CN112858542B - 测定叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法 - Google Patents

测定叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法 Download PDF

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Abstract

本发明属于植物代谢物检测技术领域，公开了一种测定叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法，利用QuEChERS方法，对植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物残留测定过程中的各种影响因素进行分析，并结合HPLC‑MS‑MS法进行检测。加入乙腈，漩涡混合，加入盐析材料，漩涡混匀后，室温超声提取，离心；取上清液到离心管，加净化剂无水硫酸钠，C18净化，漩涡混匀，上清液过有机相微孔滤膜，吸取滤液用液相色谱质谱仪测定。本发明具有操作简便、净化效果好、回收率高、灵敏度高等优点，可为东北黑土地农业作物和植物样品的农药莠去津、吡虫啉及其代谢物残留的监测提供理论依据和技术支撑。

Description

测定叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法
技术领域
本发明属于植物代谢物检测技术领域，尤其涉及一种测定叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法。
背景技术
目前，莠去津(atrazine)化学名称:2-氯-4-二乙胺基-6-异丙胺基-1,3,5-三嗪，是一种三氮苯类除草剂主要用于玉米、高粱和甘蔗等作物田防除各种阔叶杂草及一年生禾本科杂草,对多年生杂草也有一定的抑制效果。莠去津因其残留期较长、水溶性较高、应用量大和施用范围广而导致其对环境的影响日益突出。美国卫生与社会服务部报告称，长期暴露在莠去津中，人的免疫系统、淋巴系统、生殖系统和内分泌系统都会受到影响,有可能产生畸形、诱导有机体突变。另有发明报道，莠去津可能对人体具有致癌性，长期接触莠去津会引发卵巢癌和乳腺癌。
吡虫啉(Imidacloprid，IMI)名称为1-(6-氯3-吡啶甲基)-N-硝基咪唑-2-亚胺，是具有氯吡啶结构的第一代烟碱类杀虫剂的代表性药剂，其广泛应用于农业生产上，针对水稻、棉花、小麦等多种害虫有良好的治疗效果。
吡虫啉的药效基团为硝基亚胺，发明表明，吡虫啉的代谢大多是药效基团上发生去烷基、去饱和化、羟基化及还原等代谢反应，从而生成吡虫啉胍、烯式吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸等代谢产物。吡虫啉的部分代谢产物，比如烯式吡虫啉，其毒性比母体吡虫啉的高约10～16倍，又比如吡虫啉羟基化后的代谢产物也有一定的杀虫活性等。通常，在植物生长期间，莠去津和吡虫啉会同时使用，因此，建立一种莠去津和吡虫啉及其代谢物同时测定的分析方法是十分必要的。
莠去津、吡虫啉的测定方法主要包括气相色谱方法、液相色谱方法、气相色谱质谱联用方法、液相色谱-质谱联用方法。但是吡虫啉代谢物的测定方法相对较少，主要采用液相色谱质谱方法。
而莠去津、吡虫啉及其代谢物吡虫啉胍、烯式吡虫啉、吡虫啉脲和6-氯烟酸的同时测定还未见报道。
植物样品中农药残留测定的前处理方法通常有固相萃取(SPE)、索氏提取、微波辅助提取以及快速溶剂提取方法(ASE)等。而QuEChERS(Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)方法作为一种操作简单、快速及高效的前处理方法，已被广泛用于植物中农药残留测定。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)莠去津的测定多集中于土壤和水质中的残留测定，植物中莠去津的残留测定较少，且样品处理流程长，过程复杂，有机溶剂用量多，净化效果差。
(2)吡虫啉的测定多集中于食品中吡虫啉自身的残留，其代谢物的研究较少，同时本发明提及的植物中的四种代谢物的研究未见。
(3)现有技术测定方法复杂、准确性差，不能满足植物样品中莠去津、吡虫啉及其代谢物的同时测定。
解决以上问题及缺陷的难度为：
