CN108519453A - 一种基于同位素稀释-可编辑多反应监测模式的19种苯并咪唑类药物残留量的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明建立了测定乳制品中苯并咪唑类药物及其代谢物残留量的高效液相色谱‑串联四级杆质谱法。试样采用水‑饱和氯化钠溶液‑乙腈溶液提取，乙腈饱和正己烷脱脂净化直接稀释后，经Atlantis T3(4.6mm×100mm，3μm)色谱柱分离，以乙腈‑0.1％甲酸溶液为流动相，采用电喷雾离子源串联质谱，在正离子扫描方式下以可编辑多反应监测(Scheduled MRM)模式检测，同位素内标法定量。结果表明：19种苯并咪唑类药物在0.02～1.0μg/L质量浓度范围内线性关系良好，定量限为0.025μg/kg～4.0μg/kg。在三个加标水平下的平均回收率为81.4％～108.2％％，相对标准偏差为0.4％～9.3％。该方法操作简便，灵敏度高，抗干扰能力强，回收率和重复性良好。

Description

一种基于同位素稀释-可编辑多反应监测模式的19种苯并咪 唑类药物残留量的测定方法
技术领域
本发明属于食品中兽药残留的检测技术领域，具体涉及一种基于同位素稀释-可编辑多反应监测模式的19种苯并咪唑类药物在乳制品中的残留量的测定方法。
背景技术
一杯奶，强壮一个民族。近年来频发的乳与乳制品的质量安全事件引起了人们对乳制品安全的普遍关注，特别是兽药残留问题。乳制品中的兽药残留主要是由于产奶动物使用了兽药后，兽药或其代谢物进入生乳中并由此对消费者带来健康隐患。苯并咪唑类药物是一类高效、低毒的驱虫药，被广泛应用于畜牧养殖业中，常见的主要药物有奥芬达唑、芬苯达唑、阿苯达唑、甲苯咪唑、氟苯咪唑和噻苯哒唑等。大部分苯并咪唑类驱虫药在动物体内会迅速代谢，也有药物如甲苯达唑的代谢率较低，主要是以药物原形排出。苯并咪唑的母核结构“苯并咪唑核”相当稳定，苯并咪唑类驱虫药在动物体内生物转化时其代谢反应均发生在药物的侧链，主要包括氧化、羰基还原、氨基甲酸酯结构水解等，如噻苯达唑用药后迅速代谢为5-羟基噻苯达唑。阿苯达唑在动物体内的代谢产物有阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜，阿苯达唑亚砜和阿苯达唑-2-氨基砜。有文献报道苯并咪唑类驱虫药中的丁苯达唑、噻苯达唑酯、阿苯达唑、奥芬达唑对妊娠早期绵羊的胎儿有致畸作用。也有资料报道一些苯并咪唑驱虫药的代谢物如亚砜产物、羟化产物仍具有强的抗虫活性，甚至高于药物的原形，这些代谢物还有一定的胚胎毒性。此外大量研究或应用资料显示当高剂量使用或较长时间使用苯并咪唑类药物时,在多种动物体内显示致畸和胚胎毒性,主要为骨胳畸形。鉴于苯并咪唑类驱虫药物有可能引起动物包括人类的致畸和胚胎毒性，我国以及欧盟、美国、日本等国都将苯并咪唑类药物列入限制使用的兽药药物中，并制订出各种苯并咪唑类驱虫药物(包括其某些代谢物)在不同动物体内的最高残留限量MRL。香港地区亦将苯并咪唑类药物列入受限制使用药物名单中。因此，为保障乳制品安全，尤其是孕妇和婴幼儿等敏感群体的健康，促进畜牧养殖业的健康发展，保障广大人民群众的身体健康，乳制品中苯并咪唑类药物的检测，涵盖的药物必须足够多。
国内外已发表的文献有关奶和或奶粉中苯并咪唑类药物的检测，大多只检测一种或其中几种苯并咪唑类药物原药而没检测代谢物，或者只检测其中部分药物及其代谢物，涉及的苯并咪唑类药物面不广。由于苯并咪唑类药物的某些代谢物如亚砜化物、羟化产物等具有强的胚胎毒性，苯并咪唑类驱虫药残留的测定方法必须能够同时测定苯并咪唑类药物及其某些指定检测的代谢物(例如阿苯达唑的砜化物、亚砜化物等)。已颁布的国家标准适用于奶和奶粉检测的是GB/T 22972-2008《牛奶和奶粉中噻苯达唑、阿苯达唑、芬苯达唑、奥芬达唑、苯硫氨酯残留量的测定液相色谱-串联质谱法》，我国农业部第235号公告明确注明奥芬达唑砜为奥芬达唑、芬苯达唑和苯硫氨酯的标志残留物，故检测奥芬达唑、芬苯达唑和苯硫氨酯必须同时检测其代谢物奥芬达唑砜；噻苯达唑和5-羟基噻苯达唑为噻苯达唑的标志残留物，故检测噻苯达唑必须同时检测其代谢物5-羟基噻苯达唑。该标准涉及检测的苯并咪唑类药物较少，涵盖面不全。目前，国内外尚未有关于乳制品中19种苯并咪唑类药物的研究及报道。因此，建立快速准确测定乳制品中19种苯并咪唑类药物残留量的检测方法，用以保障食品安全，尤其是孕妇和婴幼儿等敏感群体的健康，已迫在眉睫。
