、混合储备溶液、混合标准工作溶液的步骤配制，其中各农药单标准储备液的乙腈用溶剂替换，其余步骤同上，最终得到基质混合对照品工作溶液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基质混合对照品工作溶液的制备包括：

各农药单标准储备液的配制：取农药标准品10mg，用乙腈溶解，配成质量浓度为1.0g/L的标准储备液，储存于4℃冰箱中备用；

混合标准溶液：分别准确吸取一定体积的各农药单标准储备液，用0.05％乙酸乙腈稀释，配制成各农药组分质量浓度均为1.0mg/L的混合储备溶液，于-20℃冰箱中保存；

混合标准工作溶液：取适量的内标溶液和混合标准溶液，得到混合农药的质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100μg/L的混合标准工作溶液；

基质混合对照品工作溶液：按照如权利要求4所述的供试品溶液的制备步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，将提取液作为溶剂，按照各农药单标准储备液、混合储备溶液、混合标准工作溶液的步骤配制，其中各农药单标准储备液的乙腈用溶剂替换，其余步骤同上，最终得到基质混合对照品工作溶液。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，其中所述UFLC-MS/MS(高效液相色谱-质谱)条件包括色谱条件和质谱条件，其中色谱条件为：色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱，80-120mm×2-2.2mm，1.7-1.9μm及2-2.2mm，0.1-0.3μm的Waters In-Line Filter；流速：0.25～0.4mL/min；进样体积：1.0～3.0μL；流动相A：0.08-0.12％(v/v)甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0min，95％A；1.0～4.0min，95％A～40％A；4.0～14min，40％A～0％A；14.0～15.0min，0％A；15.0～18min，95％A；

质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：按保留时间的多反应监测(Scheduled MRM)模式；离子化电压(IS)：5000～6000V；雾化温度(TEM)：500～600℃；气帘气(CUR)：30～40psi；喷雾气(Gas1)：50～60psi；辅助加热气(Gas2)：50～60psi；碰撞气压力(CAD)：medium。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，色谱条件和质谱条件为色谱柱：AcquityUPLC HSS T3柱，100mm×2.1mm，1.8μm及2.1mm，0.2μm的Waters In-Line Filter；流速：0.25～0.4mL/min；进样体积：1.0～3.0μL；流动相A：0.1％(v/v)甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0min，95％A；1.0～4.0min，95％A～40％A；4.0～14min，40％A～0％A；14.0～15.0min，0％A；15.0～18min，95％A；

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：按保留时间的多反应监测(Scheduled MRM)模式；离子化电压(IS)：5000～6000V；雾化温度(TEM)：500～600℃；气帘气(CUR)：30～40psi；喷雾气(Gas1)：50～60psi；辅助加热气(Gas2)：50～60psi；碰撞气压力(CAD)：medium。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1)基质混合对照品工作溶液的制备包括：

各农药单标准储备液的配制：取153种农药标准品分别用乙腈溶解，配成质量浓度为0.08-0.12g/L的各农药单标准储备液；

混合储备溶液：分别吸取各农药单标准储备液用0.04-0.06％乙酸乙腈溶液稀释成各农药组分质量浓度均为0.8-1.2mg/L的混合储备溶液；

混合标准工作溶液：取适量的内标溶液和混合储备溶液，得到混合农药的质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100μg/L的标准工作溶液；

基质混合对照品工作溶液：按照如权利要求3所述的供试品溶液的制备步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，将提取液作为溶剂，按照各农药单标准储备液、混合储备溶液、混合标准工作溶液的步骤配制，其中各农药单标准储备液的乙腈用溶剂替换，其余步骤同上，最终得到基质混合对照品工作溶液；

2)供试品溶液的制备：益心复脉颗粒粉碎，称取1.8-2.2g益心复脉颗粒于48-52mL离心管中，加入内标溶液，然后加入8-12mL水浸润28-32min后，加入8-12mL含0.08-0.12％醋酸的乙腈溶液，于漩涡混合振荡仪上以4000-6000r/min速率振荡1.8-2.2min，向离心管中加入3-5g无水硫酸镁和0.08-1.2g醋酸钠，涡旋振摇4-6min，然后以4000-6000r/min的速度离心4-6min，取上清液0.8-1.2mL，置于1.8-2.2mL离心管中，管内预先装有140-460mg无水硫酸镁和23-27mg PSA、48-52mg C18、2.3-2.7mg GCB，涡旋振摇2-4min后，以4000-6000r/min的速度离心4-6min，取上清液，经0.2-0.24μm滤膜过滤，即得；