解决以上问题及缺陷的难度主要体现在选择合适的样品提取溶剂；确定优化的净化剂；最佳的色谱-质谱条件。
解决以上问题及缺陷的意义为：
本发明通过建立一种测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法，从而可以进一步研究莠去津、吡虫啉在植物及农作物中的代谢机理及降解产物类型，开展多种农药残留风险评估，从而提高农作物产量，合理开展田间农药施用，保护土壤和水质的安全都有显著的促进作用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种测定叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法。
本发明是这样实现的，一种测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法，所述测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法包括：
根据植物叶片的特性，利用QuEChERS方法(基质分散固相萃取方法-Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe)，对植物叶片中莠去津、吡虫啉及所述植物叶片代谢物，残留测定过程中的各种影响因素进行分析；并结合HPLC-MS-MS法对所述莠去津、吡虫啉及植物叶片代谢物的含量进行检测
进一步，所述测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法具体包括：
步骤一，提取与净化：称取植物叶片于离心管中，加入乙腈，漩涡混合，加入盐析材料，漩涡混匀后，室温超声提取，离心；取上清液到离心管，加净化剂无水硫酸钠，C18净化，漩涡混匀，上清液过有机相微孔滤膜，吸取滤液用液相色谱质谱仪测定；
步骤二，液相色谱参考条件：色谱柱：Brownlee SPP C18，2.1×100mm，粒度2.7μm；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；样品室温度：8℃；流动相：A为0.1％(体积分数)甲酸水溶液，B为乙腈；利用流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱；
步骤三，质谱分析条件：电离方式：ESI；正离子模式；检测方式：MRM；反吹干燥气流量100mL/min；热表面诱导去溶剂。
进一步，所述步骤一中，漩涡混匀后，室温超声提取3min，于4000r/min离心5min；取上清液1.0mL到10mL离心管，加净化剂150mg无水硫酸钠，50mg C18净化，漩涡混匀30s，上清液过0.22μm有机相微孔滤膜，吸取2.0μL滤液用液相色谱质谱仪测定。
所述步骤二中，
流动相梯度洗脱程序如下：
进一步，所述步骤一进行前，需进行：
莠去津标准溶液配置：
吸取100μL的100μg/mL莠去津贮备液，用甲醇+水(1+1)配制成10μg/mL的标准溶液；
吡虫啉及代谢物的混合贮备液：
分别称取一定量的吡虫啉、吡虫啉胍、吡虫啉脲、吡虫啉烯、6-氯烟酸，用甲醇+水(1+1)配制成2000μg/mL的贮备液；
吡虫啉及代谢物的混合中间液：
吸取一定量的2000μg/mL的贮备液，用甲醇+水(1+1)逐级稀释到100μg/mL和10μg/ml；
莠去津和吡虫啉及其代谢物的混合标准贮备溶液：1.0μg/mL；
吸取一定量的莠去津及吡虫啉及其代谢物混合中间液，用50％：50％甲醇水稀释至1.0μg/mL；
基质空白溶液：
将绿萝和棉花叶片的阴性样品按照样品处理得到的溶液。
所述步骤一进行前，还需进行：
试样制备与保存：取代表性样品100g，用粉碎机粉碎。混匀，均分成两份作为试样，分装，密闭，于-18C保存。
进一步，所述步骤三后，还需进行：工作曲线的配制：
吸取一定量的1.0μg/mL莠去津及吡虫啉等混合标准溶液，用初始流动相95％：5％分别稀释至5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500ng/mlL。
所述步骤三后，还需进行：基质工作曲线的配制：
吸取一定量的1.0μg/mL莠去津及吡虫啉等混合标准溶液，用基质空白溶液及溶剂空白溶液，分别稀释至5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500ng/mL。