本专利涉及的药物主要包括：奥芬达唑、芬苯达唑和苯硫氨酯及它们的代谢物奥芬达唑砜，奥苯哒唑，噻苯达唑及其代谢物5-羟基噻苯达唑，三氯苯哒唑及其代谢物三氯苯哒唑酮，阿苯哒唑及其代谢物阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜和阿苯达唑-2-氨基砜，氟苯达唑及其代谢物2-氨基氟苯达唑，甲苯咪唑及其代谢物2-氨基-5-苯甲酰苯并咪唑、羟基甲苯咪唑、噻苯咪唑酯共19种苯并咪唑类药物，涉及的基质包括牛奶和羊奶等液态奶、牛奶粉和羊奶粉等乳制品，本专利的样品提取溶剂水-饱和氯化钠溶液-乙腈尚未见报道过，相比较常用的乙腈和盐酸溶液，在沉淀蛋白的同时还去除了水溶性杂质，净化效果更好。与通常的固相萃取净化步骤繁琐相比较，本专利采用液液萃取法，简便快捷，前处理成本低。另外，本专利还采用稀释法，简化了前处理过程，避免了复杂前处理过程中目标物的损失，减弱了基质效应。本专利在分析过程中引入同位素内标，对于分析全过程中导致目标物损失给予完全的校正，在色谱分离过程中，同位素内标与苯并咪唑类药物的色谱和质谱行为相似，补偿了苯并咪唑类药物由于基质效应的影响引起的响应信号的改变，从而明显提高方法的准确性和重复性，改善了方法的精密度。本专利首次采用可编辑多反应监测模式应用于19种苯并咪唑类药物的检测，可以在不同时间段同时进行多种苯并咪唑类药物残留检测，较传统MRM相比，极大提高了单位检测通量，可有效改善峰型，提高灵敏度、精密度和重现性。本专利操作简便，采用高效液相色谱-串联四极杆质谱结合电喷雾正离子监测等技术，灵敏度高，抗干扰能力强，定性定量准确，能够为乳制品中19种苯并咪唑类药物的监测工作提供技术支持，将有助于增强我国的检测技术，为保护消费者的身体健康、保障食品安全提供技术支持。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下。
一种基于同位素稀释-可编辑多反应监测模式的19种苯并咪唑类药物残留量的测定方法，具体步骤如下：
标准溶液及标准曲线配制，样品基质采用水-饱和氯化钠溶液-乙腈为提取溶剂进行提取，再以乙腈饱和正己烷溶液来进行液液萃取净化，经液相色谱分离，再采用电喷雾离子源串联质谱，在正离子扫描方式下以可编辑多反应监测模式检测，同位素内标法定量；所述的样品基质包括：牛奶、羊奶、牛奶粉或羊奶粉；测定样品基质和标准工作溶液时，如果试样中待测物质的保留时间与标准品一致，定性离子对的相对丰度是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示，应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断试样中存在对应的待测物；
表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 ＞50％ ＞20％～50％ ＞10％～20％ ≤10％
允许的相对偏差 ±20％ ±25％ ±30％ ±50％
空白试验的方法为：除不加试样外，均按上述操作步骤进行；
结果计算和表述方法：用色谱数据处理机或按下式1计算试样中待测物的含量，计算结果须扣除空白值：
式1中：
Xi———试样中目标化合物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c———标准工作溶液中待分析物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
ci———样品中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
A———样品中待分析物的峰面积；
Asi———标准工作溶液中内标物的峰面积；
V———样品定容体积，单位为毫升(mL)；
csi———标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
Ai———样品溶液中内标物的峰面积；
As———标准工作溶液中待分析物的峰面积；
m———样品的称样量，单位为克(g)；
计算结果保留两位有效数字；
线性范围和定量限的确定方法如下：在上述实验条件下，取一系列不同浓度的苯并咪唑类及其代谢物标准溶液，以苯并咪唑类及其代谢物响应峰面积与内标响应峰面积之比对苯并咪唑类及其代谢物的浓度进行线性回归，结果表明，当苯并咪唑类及其代谢物的浓度在0～1.0μg/L范围内，线性关系良好，其回归方程、相关系数见下表3；
表3回归方程、相关系数、检测限和定量限
在本方法的测定条件下，选择空白的乳制品样品，按照3倍信噪比计，苯并咪唑类药物及其代谢物在牛奶和奶粉样品中的检出限分别见表3；按照10倍信噪比计，苯并咪唑类药物及其代谢物在牛奶和奶粉样品中的定量限分别见表3；当样品中的苯并咪唑类及其代谢物浓度超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数；
