CN106680391B - 一种牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测方法 - Google Patents

一种牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测方法，对牛奶样品处理，使用混合酸流动相进行洗脱，使双氯芬酸钠及内标托芬那酸在色谱柱上分离，进行串联质谱检测，依据标准曲线求得牛奶样品中双氯芬酸钠的含量。该方法样品前处理简单，检测限可达0.03μg/kg，定量限为0.05μg/kg，回收率在70‑120%之间，批内和批间变异系数均小于25%，结果准确可靠，可满足牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测要求。

Description

一种牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测方法
技术领域
本发明属于食品中药物残留检测技术领域，具体地，涉及一种牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测方法。
背景技术
双氯芬酸钠（diclofenac sodium，CAS 15307-79-6）作为苯乙酸类衍生物，系非甾体抗炎镇痛药，双氯芬酸钠在欧盟已被批准用于猪和牛，推荐剂量为2.5 mg/kg，肌内注射，推荐治疗周期为1～3 d。欧盟规定（2009）双氯芬酸钠在牛和猪可食性组织中的双氯芬酸钠残留标识物为双氯芬酸，肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中的残留限量（MRLs）分别5、1、5和10 μg/kg；牛奶中的残留标识物亦为双氯芬酸，MRL为0.1 μg/kg。
动物可食性组织中双氯芬酸钠的残留检测，目前报道的比较多。康永锋等以酸化后的乙醇为提取剂，采用超声波-微波辅助提取，硅藻土柱净化，建立了羊肉组织和鲫鱼中双氯芬酸钠等4中非甾体抗炎药残留的HPLC-UV检测方法，定量限为15-30 μg/kg。王雅琴（卜仕金），以及王文艳等均以萘普生为内标，建立了猪可食性组织中双氯芬酸钠的LC-ESI--MS/MS的检测方法，定量限均为0.5 μg/kg。Deng A等采用GC-MS检测水中双氯酚酸钠的残留量。蒲纯、Deng A、Saini M等分别采用酶联免疫吸附分析法，测定水及动物尸体中双氯芬酸钠的药物残留。
Rau S等采用反射干涉频谱法（reflectometric interference spectroscopy）技术，开发了一种光学生物传感器（label-free optical biosensor），用于牛奶中的双氯芬酸钠定量检测，检测限可达0.108 μg/kg。Dubreil-Chéneau E等以d4-双氯芬酸钠等为内标，开发了一种用于牛奶中双氯芬酸钠等12种非甾体抗炎药的LC-MS/MS定量检测方法，其中双氯芬酸钠的检测限为0.5 μg/kg。欧盟关于双氯芬酸钠在牛奶中残留限量的文件中，也采用了LC-MS/MS法检测，浓度范围为0.05-5 μg/kg，检测限为0.03 μg/kg，定量限为0.05 μg/kg，但是对于样品的处理方法及检测条件等，未见详细报道。Jedziniak P等以d4-双氯芬酸钠等为内标，以Sep-Pak NH2固相萃取柱(1000 mg, 6 mL)净化提取液，开发了一种用于牛奶中双氯芬酸钠等多种非甾体抗炎药及其代谢物的LC-MS/MS定量检测方法，其中双氯芬酸钠的检测限为0.05 μg/kg，低于欧盟对牛奶中双氯芬酸钠的最大残留限量0.1 μg/kg的要求。
目前，我国农业部兽药评审中心已经批准双氯芬酸钠注射剂在猪上作为解热、镇痛药物的使用，而用于牛的产品正在进一步的研制过程中。双氯芬酸钠作为一种解热镇痛药物在动物中的使用，欧盟是有残留限量的规定的，我国目前尚未有关于双氯芬酸钠在牛奶中的残留限量标准。因此，建立一种快速、准确、检测限低的牛奶中双氯芬酸钠的残留检测方法，对于相关产品的休药期制定以及保证动物源食品安全具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确、快速和简便的测定牛奶中双氯芬酸钠含量的方法。
本发明的目的通过以下技术方案来具体实现：
一种牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测方法，对牛奶样品处理，使用混合酸流动相进行洗脱，使双氯芬酸钠及内标托芬那酸在色谱柱上分离，进行串联质谱检测，依据标准曲线求得牛奶样品中双氯芬酸钠的含量。