所述HPLC-MS-MS法进行检测的线性方程包括：
莠去津y＝82.55085x+148.4；
吡虫啉y＝21.08769x+155.52；
6-氯烟酸y＝22.70847x-114.01695；
吡虫啉胍y＝106.6x-533.7039；
吡虫啉烯y＝17.6517x-55.16857；
吡虫啉脲y＝58.93802x+138.6。
本方法的线性范围：5-500ng/ml。
本发明的另一目的在于提供一种所述测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法在玉米、高粱、甘蔗水稻、棉花、小麦作物有害物质检测上的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
本发明利用实验室内种植的盆栽棉花叶片和绿萝叶片为基础，进行植物叶片莠去津、吡虫啉及其代谢物残留量的测定方法分析，根据植物叶片的特性，利用QuEChERS方法，对植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物残留测定过程中的各种影响因素进行了分析，并结合HPLC-MS-MS法进行检测。结果表明，本方法简单、快速、准确，可满足植物样品中莠去津、吡虫啉及其代谢物的同时测定。
本发明建立了植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物残留的串联三重四级杆液相色谱质谱的分析方法。基于QuEChERS方法进行前处理，优化了QuEChERS提取剂类型、净化剂种类和用量。从流动相的梯度洗脱程序、进样体积和流速入手，优化了液相色谱条件，在有效去除基质中杂质干扰的基础上，采用HPLC-MS/MS对样品进行定量分析，验证了方法的线性范围、线性方程、检出限、定量限、加标回收率及相对标准偏差(RSD)等性能参数，同时考察了方法的基体效应。该方法的三个水平的添加回收率在91.1％～102.7％之间，RSD为3.3％～11.7％之间。线性范围为5～500.00ng/mL。该方法具有操作简便、净化效果好、回收率高、灵敏度高等优点，可为东北黑土地农业作物和植物样品的农药莠去津、吡虫啉及其代谢物残留的监测提供理论依据和技术支撑。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法流程图。
图2是本发明实施例提供的提取剂的选择图。
图3是本发明实施例提供的净化剂的选择图。
图4是本发明实施例提供的C18的不同用量对待测组分回收率的影响图。
图5是本发明实施例提供的50.0ng/ml的标准溶液的总离子流图。
图6是本发明实施例提供的6-烟酸的工作曲线图。
图7是本发明实施例提供的吡虫啉胍的工作曲线图。
图8是本发明实施例提供的吡虫啉的工作曲线图。
图9是本发明实施例提供的吡虫啉脲的工作曲线图。
图10是本发明实施例提供的吡虫啉烯的工作曲线图。
图11是本发明实施例提供的吡虫啉烯的工作曲线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法，下面结合附图对本发明作详细的描述。
如图1所示，测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法具体包括：
S101，提取与净化：称取植物叶片于离心管中，加入乙腈，漩涡混合，加入盐析材料，漩涡混匀后，室温超声提取，离心；取上清液到离心管，加净化剂无水硫酸钠，C18净化，漩涡混匀，上清液过有机相微孔滤膜，吸取滤液用液相色谱质谱仪测定；
S102，液相色谱参考条件：色谱柱：Brownlee SPP C18，2.1×100mm，粒度2.7μm；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；样品室温度：8℃；流动相：A为0.1％(体积分数)甲酸水溶液，B为乙腈；利用流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱；
S103，质谱分析条件：电离方式：ESI；正离子模式；检测方式：MRM；反吹干燥气流量100mL/min；热表面诱导去溶剂。
所述步骤S101中，漩涡混匀后，室温超声提取3min，于4000r/min离心5min；取上清液1.0mL到10mL离心管，加净化剂150mg无水硫酸钠，50mg C18净化，漩涡混匀30s，上清液过0.22μm有机相微孔滤膜，吸取2.0μL滤液用液相色谱质谱仪测定。