方法的回收率和精密度：选用未含有苯并咪唑类及其代谢物的样品基质分别进行添加回收率和精密度实验，液态奶的添加水平为1.0、2.0、10.0μg/kg，奶粉的添加水平为5.0、10.0、50.0μg/kg，先对样品进行提取和净化，每个添加水平重复测定6次，计算添加回收率；回收率和精密度结果见下表4；三个添加水平的平均回收率在81.4％～108.2％之间，相对标准偏差为0.4％～9.3％；表明本方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求；
表4乳制品中苯并咪唑类及其代谢物的加标回收率与精密度(n＝6)
所述的苯并咪唑类药物包括：奥芬达唑、芬苯达唑或苯硫氨酯或它们的代谢物奥芬达唑砜、奥苯哒唑、噻苯达唑或其代谢物5-羟基噻苯达唑、三氯苯哒唑或其代谢物三氯苯哒唑酮、阿苯哒唑或其代谢物阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜或阿苯达唑-2-氨基砜、氟苯达唑或其代谢物2-氨基氟苯达唑、甲苯咪唑或其代谢物2-氨基-5-苯甲酰苯并咪唑、羟基甲苯咪唑或噻苯咪唑酯共19种化合物中的一种或多种。
所述的标准溶液及标准曲线配制过程为：
苯并咪唑类标准储备液：准确称取适量19种苯并咪唑类化合物标准品，用少量DMF溶解，再用甲醇配制成浓度为500μg/mL的标准储备液；
苯并咪唑类同位素内标标准储备液：准确称取适量16种苯并咪唑类同位素内标标准品，用少量DMF溶解，再用甲醇配制成浓度为500μg/mL的标准储备液；
苯并咪唑类混合标准中间液(10mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为10mg/L标准中间液；
苯并咪唑类同位素内标混合标准中间液(10mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类同位素内标标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为10mg/L同位素内标标准中间液；
苯并咪唑类混合标准中间液(0.1mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为0.1mg/L标准中间液；
苯并咪唑类同位素内标混合标准中间液(0.4mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类同位素内标标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为0.4mg/L同位素内标标准中间液；
标准曲线的配制：吸取一定量的标准中间溶液和同位素内标中间溶液，用乙腈-0.1％甲酸溶液(3+7，V/V)配制成质量浓度为0.0、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.4、1.0、ng/ml的标准工作溶液，同位素内标浓度均为0.2ng/ml。
所述的牛奶或羊奶的提取与净化方法为：称取试样4g(精确至0.01g)至50mL的离心管A中，加50μL同位素内标中间溶液(0.4mg/L)，加入10mL饱和氯化钠溶液，涡旋振荡2min,加入15mL乙腈，涡旋振荡2min，超声10min，在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min；上清液转移至另一50mL离心管B中；离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀；吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层；弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡0.5min，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
所述的牛奶粉或羊奶粉的提取与净化方法为：称取试样2.0g(精确至0.01g)至50mL的离心管A中，加25μL同位素内标中间溶液(0.4mg/L)，加入4mL温水(45℃)涡旋振荡至溶解样品完全，加入10mL饱和氯化钠溶液，涡旋振荡2min,加入15mL乙腈，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min；上清液转移至另一50mL离心管B中；离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀；吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层；弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL0.1％甲酸溶液，涡旋振荡0.5min，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