进一步的，所述牛奶样品处理方法为：取牛奶样品10 g于50 mL离心管中，加入100μL托芬那酸标准工作溶液，涡旋混合1 min，静置10 min后，加入10 mL乙腈及1 g乙酸铵，涡旋混合1 min，4℃条件下4500 g离心20 min，取上清液7 mL转入10 mL带盖聚丙烯离心管中，于50℃条件下氮气吹干，吹干后加入200 μL体积比1:1的0.1 %甲酸水-0.1 %甲酸乙腈混合液，涡旋振荡30 s，经0.22 μm滤膜过滤。
进一步的，所述流动相为A相：0.1 %甲酸乙腈溶液；B相：0.1 %甲酸水溶液。
进一步的，采用梯度洗脱的方式进行色谱柱分离。
进一步的，色谱分离条件为：流动相流速为0.4 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为20μL。
进一步的，所述串联质谱的检测条件为：离子源为ESI+，喷雾器压力为35 psi，毛细管电压为+4000 V，电子倍增器电压增加值为+500 V，干燥气温度为350 ℃，干燥气流速为10 L/min，进行多离子反应检测。
本发明提供的牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测方法，对牛奶样品处理后，使用混合酸流动相进行梯度洗脱，使双氯芬酸钠和内标托芬那酸在C18色谱柱上分离，采用串联三重四极杆质谱作为检测器，满足检测牛奶中微量双氯芬酸钠的要求。空白牛奶样品中，双氯芬酸钠（DCF）的添加量为0.03 μg/kg时，定量离子的信噪比SNR大于3（按照峰高对峰高计），表明方法的检测限可至0.03 μg/kg。空白牛奶中，添加不同量的DCF标准品，回收率在70-120%的范围内，批内和批间变异系数均小于25%。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供的牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测方法，样品前处理简单，采用液相色谱法进行样品分离，洗脱液采用混合酸，串联质谱进行双氯芬酸钠检测，该方法的检测限可达0.03 μg/kg，定量限为 0.05 μg/kg，回收率在70-120%之间，批内和批间变异系数均小于25%，结果准确可靠，可满足牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测要求。
附图说明
图1为双氯芬酸钠和托芬那酸的结构式；
图2为双氯芬酸钠和内标托芬那酸混合标准溶液的分离色谱图；
图3为空白牛奶样品的总离子流图；
图4为空白牛奶样品添加双氯芬酸钠和内标托芬那酸时的总离子流图；
图5为最低检测限时的提取离子图；
图6为定量限时的提取离子图。
具体实施方式
为了更加突出本发明的目的、技术方案及优点，结合以下实施例，对本发明进行进一步说明，但并不因此将本发明限制在实施例范围之内。
实施例1
一种牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测方法，包括下面的步骤：
一、色谱分离和质谱检测条件
色谱柱为Agilent Eclipse Plus C18(50 mm×3.0 mm，1.8 μm)；
流动相：A相：0.1 %甲酸乙腈溶液；B相：0.1 %甲酸水溶液，梯度洗脱。梯度洗脱程序见表1。流速0.4 mL/min，柱温40℃，进样量20 μL。
表1 梯度洗脱程序
离子源为ESI+，喷雾器压力为35 psi，毛细管电压为+4000 V，电子倍增器电压增加值为+500 V，干燥气温度为350 ℃，干燥气流速为10 L/min，进行多离子反应检测，具体参数见表2。
表2 化合物MRM参数及特征离子对
注：*为定量离子。
二、标准曲线的建立
分别取空白牛奶样品（10.0±0.05）g，于50 mL离心管中，分别加入3、5、10、20、50、100、200和500 ng/mL的双氯芬酸钠系列标准工作溶液100 μL，再加入100 μL托芬那酸工作溶液，涡旋混合1 min，静置10 min，后加入10 mL乙腈及1 g乙酸铵，涡旋混合1 min，4℃条件下4500 g离心20 min。
取上清液7 mL转入10 mL带盖聚丙烯离心管中，于50℃条件下氮气吹干。吹干后加入200 μL 体积比1:1的0.1 %甲酸水-0.1%甲酸乙腈混合液，涡旋振荡30 s，经孔径为0.22μm滤膜过滤后，进行液相色谱-串联质谱分析。