所述步骤S102中，
流动相梯度洗脱程序如下：
所述步骤S101进行前，需进行：
莠去津标准溶液配置：
吸取100μL的100μg/mL莠去津贮备液，用甲醇+水(1+1)配制成10μg/mL的标准溶液；
吡虫啉及代谢物的混合贮备液：
分别称取一定量的吡虫啉、吡虫啉胍、吡虫啉脲、吡虫啉烯、6-氯烟酸，用甲醇+水(1+1)配制成2000μg/mL的贮备液；
吡虫啉及代谢物的混合中间液：
吸取一定量的2000μg/mL的贮备液，用甲醇+水(1+1)逐级稀释到100μg/mL和10μg/mL；
莠去津和吡虫啉及其代谢物的混合标准贮备溶液：1.0μg/mL；
吸取一定量的莠去津及吡虫啉及其代谢物混合中间液，用50％：50％甲醇水稀释至1.0μg/mL；
基质空白溶液：
将绿萝和棉花叶片的阴性样品按照样品处理得到的溶液。
所述步骤S101进行前，还需进行：
试样制备与保存：取代表性样品100g，用粉碎机粉碎。混匀，均分成两份作为试样，分装，密闭，于-18C保存。
进一步，所述步骤三后，还需进行：工作曲线的配制：
吸取一定量的1.0μg/mL莠去津及吡虫啉等混合标准溶液，用初始流动相95％：5％分别稀释至5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500ng/mL。
所述步骤S103后，还需进行：基质工作曲线的配制：
吸取一定量的1.0μg/mL莠去津及吡虫啉等混合标准溶液，用基质空白溶液及溶剂空白溶液，分别稀释至5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500ng/mL。
所述HPLC-MS-MS法进行检测的线性方程包括：
莠去津y＝82.55085x+148.4；
吡虫啉y＝21.08769x+155.52；
6-氯烟酸y＝22.70847x-114.01695；
吡虫啉胍y＝106.6x-533.7039；
吡虫啉烯y＝17.6517x-55.16857；
吡虫啉脲y＝58.93802x+138.6。
下面结合具体实验对本发明的技术方案作进一步描述。
1、实验部分
1.1设备、试剂和材料
所用试剂均为色谱级，
QSight 220型液质联用仪(PE公司)，配有电喷雾离子源(ESI)；分析天平：
感量分别为0.01mg和0.01g；KQ 5200E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；XW-80A微型漩涡混合仪，转速：2800r/s上海沪西分析仪器厂有限公司；Anke TDL-40B离心机：转速4000r/min。上海安亭科学仪器厂；粉碎机(小熊电器公司)；乙腈，色谱纯，美国DikmaPure公司；甲酸，色谱纯，美国Honeywell公司；高温蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司；甲醇，色谱纯，美国TEDIA公司；十八烷基硅烷(ODS)键合相吸附剂(C18：40μm～60μm)；N-丙基乙二胺(PSA 40～60μm)；石墨化炭黑(GCB 120-400μm)：均购自深圳逗点公司；基质分散材料(EN方法)：深圳逗点公司；0.22μm微孔滤膜；50mL聚乙烯具塞离心管；10mL玻璃离心管。无水硫酸钠：分析纯；莠去津标准溶液：100μg/mL，农业部环境科学发明所；吡虫啉、吡虫啉胍、吡虫啉脲、吡虫啉烯、6-氯烟酸均为纯品，纯度99％，德国Augsburg公司)。
1.2标准溶液的配制
莠去津标准溶液：
吸取100μL的100μg/mL莠去津贮备液，用甲醇+水(1+1)配制成10μg/mL的标准溶液。
吡虫啉及代谢物的混合贮备液：
分别称取一定量的吡虫啉、吡虫啉胍、吡虫啉脲、吡虫啉烯、6-氯烟酸，用甲醇+水(1+1)配制成2000μg/mL的贮备液。
吡虫啉及代谢物的混合中间液：
吸取一定量的2000μg/ml的贮备液，用甲醇+水(1+1)逐级稀释到100μg/mL和10μg/mL。
莠去津和吡虫啉及其代谢物的混合标准贮备溶液：1.0μg/mL。
吸取一定量的莠去津及吡虫啉及其代谢物混合中间液，用50％：50％甲醇水稀释至1.0μg/mL。
基质空白溶液：
将绿萝和棉花叶片的阴性样品按照样品处理得到的溶液。
1.3试样制备与保存
在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生农药残留含量的变化。取代表性样品100g，用粉碎机粉碎。混匀，均分成两份作为试样，分装，密闭，于-18C保存。