所述的液相色谱条件为：色谱柱：Atlantis T3(4.6mm×100mm，3μm)；流动相：A:0.1％甲酸乙腈溶液+B:0.1％甲酸水溶液,梯度洗脱：0～5min,10％～95％A；5～7min,95％A；流速：0.60mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。
所述的质谱条件为：离子源：电喷雾电离；扫描方式：正离子扫描；监测方式：可编辑多反应监测；气帘气压力：207kpa；雾化气压力：380kpa；辅助加热气压力：414kpa；碰撞气压力：35；喷雾电压：5000V；离子源温度：600℃；苯并咪唑类药物及其代谢物的相关质谱参数见表1：
表1苯并咪唑类药物及其代谢物质谱参数
注：带“*”的离子为定量离子。
本发明具有如下有益效果：
本专利与前人的研究方法的不同之处：前人的研究检测的药物在3种到16种之间，且大多数只检测原药，未检测对应的代谢物，尚未见有19种苯并咪唑类药物及其代谢物的检测；前人的研究多数针对牛奶或者奶粉的检测，鲜见有乳制品中19种苯并咪唑类药物及其代谢物的检测；前人的研究大多采用乙腈-盐酸溶液为提取溶剂，未见采用水-饱和氯化钠溶液-乙腈为提取溶剂；前人的研究采用MCX固相萃取的净化方式，前处理过程中需要一到两次的溶剂浓缩步骤，耗时长，且容易造成被分析物损失，本专利采用液液萃取净化方式，仅用常规的乙腈饱和正己烷溶液进行净化，不但前处理时间短，不需另外购买固相萃取柱，成本更低；前人的研究多采用样品浓缩的方式进行检测，本专利采用稀释法，简化了前处理过程，避免了复杂前处理过程中目标物的损失，减弱了基质效应；本专利的定量限为0.025μg/kg～4.0μg/kg，相比较前人的研究更低；前人研究多采用外标法定量方式，本专利在分析过程中引入同位素内标，对于分析全过程中导致目标物损失给予完全的校正，在色谱分离过程中，补偿了苯并咪唑类药物由于基质效应的影响引起的响应信号的改变，从而明显提高方法的准确性和重复性，改善了方法的精密度；前人的研究多数采用多反应检测模式(MRM)进行检测，本专利首次采用可编辑多反应监测模式(Scheduled MRM)应用于19种苯并咪唑类药物的检测，可以在不同时间段同时进行多种苯并咪唑类药物残留检测，较传统MRM相比，极大提高了单位检测通量，可有效改善峰型，提高灵敏度、精密度和重现性。
附图说明
图1为本发明所述的空白牛奶的总离子流图；
图2为本发明所述的空白牛奶标准添加水平为1.0μg/kg的总离子流图
图3为本发明所述的空白奶粉的总离子流图
图4为为本发明所述的空白奶粉标准添加水平为5.0μg/kg的总离子流图
具体实施方式
为了更清楚说明本发明的技术方案，下面将结合具体实施例和附图对本发明进行详细的说明，其中提到的附图仅仅适用下述实施例，对于本领域普通技术员，还可以根据本发明中提到的方法获得其他附图。但是本发明的保护范围并不限于下述实施例。
实施例1
1材料与方法
1.1材料与试剂
苯并咪唑类药物标准品：奥芬达唑、芬苯达唑、苯硫氨酯、奥芬达唑砜、奥苯哒唑、噻苯达唑、5-羟基噻苯达唑、三氯苯哒唑、三氯苯哒唑酮、阿苯哒唑、阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑-2-氨基砜、氟苯达唑、2-氨基氟苯达唑、甲苯咪唑、2-氨基-5-苯甲酰苯并咪唑、羟基甲苯咪唑、噻苯咪唑酯等19种苯并咪唑类药物纯度均大于95％。德国Dr.E公司；乙腈、甲酸(色谱纯)；N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、正己烷、氯化钠(分析纯)；去离子水由Millipore公司超纯水机制得。
0.1％甲酸溶液：吸取1mL甲酸至1L的容量瓶中，用水定容至刻度，摇匀备用。
饱和氯化钠溶液：称取50g氯化钠(3.2.7)于具塞三角瓶中，加入100mL水，摇匀备用。
1.2仪器与设备
UFLC LC-20A超高效液相色谱仪日本岛津公司；QTRAP 5500QTRAP三重四极杆串联质谱仪配电喷雾离子源美国Sciex公司；涡旋振荡器德国IKA公司；3-16K型高速离心机德国Sigma公司；超声波振荡器；水平振荡器。
1.3方法
1.3.1标准溶液配制
苯并咪唑类标准储备液：准确称取适量19种苯并咪唑类化合物标准品，用少量DMF溶解，再用甲醇配制成浓度为500μg/mL的标准储备液。
苯并咪唑类同位素内标标准储备液：准确称取适量16种苯并咪唑类同位素内标标准品，用少量DMF溶解，再用甲醇配制成浓度为500μg/mL的标准储备液。