3)UFLC-MS/MS(高效液相色谱-质谱)条件包括色谱条件和质谱条件，其中色谱条件为：色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱，80-120mm×2-2.2mm，1.7-1.9μm及2-2.2mm，0.1-0.3μm的Waters In-Line Filter；流速：0.25～0.4mL/min；进样体积：1.0～3.0μL；流动相A：0.08-0.12％(v/v)甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0min，95％A；1.0～4.0min，95％A～40％A；4.0～14min，40％A～0％A；14.0～15.0min，0％A；15.0～18min，95％A；

质谱条件为：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：按保留时间的多反应监测(Scheduled MRM)模式；离子化电压(IS)：5000～6000V；雾化温度(TEM)：500～600℃；气帘气(CUR)：30～40psi；喷雾气(Gas1)：50～60psi；辅助加热气(Gas2)：50～60psi；碰撞气压力(CAD)：medium；

4)分别精密吸取供试品溶液和基质混合对照品工作溶液各2μl，注入液相色谱－串联质谱仪，得到色谱图，按内标校正曲线法计算供试品中农药残留量。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1)各农药单标准储备液的配制：取农药标准品10mg，用乙腈溶解，配成质量浓度为1.0g/L的标准储备液，储存于4℃冰箱中备用；

混合标准溶液：分别准确吸取一定体积的各农药单标准储备液，用0.05％乙酸乙腈稀释，配制成各农药组分质量浓度均为1.0mg/L的混合储备溶液，于-20℃冰箱中保存；

混合标准工作溶液：取适量的内标溶液和混合标准溶液，得到混合农药的质量浓度分别为1、2、5、10、20、50、100μg/L的混合标准工作溶液；

基质混合对照品工作溶液：按照如权利要求4所述的供试品溶液的制备步骤提取不含目标化合物的“空白”样品，将提取液作为溶剂，按照各农药单标准储备液、混合储备溶液、混合标准工作溶液的步骤配制，其中各农药单标准储备液的乙腈用溶剂替换，其余步骤同上，最终得到基质混合对照品工作溶液；

2)供试品溶液的制备：益心复脉颗粒经粉碎机粉碎，过2号筛，称取2g益心复脉颗粒于50mL离心管中，加入适量内标溶液，然后加入10mL水浸润30min后，准确加入10mL含0.1％醋酸的乙腈溶液，于漩涡混合振荡仪上以5000r/min速率振荡2min，向离心管中加入4g无水硫酸镁和1g醋酸钠，涡旋振摇5min，然后以5000r/min的速度离心5min，取上清液1mL，置于2mL离心管中，管内预先装有150mg无水硫酸镁和25mg PSA、50mg C18、2.5mg GCB，涡旋振摇3min后，以5000r/min的速度离心5min，取上清液，经0.22μm滤膜过滤，得到滤液；

3)色谱条件和质谱条件为色谱柱：Acquity UPLC HSS T3柱，100mm×2.1mm，1.8μm及2.1mm，0.2μm的Waters In-Line Filter；流速：0.25～0.4mL/min；进样体积：1.0～3.0μL；流动相A：0.1％(v/v)甲酸水，流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～1.0min，95％A；1.0～4.0min，95％A～40％A；4.0～14min，40％A～0％A；14.0～15.0min，0％A；15.0～18min，95％A；

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：按保留时间的多反应监测(Scheduled MRM)模式；离子化电压(IS)：5000～6000V；雾化温度(TEM)：500～600℃；气帘气(CUR)：30～40psi；喷雾气(Gas1)：50～60psi；辅助加热气(Gas2)：50～60psi；碰撞气压力(CAD)：medium；

4)分别精密吸取供试品溶液和基质混合对照品工作溶液各2μl，注入液相色谱－串联质谱仪，得到色谱图，按内标校正曲线法计算供试品中农药残留量。