1.4分析步骤
1.4.1提取与净化
称取5g(精确至0.01g)植物叶片(本实验选择室内种植的绿萝叶片和棉花叶片)于50mL离心管(5.8)中，加入乙腈15mL，漩涡混合5min，加入盐析材料，漩涡混匀5min后，室温超声提取3min，于4000r/min离心5min。取上清液1.0mL到10mL离心管，加净化剂150mg无水硫酸钠，50mg C18净化，漩涡混匀30s，上清液过0.22μm有机相微孔滤膜，吸取2.0μL滤液用液相色谱质谱仪测定。
1.4.2液相色谱参考条件
色谱柱：Brownlee SPP C18，2.1×100mm，粒度2.7μm；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；样品室温度：8℃；流动相：A为0.1％(体积分数)甲酸水溶液，B为乙腈。梯度洗脱。流动相梯度洗脱程序见表1。
表1流动相的梯度洗脱程序
时间 流速mL/min A相(水相)0.1％甲酸 B相：乙腈
0 0.4 95 5
2 0.4 95 5
8 0.4 5 95
9 0.4 5 95
10 0.4 95 5
12 0.4 95 5
1.4.2质谱分析条件
电离方式：ESI；正离子模式；检测方式：MRM；反吹干燥气流量100mL/min；热表面诱导去溶剂质谱接口温度320℃；雾化气流量180mL/min；电喷雾锥孔电压5000V；辅助加热气温度400℃，监测离子对、碰撞能量和锥孔电压见表2。
表2 MRM模式下待测组分的质谱参数
2结果
2.1流动相的洗脱程序
通常，液相色谱的流动相由几种不同极性的溶剂组成，通过改变流动相中各溶剂组成的比例改变流动相的极性，使每个流出的组分可在最短时间内实现最佳分离，从而改善被测组分的分离度，提高方法的灵敏度。由于样品提取的溶剂为乙腈，同时为了抑制水中的氢离子电离，改善峰拖尾现象，促进待测物的离子化，本发明选择在水相中加入0.1％的甲酸，同时采用梯度洗脱程序。根据流动相的不同配比情况，考察了待测组分的分离情况，确定了流动相的梯度洗脱程序。见表1所示。
2.2进样体积的选择
液相色谱的进样体积直接影响着方法的灵敏度和分离度。本发明分别考察了2μL、4μL、6μL及8μL的进样体积对待测组分的峰形以及方法灵敏度和分离度的影响。结果表明随着进样体积的增加，各目标物的峰面积增大，灵敏度提高，但是吡虫啉胍的峰拖尾变得严重，同时由于植物叶片的基质相对比较复杂，为了得到更好的分离度，本发明选择进样量为2μL。
2.3流速的选择
液相色谱的流速影响着方法的分离度和出峰时间，本发明在进样体积2μL的条件下，考察了流动相流速分别为0.2、0.3、0.4、0.5mL/min时，待测组分的峰型和保留时间的情况。结果表明，随着流速的增加，待测组分的保留时间不断提前，吡虫啉胍的峰宽变小，峰型变锐，同时液质的流速也不能过大，防止柱压过高，综合考虑色谱柱的长度和待测物的峰型，选择流速为0.4mL/min。
2.4提取剂的选择
样品提取效率的高低，直接影响着测定结果，故提取剂的选择非常重要。本实验选择了乙腈、甲醇、二氯甲烷三种有机溶剂对样品提取效率进行了对比，在三个相同的植物空白样品中，分别加入等量的标准溶液，使得样品中的标准溶液的浓度均为100ng/ml，采用不同的有机溶剂进行提取，结果表明乙腈的回收率最高且比较稳定，效果最好(图2提取剂的选择)。乙腈作为提取溶剂，易于盐析，干扰物质较少，基质对后续的测定影响小，同时与流动相一致，故采用乙腈为提取剂对棉花叶片进行分析测定。
2.5提取剂酸度的选择
在选择乙腈为提取剂后，考察了提取剂的酸度对提取效率的影响，选择乙腈和0.1％甲酸乙腈作为提取剂，加入一定量的标准溶液，考察样品待测组分的回收率。结果表明，酸化后的乙腈提取溶剂对6-氯烟酸的回收率有明显提高，其余组分没有明显影响。因此提取溶剂采用酸化后的乙腈提取，实验同时考察了不同的含量的甲酸对6-氯烟酸的影响，结果表明随着甲酸浓度的提高，6-氯烟酸的回收率并没有明显变化，综合考虑六种待测组分的回收率情况，本发明选择0.1％的甲酸乙腈为提取溶剂。
2.6净化剂种类和用量的选择
QuEChERS方法中常用的净化材料为C18、PSA、GCB，均可用于去除有机酸，色素和金属离子等干扰物。本发明以PSA、C18、GCB及其组合作为不同净化剂，其他预处理步骤相同，净化剂的用量均为50mg，样品加标浓度为0.2μg/mL，以样品加标回收率考察净化效果，测定结果见图3净化剂的选择。