苯并咪唑类混合标准中间液(10mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为10mg/L标准中间液。
苯并咪唑类同位素内标混合标准中间液(10mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类同位素内标标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为10mg/L同位素内标标准中间液。
苯并咪唑类混合标准中间液(0.1mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为0.1mg/L标准中间液。
苯并咪唑类同位素内标混合标准中间液(0.4mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类同位素内标标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为0.4mg/L同位素内标标准中间液。
标准曲线的配制：吸取一定量的标准中间溶液和同位素内标中间溶液，用乙腈-0.1％甲酸溶液(3+7，V/V)配制成质量浓度为0.0、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.4、1.0、ng/ml的标准工作溶液，同位素内标浓度均为0.2ng/ml。
1.3.2样品处理与净化
液态奶(牛奶和羊奶)的提取与净化
称取试样4g(精确至0.01g)至50mL的离心管A中，，加50μL同位素内标中间溶液(0.4mg/L)，加入10mL饱和氯化钠溶液，涡旋振荡2min,加入15mL乙腈，涡旋振荡2min，超声10min，在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min。上清液转移至另一50mL离心管B中。离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀。吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层。弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡0.5min，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
奶粉(牛奶粉和羊奶粉)的提取与净化
称取试样2.0g(精确至0.01g)至50mL的离心管A中，加25μL同位素内标中间溶液(0.4mg/L)，加入4mL温水(45℃)涡旋振荡至溶解样品完全，加入10mL饱和氯化钠溶液，涡旋振荡2min,加入15mL乙腈，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min。上清液转移至另一50mL离心管B中。离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀。吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层。弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡0.5min，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
1.3.3液相色谱条件
色谱柱：Atlantis T3(4.6mm×100mm，3μm)；流动相：A:0.1％甲酸乙腈溶液+B:0.1％甲酸水溶液,梯度洗脱：0～5min,10％～95％A；5～7min,95％A；流速：0.60mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。
1.3.4质谱条件
离子源：电喷雾电离(electrospray ionization，ESI)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：可编辑多反应监测(Scheduled multiple reaction monitoring,SMRM)；气帘气压力：207kpa；雾化气压力：380kpa；辅助加热气压力：414kpa；碰撞气压力：35；喷雾电压：5000V；离子源温度：600℃；苯并咪唑类药物及其代谢物的相关质谱参数见表1。监测离子对、碰撞能量、去簇电压、采集时间和保留时间。
表1 苯并咪唑类药物及其代谢物质谱参数
注：带“*”的离子为定量离子。
1.3.5液相色谱-质谱/质谱测定和确证