以双氯芬酸钠定量离子色谱峰面积对托芬那酸（内标）定量离子色谱峰面积的比值为纵坐标，空白试料加标后被测物质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。求得的回归方程为Y = 1.6683X - 0.074；相关系数R2= 0.9992；线性范围为0.05 μg/kg- 5 μg/kg。
三、牛奶样品的提取与净化
提取：取空白奶样（10.0±0.05）g于50 mL离心管中，加入100 μL托芬那酸标准工作溶液，涡旋混合1 min，静置10 min，后加入10 mL乙腈及1 g乙酸铵，涡旋混合1 min， 4℃条件下4500 g离心20 min。
净化：取上清液7 mL转入10 mL带盖聚丙烯离心管中，于50℃条件下氮气吹干。吹干后加入200 μL 体积比1:1的0.1 %甲酸水-0.1%甲酸乙腈混合液，涡旋振荡30 s，经孔径为0.22 μm滤膜过滤后，进行液相色谱-串联质谱分析。
四、检测限和定量限
检测限
添加浓度为3 ng/mL的双氯芬酸钠标准工作溶液100 μL及浓度为50 ng/mL的托芬那酸标准工作溶液100 μL于（10.0 ± 0.05）g空白奶样中，照步骤三所述的方法处理样品，按照步骤一中方法上机检测。
实验结果：空白牛奶中，当双氯芬酸钠的添加量为0.03 μg/kg时，按照前述方法提取、净化后测定，双氯芬酸钠定量离子的信噪比SNR均大于3（按照峰高对峰高计），表明方法的检测限可至0.03 μg/kg。
定量限
添加浓度为5 ng/mL的双氯芬酸钠标准工作溶液100 μL及浓度为50 ng/mL的托芬那酸标准工作溶液100 μL于（10.0 ± 0.05）g空白奶样中，照步骤三所述的方法处理样品，按照步骤一中方法上机检测。
实验结果：空白牛奶中，当双氯芬酸钠的添加量为0.05 μg/kg时，按照前述方法提取、净化后测定，双氯芬酸钠定量离子的信噪比SNR均大于10（按照峰高对峰高计），表明方法的定量限可至0.05 μg/kg。
五、添加回收和精密度实验
准确称取空白牛奶样品各10 g，分别添加浓度为5、50和500 ng/mL的双氯芬酸钠标准工作液各100 μL，以及托芬那酸标准工作溶液100 μL，制得双氯芬酸钠在牛奶中的浓度分别为0.05、0.5和5 μg/kg的空白添加样品。
按照步骤三所述方法处理样品，每批次内同一浓度做5次平行试验，进行3次重复。按照步骤一所述方法上机检测，计算相对回收率及批内和批间变异系数。
实验结果：空白牛奶样品中，添加不同量的双氯芬酸钠，回收率均在70-120%之间，批内和批间的变异系数均小于25%。结果见表3和表4。
表 3 牛奶中双氯芬酸钠的添加回收率试验结果
表4 牛奶中双氯芬酸钠检测的精密度试验结果
。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种牛奶中双氯芬酸钠残留量的检测方法，其特征在于，对牛奶样品处理，使用混合酸流动相进行洗脱，使双氯芬酸钠及内标托芬那酸在色谱柱上分离，进行串联质谱检测，依据标准曲线求得牛奶样品中双氯芬酸钠的含量；
所述牛奶样品处理方法为：取牛奶样品10 g于50 mL离心管中，加入100 μL托芬那酸标准工作溶液，涡旋混合1 min，静置10 min后，加入10 mL乙腈及1 g乙酸铵，涡旋混合1 min，4℃条件下4500 g离心20 min，取上清液7 mL转入10 mL带盖聚丙烯离心管中，于50℃条件下氮气吹干，吹干后加入200 μL体积比1:1的0.1 %甲酸水-0.1%甲酸乙腈混合液，涡旋振荡30 s，经0.22 μm滤膜过滤；
所述流动相为A相：0.1 %甲酸乙腈溶液；B相：0.1 %甲酸水溶液；
色谱柱为C18柱，采用梯度洗脱的方式进行色谱柱分离，具体为：0 min，流动相A比例10%，流动相B比例90%；8 min，流动相A比例90%，流动相B比例10%；10 min，流动相A比例90%，流动相B比例10%；11 min，流动相A比例10%，流动相B比例90%；流动相流速为0.4 mL/min，柱温为40 ℃，进样量为20 μL；
所述串联质谱的检测条件为：离子源为ESI+，喷雾器压力为35 psi，毛细管电压为+4000 V，电子倍增器电压增加值为+500 V，干燥气温度为350 ℃，干燥气流速为10 L/min，进行多离子反应检测。
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