由图3可知，C18净化效果优于PSA和GCB的，C18+GCB+PSA的回收率最低，有文献表明，在2％三乙胺-乙腈的提取条件下，PSA对6-氯烟酸具有强烈的吸附作用，导致添加样品中6氯烟酸回收率为0。因此，本发明在0.1％甲酸-乙腈的提取条件下，考察了C18、PSA、GCB净化材料对待测物回收率的影响。除在空白基质提取液加入一定浓度的标准溶液以及采用LC-MS/MS测定外，其余步骤同3.2节。结果见图4，在0.1％甲酸-乙腈提取条件下，PSA、GCB对6-氯烟酸均有一定的吸附，回收率降低，对其他的待测组分回收率均无明显影响。因此，本发明选择C18为净化剂。
在选择C18为净化剂后，考察了C18的不同用量对待测组分回收率的影响，结果见图4。
2.7混合标准溶液的总离子流图
在仪器的最佳条件下，浓度为50.0ng/mL的标准溶液的总离子流图(EIC)见图550.0ng/mL的标准溶液的总离子流图所示。
2.8工作曲线的配制
吸取一定量的1.0μg/mL莠去津及吡虫啉等混合标准溶液，用初始流动相95％：5％分别稀释至5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500ng/mL。.基质工作曲线的配制
吸取一定量的1.0μg/mL莠去津及吡虫啉等混合标准溶液，用基质空白溶液及溶剂空白溶液，分别稀释至5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500ng/mL。
以流动相为基质的工作曲线图见图6-烟酸的工作曲线图；
图7吡虫啉胍的工作曲线图。
图8吡虫啉的工作曲线图。
图9吡虫啉脲的工作曲线图。
图10吡虫啉烯的工作曲线图。
图11吡虫啉烯的工作曲线图所示。
2.9方法的检出限及线性方程
表3方法的检出限、定量限、线性范围和线性方程。
/>
基质效应(ME)是影响定量准确度的关键因素之一，会对目标化合物的准确定量造成较大影响，在建立分析方法之前须对待测物进行基质效应的评估，并采取有效措施进行消除或补偿，以提高分析方法的可靠性。目前ME的评价方法常以基质标准曲线的斜率与溶剂标准曲线的斜率之比进行评估,当0.8≤ME≤1.2时为无明显基质效应，ME<0.8时为基质抑制效应，ME>1.2时为基质增强效应。
2.10方法的回收率和精密度
本方法的添加浓度和回收率结果见表4。
表4样品的加标回收率和精密度(n＝7)
/>
3本发明建立了植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物残留的串联三重四级杆液相色谱质谱的分析方法。基于QuEChERS方法进行前处理，优化了QuEChERS提取剂类型、净化剂种类和用量。从流动相的梯度洗脱程序、进样体积和流速入手，优化了液相色谱条件，在有效去除基质中杂质干扰的基础上，采用HPLC-MS/MS对样品进行定量分析，验证了方法的线性范围、线性方程、检出限、定量限、加标回收率及相对标准偏差(RSD)等性能参数，同时考察了方法的基体效应。该方法的三个水平的添加回收率在91.1％～102.7％之间，RSD为3.3％～11.7％之间。线性范围为5～500.00ng/mL。该方法具有操作简便、净化效果好、回收率高、灵敏度高等优点，可为东北黑土地农业作物和植物样品的农药莠去津、吡虫啉及其代谢物残留的监测提供理论依据和技术支撑。
在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上；术语“上”、“下”、“左”、“右”、“内”、“外”、“前端”、“后端”、“头部”、“尾部”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”、“第三”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法，其特征在于，吡虫啉的代谢物为吡虫啉胍、吡虫啉脲、吡虫啉烯、6-氯烟酸；所述测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法包括：
利用QuEChERS方法，对植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物，残留测定过程中的各种影响因素进行分析；并结合HPLC-MS-MS法对所述莠去津、吡虫啉及其代谢物的含量进行检测；