按照1.3.3和1.3.4液相色谱测定条件对标准工作溶液及样液等体积参插进样测定,样品中待测物含量应在标准曲线范围之内，如果含量超出标准曲线范围，应进行适当稀释后测定。
按照液相色谱-质谱/质谱条件测定试样和标准工作溶液，如果试样中待测物质的保留时间与标准品一致，定性离子对的相对丰度，是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示，应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断试样中存在对应的待测物。
表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 ＞50％ ＞20％～50％ ＞10％～20％ ≤10％
允许的相对偏差 ±20％ ±25％ ±30％ ±50％
1.3.6空白试验
除不加试样外，均按上述操作步骤进行。
1.3.7结果计算和表述
用色谱数据处理机或按式(1)计算试样中待测物的含量，计算结果须扣除空白值：
式1中：
Xi———试样中目标化合物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c———标准工作溶液中待分析物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
ci———样品中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
A———样品中待分析物的峰面积；
Asi———标准工作溶液中内标物的峰面积；
V———样品定容体积，单位为毫升(mL)；
csi———标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
Ai———样品溶液中内标物的峰面积；
As———标准工作溶液中待分析物的峰面积；
m———样品的称样量，单位为克(g)。
计算结果保留两位有效数字。
2.1线性范围和定量限
在上述实验条件下，取一系列不同浓度的苯并咪唑类及其代谢物标准溶液，以苯并咪唑类及其代谢物响应峰面积与内标响应峰面积之比对苯并咪唑类及其代谢物的浓度进行线性回归，结果表明，当苯并咪唑类及其代谢物的浓度在0～1.0μg/L范围内，线性关系良好，其回归方程、相关系数见表3。
表3 回归方程、相关系数、检测限和定量限
在本方法的测定条件下，选择空白的乳制品样品，按照3倍信噪比计，苯并咪唑类药物及其代谢物在牛奶和奶粉样品中的检出限(LOD)分别见表3，按照10倍信噪比计，苯并咪唑类药物及其代谢物在牛奶和奶粉样品中的定量限分别见表3，空白样品及定量限总离子流图见图1-图4。当样品中的苯并咪唑类及其代谢物浓度超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数。
2.2方法的回收率和精密度
选用未含有苯并咪唑类及其代谢物的液态奶(牛奶、羊奶)和奶粉(羊奶粉和牛奶粉)样品分别进行添加回收率和精密度实验，液态奶的添加水平为1.0、2.0、10.0μg/kg，奶粉的添加水平为5.0、10.0、50.0μg/kg，按1.3节方法进行提取和净化，每个添加水平重复测定6次，计算添加回收率。回收率和精密度结果见表4。三个添加水平的平均回收率在81.4％～108.2％之间，相对标准偏差为0.4％～9.3％。表明本方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求。
表4 乳制品中苯并咪唑类及其代谢物的加标回收率与精密度(n＝6)
实施例2
2.3实际样品的测定
按照本研究所建立的方法对目前市场销售的18份牛奶、15份羊奶、10份羊奶粉和15份牛奶粉样品进行了测定，均没有检出。
综上所述：本专利建立了同位素稀释高效液相色谱-串联质谱同时测定乳制品中的19种苯并咪唑类药物的方法。结果表明采用液液萃取和稀释法净化方式，在一定程度上降低了样品的基质效应；在分析过程中引入同位素内标，对于分析全过程中导致目标物损失给予完全的校正，改善了方法的精密度；采用可编辑多反应监测模式(Scheduled MRM)，极大提高了单位检测通量，可有效改善峰型，提高灵敏度、精密度和重现性。本方法应用于乳制品中苯并咪唑类药物及其代谢物的检测和确证，有较好的灵敏度和精密度。该方法操作简便，成本低，灵敏度高，抗干扰能力强，测定结果准确可靠，适用于液态奶、奶粉等乳制品中苯并咪唑类药物及其代谢物的测定。
上述实施例仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同替换，这些对本发明权利要求进行改进和等同替换后的技术方案，均落入本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种基于同位素稀释-可编辑多反应监测模式的19种苯并咪唑类药物残留量的测定方法，其特征在于具体步骤如下：
标准溶液及标准曲线配制，样品基质采用水-饱和氯化钠溶液-乙腈为提取溶剂进行提取，再以乙腈饱和正己烷溶液来进行液液萃取净化，经液相色谱分离，再采用电喷雾离子源串联质谱，在正离子扫描方式下以可编辑多反应监测模式检测，同位素内标法定量；所述的样品基质包括：牛奶、羊奶、牛奶粉或羊奶粉；测定样品基质和标准工作溶液时，如果试样中待测物质的保留时间与标准品一致，定性离子对的相对丰度是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示，应当与浓度相当标准工作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表2规定的范围，则可判断试样中存在对应的待测物；
表2 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度 ＞50％ ＞20％～50％ ＞10％～20％ ≤10％ 允许的相对偏差 ±20％ ±25％ ±30％ ±50％
空白试验的方法为：除不加试样外，均按上述操作步骤进行；
结果计算和表述方法：用色谱数据处理机或按下式1计算试样中待测物的含量，计算结果须扣除空白值：
式1中：
Xi———试样中目标化合物的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；
c———标准工作溶液中待分析物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
ci———样品中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
A———样品中待分析物的峰面积；
Asi———标准工作溶液中内标物的峰面积；
V———样品定容体积，单位为毫升(mL)；
csi———标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升(ng/mL)；
Ai———样品溶液中内标物的峰面积；
As———标准工作溶液中待分析物的峰面积；
m———样品的称样量，单位为克(g)；
计算结果保留两位有效数字；
线性范围和定量限的确定方法如下：在上述实验条件下，取一系列不同浓度的苯并咪唑类及其代谢物标准溶液，以苯并咪唑类及其代谢物响应峰面积与内标响应峰面积之比对苯并咪唑类及其代谢物的浓度进行线性回归，结果表明，当苯并咪唑类及其代谢物的浓度在0～1.0μg/L范围内，线性关系良好，其回归方程、相关系数见下表3；
表3 回归方程、相关系数、检测限和定量限
在本方法的测定条件下，选择空白的乳制品样品，按照3倍信噪比计，苯并咪唑类药物及其代谢物在牛奶和奶粉样品中的检出限分别见表3；按照10倍信噪比计，苯并咪唑类药物及其代谢物在牛奶和奶粉样品中的定量限分别见表3；当样品中的苯并咪唑类及其代谢物浓度超过此线性范围时，可适当加大样品的稀释倍数；
方法的回收率和精密度：选用未含有苯并咪唑类及其代谢物的样品基质分别进行添加回收率和精密度实验，液态奶的添加水平为1.0、2.0、10.0μg/kg，奶粉的添加水平为5.0、10.0、50.0μg/kg，先对样品进行提取和净化，每个添加水平重复测定6次，计算添加回收率；回收率和精密度结果见下表4；三个添加水平的平均回收率在81.4％～108.2％之间，相对标准偏差为0.4％～9.3％；表明本方法回收率稳定，可满足实际样品的检测要求；
表4 乳制品中苯并咪唑类及其代谢物的加标回收率与精密度(n＝6)
2.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的苯并咪唑类药物包括：奥芬达唑、芬苯达唑或苯硫氨酯或它们的代谢物奥芬达唑砜、奥苯哒唑、噻苯达唑或其代谢物5-羟基噻苯达唑、三氯苯哒唑或其代谢物三氯苯哒唑酮、阿苯哒唑或其代谢物阿苯达唑砜、阿苯达唑亚砜或阿苯达唑-2-氨基砜、氟苯达唑或其代谢物2-氨基氟苯达唑、甲苯咪唑或其代谢物2-氨基-5-苯甲酰苯并咪唑、羟基甲苯咪唑或噻苯咪唑酯共19种化合物中的一种或多种。
3.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述的标准溶液及标准曲线配制过程为：
苯并咪唑类标准储备液：准确称取适量19种苯并咪唑类化合物标准品，用少量DMF溶解，再用甲醇配制成浓度为500μg/mL的标准储备液；
苯并咪唑类同位素内标标准储备液：准确称取适量16种苯并咪唑类同位素内标标准品，用少量DMF溶解，再用甲醇配制成浓度为500μg/mL的标准储备液；