所述测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法具体包括：
步骤一，提取与净化：称取植物叶片于离心管中，加入乙腈，漩涡混合，加入盐析材料，漩涡混匀后，室温超声提取，离心；取上清液到离心管，加净化剂无水硫酸钠，C18净化，漩涡混匀，上清液过有机相微孔滤膜，吸取滤液用液相色谱质谱仪测定；
步骤二，液相色谱参考条件：色谱柱：Brownlee SPP C18，2.1×100mm，粒度2.7μm；柱温：30℃；流速：0.4mL/min；样品室温度：8℃；流动相：A为0.1％(体积分数)甲酸水溶液，B为乙腈；利用流动相梯度洗脱程序进行梯度洗脱；
所述步骤二中，流动相梯度洗脱程序如下：
流动相梯度洗脱程序如下：
步骤三，质谱分析条件：电离方式：ESI；正离子模式；检测方式：MRM；反吹干燥气流量100mL/min；热表面诱导去溶剂。
2.如权利要求1所述的测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法，其特征在于，所述步骤一中，漩涡混匀后，室温超声提取3min，于4000r/min离心5min；取上清液1.0mL到10mL离心管，加净化剂150mg无水硫酸钠，50mg C 18净化，漩涡混匀30s，上清液过0.22μm有机相微孔滤膜，吸取2.0μL滤液用液相色谱质谱仪测定。
3.如权利要求1所述的测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法，其特征在于，所述步骤一进行前，需进行：
莠去津标准溶液配置：
吸取100μL的100μg/mL莠去津贮备液，用体积比为1:1的甲醇+水配制成10μg/mL的标准溶液；
吡虫啉及代谢物的混合贮备液：
分别称取一定量的吡虫啉、吡虫啉胍、吡虫啉脲、吡虫啉烯、6-氯烟酸，体积比为1：1的甲醇+水配制成2000μg/mL的贮备液；
吡虫啉及代谢物的混合中间液：
吸取一定量的2000μg/mL的贮备液，体积比为1：1的甲醇+水逐级稀释到100μg/mL和10μg/mL；
莠去津和吡虫啉及其代谢物的混合标准贮备溶液：1.0μg/mL；
吸取一定量的莠去津及吡虫啉及其代谢物混合中间液，用50％：50％甲醇水稀释至1.0μg/mL；
基质空白溶液：
将绿萝和棉花叶片的阴性样品按照样品处理得到的溶液。
4.如权利要求1所述的测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法，其特征在于，所述步骤一进行前，还需进行：
试样制备与保存：取代表性样品100g，用粉碎机粉碎；混匀，均分成两份作为试样，分装，密闭，于-18C保存。
5.如权利要求1所述的测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法，其特征在于，所述步骤三后，还需进行：工作曲线的配制：
吸取一定量的1.0μg/ml莠去津、吡虫啉及其代谢物混合标准溶液，用初始流动相95％：5％分别稀释至5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500ng/mL。
6.如权利要求1所述的测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法，其特征在于，所述步骤三后，还需进行：基质工作曲线的配制：
吸取一定量的1.0μg/ml莠去津、吡虫啉及其代谢物混合标准溶液，用基质空白溶液及溶剂空白溶液，分别稀释至5.0、10.0、50.0、100.0、200.0、500ng/mL。
7.如权利要求1所述的测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法，其特征在于，所述HPLC-MS-MS法进行检测的线性方程包括：
莠去津y＝82.55085x+148.4；
吡虫啉y＝21.08769x+155.52；
6-氯烟酸y＝22.70847x-114.01695；
吡虫啉胍y＝106.6x-533.7039；
吡虫啉烯y＝17.6517x-55.16857；
吡虫啉脲y＝58.93802x+138.6。
8.一种如权利要求1～7任意一项所述测定植物叶片中莠去津、吡虫啉及其代谢物的液相色谱质谱法在玉米、高粱、甘蔗水稻、棉花、小麦作物有害物质检测上的应用。
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