苯并咪唑类混合标准中间液(10mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为10mg/L标准中间液；
苯并咪唑类同位素内标混合标准中间液(10mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类同位素内标标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为10mg/L同位素内标标准中间液；
苯并咪唑类混合标准中间液(0.1mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为0.1mg/L标准中间液；
苯并咪唑类同位素内标混合标准中间液(0.4mg/L)：分别吸取适量的苯并咪唑类同位素内标标准储备液至50mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度，配制浓度为0.4mg/L同位素内标标准中间液；
标准曲线的配制：吸取一定量的标准中间溶液和同位素内标中间溶液，用乙腈-0.1％甲酸溶液(3+7，V/V)配制成质量浓度为0.0、0.02、0.04、0.08、0.1、0.2、0.4、1.0、ng/ml的标准工作溶液，同位素内标浓度均为0.2ng/ml。
4.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的牛奶或羊奶的提取与净化方法为：称取试样4g(精确至0.01g)至50mL的离心管A中，加50μL同位素内标中间溶液(0.4mg/L)，加入10mL饱和氯化钠溶液，涡旋振荡2min,加入15mL乙腈，涡旋振荡2min，超声10min，在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min；上清液转移至另一50mL离心管B中；离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀；吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层；弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡0.5min，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
5.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的牛奶粉或羊奶粉的提取与净化方法为：称取试样2.0g(精确至0.01g)至50mL的离心管A中，加25μL同位素内标中间溶液(0.4mg/L)，加入4mL温水(45℃)涡旋振荡至溶解样品完全，加入10mL饱和氯化钠溶液，涡旋振荡2min,加入15mL乙腈，涡旋振荡2min,超声10min,在水平振荡器上振荡30min，提取液以10000r/min离心10min；上清液转移至另一50mL离心管B中；离心管A中加入13mL乙腈重复提取一次，10000r/min离心10min，上清液合并至离心管B中，用乙腈定容至30mL刻度，摇匀；吸取1mL样品提取液至15mL试管中，加入3mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30s，3500r/min离心5min分层；弃去上层正己烷，吸取0.3mL净化后的样品提取液至1.5mL离心管中，再加入0.7mL 0.1％甲酸溶液，涡旋振荡0.5min，以10000r/min离心5min，吸取中间澄清液转移至进样瓶中，供液相色谱-质谱/质谱仪测定。
6.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的液相色谱条件为：色谱柱：Atlantis T3(4.6mm×100mm，3μm)；流动相：A:0.1％甲酸乙腈溶液+B:0.1％甲酸水溶液,梯度洗脱：0～5min,10％～95％A；5～7min,95％A；流速：0.60mL/min；柱温：40℃；进样量：10μL。
7.如权利要求1所述的测定方法，其特征在于，所述的质谱条件为：离子源：电喷雾电离；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测；气帘气压力：207kpa；雾化气压力：380kpa；辅助加热气压力：414kpa；碰撞气压力：35；喷雾电压：5000V；离子源温度：600℃；苯并咪唑类药物及其代谢物的相关质谱参数见表1：
表1 苯并咪唑类药物及其代谢物质谱参数
注：带“*”的离子为定量离子。
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